Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

في فيفو الكم من دوران البروتين في الشيخوخة C. Elegans باستخدام Dendra2 قابلة للفوتونات

Published: June 13, 2020 doi: 10.3791/61196
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology im Forschungsverbund, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Department of Biology and Chemistry, University of Bremen

Summary

هنا هو بروتوكول لرصد تدهور البروتين huntingtin تنصهر على الفلوروفور Dendra2 القابلة للفوتونات.

Abstract

يتم تصنيع البروتينات وتحللها باستمرار داخل الخلية للحفاظ على التوازن. القدرة على رصد تدهور البروتين من الفائدة هو المفتاح لفهم دورة حياتها، ولكن أيضا للكشف عن الاختلالات في شبكة بروتيوستاسيس. هذه الطريقة تبين كيفية تتبع تدهور البروتين المسبب للمرض huntingtin. يتم التعبير عن نسختين من huntingtin تنصهر إلى Dendra2 في الجهاز العصبي C. elegans: نسخة فسيولوجية أو واحدة مع امتداد موسع وممرض من الجلوتامين. Dendra2 هو بروتين فلوري قابل للفوتونات؛ بناء على الأشعة فوق البنفسجية قصيرة (UV) نبض الإشعاع، Dendra2 تبديل أطيافها الإثارة / الانبعاث من الأخضر إلى الأحمر. على غرار تجربة مطاردة النبض، يمكن رصد دوران Dendra2 الحمراء المحولة وتحديدها كميا، بغض النظر عن التداخل من الناحية الحديثة التي تم تصنيعها من نوع Green-Dendra2. باستخدام المجهر القائم على confocal ونظرا للشفافية البصرية من C. elegans، فمن الممكن لرصد وقياس تدهور هنتتين ديندرا2 في كائن حي ، والشيخوخة. يتم تدهور جزئيا هنتبينين العصبي-Dendra2 بعد فترة وجيزة من التحويل وتطهيرها أكثر مع مرور الوقت. النظم التي تتحكم في التدهور هي نقص في وجود هنتتينين متحولة والمزيد من ضعف مع الشيخوخة. الأنواع الفرعية العصبية داخل الجهاز العصبي نفسه يحمل قدرات دوران مختلفة ل huntingtin-Dendra2. عموما، رصد أي بروتين الفائدة تنصهر إلى Dendra2 يمكن أن توفر معلومات هامة ليس فقط على تدهورها واللاعبين من شبكة proteostasis المعنية، ولكن أيضا على موقعها، والاتجار بها، والنقل.

Introduction

البروتيوم للكائن الحي هو تجديد نفسها باستمرار. البروتينات هي المتدهورة باستمرار وتوليف وفقا للطلب الفسيولوجي للخلية. يتم القضاء على بعض البروتينات بسرعة، في حين أن البعض الآخر أطول عمرا. إن مراقبة ديناميكيات البروتين هي مهمة أبسط وأكثر دقة وأقل توغلاً عند استخدام البروتينات الفلورية المشفرة وراثياً. FPs شكل autocatalytically ويمكن أن تنصهر على أي بروتين من الفائدة (POI)، ولكن لا تتطلب الإنزيمات لطي أو الحاجة إلى العوامل المساعدة حفظ للأكسجين1. وقد تم مؤخرا تصميم جيل أحدث من FPs للتبديل لون عند التشعيع مع نبضة ضوء من الطول الموجي المحدد. هذه FPs القابلة للتكف عن (PAFPs) تسمح لوضع العلامات وتتبع POIs، أو العضيات أو الخلايا التي يقيمون فيها، ودراسة المعلمات الكمية و/ أو النوعية الخاصة بهم2. تتيح أجهزة FPs إمكانية تتبع حركة أي POI ، واتجاهها ، ومعدل الحركة ، ومعامل الانتشار ، والمتنقلة مقابل الكسور غير المتحركة ، والوقت الذي تتواجد فيه في مقصورة خلوية واحدة ، وكذلك معدل دورانها. بالنسبة لعضيات محددة ، يمكن تحديد الحركة والنقل ، أو الانشطار وأحداث الانصهار. بالنسبة لنوع خلية معين، يمكن تأسيس موضع الخلية ومعدل الانقسام والحجم والشكل. والأهم من ذلك أن استخدام PAFPs يسمح بالتتبع دون تصور مستمر ودون تدخل من أي مسبار مُنَسَك حديثاً. وقد استخدمت الدراسات في كل من الخلايا والكائنات الحية بأكملها بنجاح PAFPs لمعالجة المسائل البيولوجية في الجسم الحي، مثل تطور السرطان والنقائل، والتجمع أو تفكيك الهيكل الخلوي، والتفاعلات الحمض النووي الريبي/البروتين3. في هذه المخطوطة، يتم استخدام المجهر الخفيف وPAFPs للكشف عن معدلات دوران البروتينات المعرضة للتجميع huntingtin (HTT) في الجسم الحي في نموذج C. elegans من الأمراض العصبية.

البروتوكول الموصوف هنا يحدد كميّاً استقرار وتدهور البروتين الإنصهار huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 هو الجيل الثاني من أحادية الحروف PAFP4 أن تبديل لا رجعة فيه الانبعاثات / الإثارة أطياف من الأخضر إلى الأحمر استجابة للأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق المرئي، مع زيادة في شدتها تصل إلى 4،000 أضعاف5،6. Huntingtin هو البروتين المسؤول عن التسبب في مرض هنتنغتون (HD) ، وهو اضطراب وراثي وراثي قاتل. Huntingtin exon-1 يحتوي على امتداد الجلوتامين (CAG، Q). عندما يتم التعبير عن البروتين مع أكثر من 39Q، فإنه يخطئ في البروتين متحولة، سامة، و المسببة للأمراض. HTT متحولة عرضة للتجميع ويؤدي إلى موت الخلايا العصبية والانحطاط، إما كالأنواع القلوية القصيرة أو أكبر اميلويدات منظم للغاية7.

الخيطية هو نظام نموذجي لدراسة الشيخوخة والتنكس العصبي بفضل سهولة التلاعب بها ، وطبيعة الأيزوجيني ، وعمرها القصير ، وشفافيتها البصرية8. لدراسة استقرار HTT في الجسم الحي، وأعرب عن بناء الانصهار في الجهاز العصبي من C. elegans. A HTT-D2 transgene التي تحتوي إما على امتداد الفسيولوجية من 25Qs (HTTQ25-D2) أو امتداد المرضية من 97Qs (HTTQ97-D2) هو overexed عموم العصبية في جميع أنحاء حياة الخيطية9. من خلال إخضاع العيش C. elegans إلى نقطة وجيزة ومركزة من الضوء، يتم photoswitched خلية عصبية واحدة ويتم تعقب HTT-D2 تحويلها مع مرور الوقت. لتحديد كمية HTT-D2 المتدهورة، يتم مقارنة الفرق بين الإشارة الحمراء من HTT-D2 المحولة حديثا إلى الإشارة الحمراء المتبقية من HTT-D2 بعد فترة زمنية محددة. ولذلك ، يصبح من الممكن التحقيق في كيفية تدهور huntingtin عندما وجدت في شكلها الموسع والسامة مقارنة بشكلها الفسيولوجية ؛ كيف تستجيب الخلايا العصبية الأمامية أو الخلفية بشكل مختلف لوجود Q97 مقابل Q25 ، خاصة خلال فترات زمنية طويلة ؛ وكيف أن انهيار شبكة البروتيوستاسيس (PN) أثناء الشيخوخة يساهم في الاختلافات في معدلات التدهور. هذه النتائج تصف فقط مجموعة صغيرة من الملاحظات على دوران HTT-D2. ومع ذلك، يمكن معالجة العديد من المسائل البيولوجية المتعلقة بكل من مجال تجميع البروتينات وبروتيوستاسيس بهذا في تطبيق vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. جيل من C. elegans التعبير عن العصبية هنتتين- Dendra2 البروتين الانصهار

  1. استنساخ الجين ترميز POI في اتجاه تعبير نعمة (أي، pPD95_75، أدجين #1494)، عن طريق انزيم تقييد التقليدية هضم10، جيبسون الجمعية11، أو أي طريقة للاختيار. إدراج المروج لدفع التعبير في الأنسجة المطلوبة أو في مرحلة النمو المطلوب. أدخل الفلوروفلوري Dendra2 إما N- أو C-terminally في الإطار مع POI.
  2. توليد ج. elegans نقلة عن بناء الانصهار (على سبيل المثال، عن طريق الحقن المجهري)12.
    ملاحظة: سيبقى البلازميد الذي يحمل جهاز transgene كصفيف خارج الغشاء. التكامل من بناء ليست ضرورية ولكن يمكن أن يؤديها إذا المطلوب13. في هذا البروتوكول، تم microinjected C. elegans مع plasmid تحمل بناء الانصهار huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) تحت سيطرة المروج عموم الخلايا العصبية Prgef-1. تم الحصول على العمود الفقري للتعبير C. elegans من Kreis et al.14، تم الحصول على 1 huntingtin exon مع إما Q25 أو Q97 من Juenemann etal. 15، وتم الحصول على Dendra2 من Hamer etal.

2. السن مطابقة وصيانة C. elegans

  1. العمر المباراة جميع الديدان الخيطية عن طريق مزامنة إما مع محلول هيبوكلوريت القلوية العلاج17 أو عن طريق وضع البيض لمدة 4 ح في 20 درجة مئوية. لزرع البيض، مكان 10 البالغين جرافيد على وسائط النمو الديدان الخيطية بذرة جديدة (NGM) لوحة وترك لمدة 4 ساعة قبل إزالتها. البيض وضعت في هذا الوقت سوف تؤدي إلى الديدان الخيطية المتزامنة.
  2. الاحتفاظ التجريبية C. elegans على وسائط النمو الخيطية (NGM) لوحات بذر مع مصدر الغذاء البكتيري E. القولونية OP50، بعد تربية الخيطية القياسية18.
  3. تنمو الديدان الخيطية في 20 درجة مئوية إلى المرحلة المطلوبة. بالنسبة لهذا البروتوكول، تكون الأعمار المطلوبة هي يومي 4 و10.
    ملاحظة: يمكن تحديد الشباب في اليوم 4 من خلال وجود البيض في السناد وارتفاع حركتهم. عمر يوم 10 الديدان الخيطية هي ما بعد الخصبة، والخضوع لتدهور الأنسجة وانخفاضقاطرة 19.
  4. بالنسبة للنيماتودا في اليوم العاشر، يتم المرور يوميًا بعد مرحلة L4 في اليوم الثالث، بمجرد أن تكون الديدان الخيطية خصبة، لتجنب وجود مجموعة سكانية مختلطة.

3. إعداد الشرائح المجهرية للتصوير

  1. إعداد الشرائح المجهرية في يوم التصوير. في الميكروويف، تذوب أجاروز الصف العام بتركيز 3٪ (ث / الخامس) في DdH2O. اترك لتبرد قليلا.
  2. قطع غيض من ماصة 1 مل وpirate تقريبا 400 ميكرولتر من agarose ذاب. ضع برفق بضع قطرات من agarose على شريحة زجاجية نظيفة ووضع على الفور شريحة أخرى على القمة ، مع التأكد من إنشاء لوحة رقيقة من agarose بين الاثنين. اسمحوا الجافة قبل الانزلاق بلطف أو رفع الشريحة أعلى قبالة.
  3. ضع شرائح لوحة agarose في حاوية مرطبة لمنعها من الجفاف. ويمكن استخدام هذه داخل 2-3 ساعة.
    ملاحظة: تجنب تشكيل فقاعات صغيرة في agarose، كما يمكن أن تكون المحاصرين في داخل الديدان الخيطية.

4. تعريف المعلمات المجهر confocal

ملاحظة: قبل تركيب النيماتودا وحيازة البيانات، حدد كل الإعدادات على برنامج الاستحواذ confocal. يمكن تكييف الإعدادات مع أجهزة التصوير والبرامج التي يتم اختيارها.

  1. افتح برنامج confocal وحدد إعدادات التصوير بالليزر. تعيين مسار الضوء لالإثارة / الانبعاثات للDendra2 الخضراء في 486-553 نانومتر وDendra2 الأحمر في 580-740 نانومتر. ضبط السلطة وكسب كل من القنوات / الليزر وفقا لشدة الفلوروفور. لا تقم بتغيير الكسب الرقمي أو الإزاحة وتعيين الثقب على أنه مفتوح بالكامل.
  2. تحديد إعداد الامتلاك: حدد وضع قناة متسلسلة وقم بتبديل مسار كل إطار. تعيين وضع المسح الضوئي كإطار، وحجم الإطار كـ 1,024 × 1,024، مع خط خطوة من 1. تعيين المتوسط إلى 2، والمتوسط حسب متوسط الأسلوب وطريقة خط أحادي الاتجاه. تعيين عمق بت إلى 8 بت.
  3. حدد إعدادات عمليات الاستحواذ متعددة الأبعاد لتحويل Dendra2. للتحويل والتبييض استخدام 405 نانومتر ليزر الصمام الثنائي تعيين في 60٪ الطاقة. إذا كان متوفرا، وتفعيل تبييض آمنة GaAsP لحماية أجهزة الكشف.
  4. حدد سلسلة زمنية من دورتين، مع فاصل زمني 0.0 مللي في بين، والبدء العادي وإيقاف. ابدأ التبييض بعد المسح 1 من 2 وكرر لـ 30 تكرارًا. وقف التبييض عندما تنخفض الشدة إلى 50٪.
  5. حدد سرعة الاكتساب/البكسل بالسرعة (على سبيل المثال، الحد الأقصى = 12) للتحويل، والسرعة المتوسطة (على سبيل المثال، متوسط = 5) لالتقاط صورة مبكرة.
    ملاحظة: معلمات التبييض المعرفة هنا هي إرشادات. بالنسبة لـ Dendra2 الموسومة POIs الأخرى يجب إنشاء إعدادات طاقة الليزر وتكرارات التبييض والقيم تجريبيًا.

5. تركيب من C. elegans على الشرائح المجهرية

ملاحظة: إذا كان ذلك ممكناً، ضع منظارًا ستيريوًا متصاعدًا قريبًا من إعداد المجهر confocal واركب النيماتودا قبل التصوير.

  1. على الشريحة غطاء الزجاج على الجانب الآخر من لوحة agarose، رسم نافذة مع أربعة مربعات مع علامة دائمة ورقمها.
  2. ماصة 15 ميكرولتر من levamisole في منتصف لوحة agarose. سوف يختلف تركيز levamisole وفقا لعمر الخيطية: عندما التصوير يوم 4 الديدان الخيطية استخدام 2 mM levamisole; عندما التصوير يوم 10 الديدان الخيطية استخدام 0.5 mM levamisole.
  3. نقل أربعة الديدان الخيطية في السائل باستخدام الأسلاك. مع مساعدة من اختيار رمش، نقل بلطف كل نعمة الفردية إلى مربع نافذة. قم بتبطي الرموش بحيث يتم تخفيف أي أثر لـ E. coli OP50 ولا تتداخل خلفيته الفلورية مع الحصول على الإشارة.
  4. انتظر الديدان الخيطية لتتوقف تقريبا عن التحرك ووضع بلطف زلة غطاء على رأس السائل لشل الديدان الخيطية في طبقة ليفاميسول بين وسادة أغاروز وزلة الغطاء.
  5. وضع الشريحة المقلوبة على مرحلة confocal لتصوير النيماتودا.

6. تحويل Dendra2 الخضراء: الحصول على البيانات في وقت الصفر

ملاحظة: تبدأ تجارب مطاردة النبض بتحويل بروتين الانصهار Dendra2 بشكل لا رجعة فيه من الفلوروفهور الأخضر المنبعث إلى الأحمر.

  1. باستخدام العدسة المجهر، حدد موقع الخيطية الأولى مع هدف 20x تحت الفلورس الخضراء. التركيز على الرأس أو الذيل والتبديل إلى وضع confocal.
  2. بدء المسح بالليزر الحية مع الليزر الأزرق 488 نانومتر لتصور Dendra2 الخضراء في قناة EGFP الخضراء (السابقين / م = 486-553 نانومتر). حدد خلية عصبية واحدة واجلبها إلى التركيز. تكبير 3x وزيادة الهدف من شعاع الليزر4.
    ملاحظة: حدد خلية عصبية واحدة لكل نعمة. كل خلية عصبية سوف تشكل عينة واحدة أو نقطة البيانات.
  3. العثور على أقصى مستوى الإسقاط، ووفقا لسطوع الفلوروفور، وزيادة أو إنقاص كسب أو الليزر السلطة للحصول على صورة المشبعة ولكن لا تعريضها من قبل تحديد مؤشر نطاق اللون. بمجرد أن يتم تعريف هذا، إيقاف المسح الضوئي.
    ملاحظة: لا تشع العينة لفترة طويلة جدا أو مع الكثير من السلطة، كما الإثارة مع ضوء 488 نانومتر الأزرق مرئية يمكن أيضا تحويل Dendra2، وإن كان ببطء وأقل كفاءة4.
  4. في البرنامج، افتح علامة التبويب لتحديد المناطق ذات الاهتمام (ROIs) ورسم عائد الاستثمار الأول حول الخلايا العصبية المحددة. حدد منطقة ثانية أكبر من الاهتمام تشمل رأس النيماتودا وتشمل العائد على الاستثمار الأول.
  5. في إعدادات التبييض، حدد لعائد الاستثمار الأول ليتم الحصول عليه، وتبييضه، وتحليله. حدد لعائد الاستثمار الثاني الذي سيتم الحصول عليه وتحليله ولكن ليس ابيض.
  6. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى أقصى حد (أي، بكسل سريع يسكن) وبدء التجربة لتحويل الخلايا العصبية Dendra2 المختارة.
    ملاحظة: بمجرد الانتهاء من التجربة، ستؤدي الصورة المكتسبة إلى صورتين: واحدة قبل التحويل والأخرى بعد التحويل. بالنسبة للقناة الخضراء، يجب أن يكون للصورة الأولى إشارة خضراء أعلى تتضاءل في الصورة الثانية بسبب تحويل Dendra2 الخضراء. بالنسبة للقناة الحمراء، يجب أن تكون الصورة الأولى سلبية ولا تظهر أي إشارة، مع ظهور إشارة حمراء في صورة بعد التحويل. إذا لم تتضاءل الإشارة الخضراء، لم يحدث التحويل، وينبغي تعديل الإعدادات، مثل قوة الليزر 405 أو عدد التكرارات. إذا كان هناك إشارة حمراء في الصورة الأولى، ثم 488 نانومتر الليزر المستخدمة كانت عالية جدا وجزء من Dendra2 الخضراء تم تحويلها بالفعل إلى الأحمر. في هذه الحالة، يجب اختيار الخلايا العصبية / الخيطية الجديدة.
  7. مباشرة بعد التحويل، بدء المسح الحي مع ليزر خضراء 561 نانومتر لتصور Dendra2 في القناة الحمراء (السابقين / م = 580-740 نانومتر). العثور على التركيز وإسقاط الحد الأقصى لكل من الخلايا العصبية المحولة باستخدام مؤشر لون النطاق لتجنب التعرض المفرط.
  8. تعيين سرعة سرعة المسح الضوئي إلى أقل بكسل يسكن سرعة (على سبيل المثال، 5x) والحصول على صورة لقطة من كل من القنوات في دقة أعلى. يتم تعريف هذه الصورة على أنها نقطة زمنية صفر (T0) بعد التحويل.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف سرعة الحصول على الصورة المحولة. ومع ذلك، بمجرد اختيار، هذه السرعة تحتاج إلى البقاء ثابتة في جميع أنحاء جمع البيانات.
  9. حفظ الفحص مع اسم تعريف و / أو رقم متبوعاً تسمية الصفر الوقت (T0).
    ملاحظة: من المستحسن أيضا حفظ صورة تجربة التحويل (الخطوة 6.6) لتوضيح عدم وجود إشارة حمراء قبل التحويل وظهوره بعد ذلك.

7. تصوير Dendra2 الحمراء المحولة للحصول على البيانات في نقطة زمنية ثانية مختارة

  1. لتتبع تدهور Dendra2 مع مرور الوقت، حدد نقطة زمنية ثانية لإعادة صورة نفس الخيط/العصبون. حدد نقطة الوقت الثانية تجريبياً لمعالجة أي مسألة بيولوجية ذات صلة. للبروتوكول الموضح هنا ، يتم تصوير Dendra2 على حد سواء في 2 ح (T2) و 24 ح (T24) تحويل آخر.
    1. في نقطة زمنية مختارة، العثور على نفس الخيطية / الخلايا العصبية مع استخدام العدسة وفلوريسنسي الأحمر.
    2. فتح صورة T0 من الخيطية / الخلايا العصبية كل منها وإعادة تحميل / إعادة استخدام إعدادات الصورة. تأكد من أن إعدادات الامتلاك لللقطة هي نفسها بالضبط عند الحصول على صور T0 و T2 و T24 h.
    3. المسح الحي في القناة الحمراء، وجلب الخلايا العصبية الحمراء المحولة في التركيز. لأن Dendra2 الأحمر يتحلل مع مرور الوقت مؤشر نطاق سوف تظهر إسقاط الحد الأقصى أقل كثافة. لا تقم بتغيير أي بارامترات اقتناء والحصول على لقطة بنفس السرعة (على سبيل المثال، 5x) كصورة أولى.
  2. لتتبع تدهور Dendra2 بعد 4 ح أو أكثر، انقاذ النيماتودا بعد التحويل.
    1. إزالة الشريحة من المجهر مباشرة بعد تحويل وتصوير الديدان الخيطية الأربعة. إزالة بلطف غطاء ومع استخدام قطف الأسلاك، ورفع كل نعمة من لوحة agarose.
    2. ضع كل نعمة على حدة على لوحة NGM تحمل علامات مناسبة وقابلة للتحديد.
    3. بالنسبة للنقطة للمرة الثانية، قم بتركيب النيماتودا مرة أخرى على وسادة agarose جديدة والمضي قدما في تصوير Dendra2 الأحمر المحولة باتباع التعليمات الواردة في القسم 6.

8. تحليل الصورة من Dendra2 تحويلها

ملاحظة: يتم إجراء تحليل تدهور Dendra2 مع فيجي / برنامج ImageJ20.

  1. افتح فيجي ثم اسحب وأسقط الملف .lsm في شريط فيجي. فتح الصورة T0 التي اتخذت بعد التحويل فقط وصورة من نفس الديدان الخيطية التي اتخذت في نقطة زمنية مختارة بعد التحويل (T2 أو T24 ح).
    ملاحظة: لتتبع تدهور البروتين من الفائدة تنصهر إلى Dendra2 فقط القناة الحمراء يحتاج إلى تحليل.
  2. إنشاء معلمات القياس من القائمة: تحليل | تعيين القياسات. حدد وظائف المنطقة والكثافة المتكاملة.
  3. حدد الصورة التي تم الحصول عليها باستخدام القناة الحمراء. حدد أداة تحديد المضلع من شريط فيجي.
  4. تحديد الخلايا العصبية المحولة على الصورة T0 ورسم العائد على الاستثمار من حوله باستخدام أداة التحديد.
    1. لتحديد ملامح الخلايا العصبية بشكل صحيح، وتسليط الضوء على عتبات كثافة عن طريق اختيار من شريط صورة | ضبط | الحد الأدنى. اسحب مؤشر الشريط لتحديد العتبة وتتبع حول هذه المنطقة باستخدام أداة المضلع. لتوليد عائد استثمار دقيق، من الممكن أيضا استخدام كفاف الخلايا العصبية المختارة من القناة الخضراء.
  5. بمجرد إجراء التحديد في نافذة القناة الحمراء، اضغط على تحليل | قياس. ستظهر نافذة منبثقة تسمى النتائج وتتضمن قيم عائد الاستثمار لمنطقة، IntDen، و RawIntDen.
  6. تنفيذ نفس عملية الاختيار والقياس لصورة نقطة الوقت الثاني (T2 أو T24 h).
  7. نسخ القيم التي تم الحصول عليها في برنامج جدول بيانات، مع الحرص على تسجيل القيم بشكل مناسب في T0 بعد التحويل، وعلى T2 أو T24 h بعد التحويل.

9 - حساب نسبة تدهور التحلل من نوع Dendra2

  1. لحساب نسبة التدهور، قم أولاً بتعيين قيمة 1 (أو 100%) إلى الوقت التدهور من نقطة زمنية صفر (أي، بعد التحويل فقط، عندما كل من Dendra2 الحمراء تحويل لا يزال موجودا). ينتج هذا من تقسيم قيمة IntRawDen من T0 في حد ذاته.
  2. لحساب الحد من إشارة كثافة Dendra2 الحمراء مع مرور الوقت، والتدهور، تقسيم قيمة RawIntDen من نقطة الوقت الثاني (على سبيل المثال، T2 أو T24 ح) على قيمة RawIntDen من T0. يجب أن يكون العدد الناتج أقل من 1. ويمكن أيضاً التعبير عن هذه القيم على أنها نسب مئوية، مع تعريف T0 بـ 100%.
  3. كرر المقطع 7 لكل نعمة تحويلها. للحصول على تمثيل رسومي لتدهور Dendra2، رسم رسم بياني مبعثر أو شريطي مع قيم النسبة المئوية أو النسبة لتناقص الفلوريسنس التي تم الحصول عليها في المحور y. تطبيق أي تحليل إحصائي المطلوب وتوضيحه على الرسم البياني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم الحصول على اثنين من سلالات الخيطيات التي تعبر عن جزء البروتين exon-1 huntingtin في الإطار مع البروتين الضوئي Dendra2 عن طريق الحقن المجهري وتم الاحتفاظ بها كمادة خارجية. تم التعبير عن بناء الانصهار في الجهاز العصبي C. elegans كله من التنمية في جميع أنحاء الشيخوخة. هنا، HTT-D2 تحتوي إما على امتداد بوليغلوتامين الفسيولوجية 25 (HTTQ25-D2، الشكل 1أ)أو تكرار مقنن بالكامل ومسببة للأمراض مع 97 الجلوتامين (HTTQ97-D2، الشكل 1ب). في البداية تم اختبار بروتين الانصهار للتأكد من أنه تغير من طيفه الأخضر إلى طيفه الأحمر عند التشعيع فوق البنفسجي. تم بنجاح تحويل HTT-D2 من اللون الأخضر إلى الأحمر بشكل حصري داخل المنطقة المضيئة. وفقا لقوة وتكرار نبض الأشعة فوق البنفسجية، واعتمادا على ض-الطائرة وpenetrance من شعاع الليزر من خلال بشرة من الديدان الخيطية، تم تحويل جزء محدد من HTT-D2، ولكن ليس كلها. ظهرت إشارة حمراء داخل الخلايا العصبية الضوئية المحولة ضوئيًا ، مع التكلس الأخضر غير المحول HTT-D2(الشكل 1C و D). نظرا لدقة أشعة ضوئية ليزر المسح الضوئي كان من الممكن تحويل عائد الاستثمار دقيقة المقابلة لخليوين واحد. قبل التحويل، لم تكن هناك إشارة حمراء مرئية عندما كانت العينة متحمسة في القناة الحمراء(الشكل 2A). عند الأشعة فوق البنفسجية، تضاءلت الإشارة الخضراء مع تحويل HTT-D2 وظهرت إشارة حمراء أخيراً(الشكل 2ب). ثم تدهورت HTT-D2 مع مرور الوقت، مما أدى إلى انخفاض في مستويات الأحمر HTT-D2(الشكل 2C)وزيادة محتملة لإشارة HTT-D2 الخضراء، كما تم توليفها حديثا أكثر البروتين الانصهار. ونظراً لأن انخفاضاً كبيراً كان بارزاً بالفعل عند 2 ساعة بعد التحويل، فقد تم الحفاظ على هذه الفترة الزمنية للكشف عن تحلل HTT-D2 وتحديده كمياً. ومن المهم ملاحظة أن التدهور ليس العملية الوحيدة التي يمكن أن تحدث بعد تحويل HTT-D2. ويمكن الاتجار بHTT-D2 المحولة ونقلها على طول المحاور، مما يؤدي إلى انخفاض في الإشارة الحمراء التي لا تنجم عن إزالة الألغام. ومع ذلك ، مع الإعدادات المستخدمة هنا وعلى مدى فترة زمنية قصيرة من 2 ساعة ، لوحظت أي انتشار للإشارة الحمراء ، وربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن قليلا HTT - D2 تم نقلها من سوما إلى محور عصبي. وعلاوة على ذلك، تحويل وتصوير سوما الخلايا العصبية كاملة واحدة ساعدت على استبعاد آثار نشر HTT-D2 داخل نفس الخلايا العصبية، لأن جميع المقصورات الخلوية كانت يجري تحليلها في وقت واحد. لدراسة كل من الانتشار أو النقل / الاتجار من المستحسن الحصول على صور التكبير السريعة والعالية وتتبع جزء أصغر وربما أكثر من البروتين من الفائدة. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أنه في إطار مجموعة من التجارب، كل يمثل تكرار بيولوجي واحد. تم تصوير خلية عصبية واحدة فقط لكل نعمة ، وتم تصوير كل مرة واحدة في كل جلسة ، ووقع التصوير على مدى ثلاث جلسات ، مما شكل تكرارات فنية. واشترطت الجلسات الثلاث أن تكون الحيوانات متزامنة على ألواح طازجة قبل كل تجربة إما في اليوم الرابع أو العاشر، مما يسمح بفرض أي تقلب بيئي على الديدان الخيطية. كما تُعزى ثلاث جلسات إلى أي تباين ينشأ عن إعداد التصوير (على سبيل المثال، قوة الليزر التي تختلف بسبب اختلاف درجة الحرارة بين التجارب). واعتبرت جميع النسخ البيولوجية المتماثلة التي تم الحصول عليها خلال الدورات الثلاث (ما لا يقل عن 20 حيوانا) عينات فردية واستخدمت لتحديد الأهمية الإحصائية.

بعد التأكد من أن كلا من سلالات HTT-D2 من C. elegans كانت فعالة وإنشاء معلمات التحويل الأمثل ، تم التحقيق في الاختلافات بين دوران بروتين HTT-D2 المسبب للمرض (أي HTTQ97-D2) مقارنة بالسيطرة ذات الصلة الفسيولوجية (HTTQ25-D2). أولاً، لوحظ تدهور HTT-D2 في الخلايا العصبية المختلفة (الشكل 3). ومن المعروف أن الأنواع الفرعية من الخلايا العصبية داخل الجهاز العصبي للنيماتودا تختلف في نشاطها الأيضي ومورفولوجيا21، وربما يحدث فرقا في تدهور وإعادة التوازن من البروتيوم. تمت مقارنة الخلايا العصبية في المنطقة التيل مع تلك التي من الرأس وجدت أن تكون أكثر نشاطا بشكل ملحوظ (الشكل 3أ). وكان هذا الاستنتاج صالح فقط HTTQ25-D2 وليس لHTTQ97-D2 المسببة للأمراض، مما يشير إلى أن PN لم يتمكن من إزالة HTT-D2 تحتوي على امتدادات الجلوتامين أطول في جميع أنحاء الجهاز العصبي (الشكل 3B).

وللتأكد من أن نظام النموذج تصرف كما هو متوقع، أجريت تجارب التحويل على مدى فترة أطول، مما سمح لمسارات تدهور الخلايا بالقضاء على البروتين الذي يهمك بشكل كامل تقريباً (الشكل 4). في الواقع، كان هناك تدهور أكثر بكثير من السيطرة HTTQ25-D2 24 ح بعد التحويل من بعد 2 ح في الخلايا العصبية الرأس، وعلى نطاق واسع أكثر في الخلايا العصبية الذيل(الشكل 4A). مرة أخرى، الخلايا العصبية التيل الخلفي إزالة أكثر نشاطا الأحمر HTT-D2، حتى على مدى فترة زمنية متزايدة. وتم اكتشاف اتجاه مماثل بالنسبة للHTTQ97-D2 المسببة للمرض، مع انخفاض طفيف جداً في إشارة HTT-D2 الحمراء على مدى 24 ساعة. ومع ذلك، لم تتم إزالة HTTQ97-D2 بسهولة مثل HTTQ25-D2، خاصة بعد 24 ساعة. قد يكون من الممكن أن يكون كسر HTTQ97-D2 القابل للذوبان فقط هو الذي تحلل بكفاءة، مما يمثل التناقص الأولي للإشارة الحمراء وانخفاضها المعتدل مع مرور الوقت. الأهم من ذلك، كان هناك نوعان من مجموعات الخلايا العصبية بعد 24 ح: واحد مع ارتفاع معدل التحلل واحد حيث إشارة HTT-D2 الحمراء لم تتدهور على الإطلاق، أو يحتمل أن يزيد حتى(الشكل 4B). زيادة وثبات إشارة ربما تمثل بالفعل تجميعها أو باستمرار تجميع الأنواع التي كانت من الصعب إلى حد كبير لمسح من الخلايا بسبب طبيعتها الأميلويد معبأة بإحكام. هذه التضمينات، موجودة حصرا عندما تمتد الجلوتامين تجاوزت عتبة 40 تكرار، والتي ظهرت مجهريا كما بؤر، وقد افترضت لتتراكم كرواسب التي لا يمكن إزالتها بسهولة22. ومن الممكن أيضا أن الزيادة في إشارة الفلورسنت الأحمر كانت نتيجة ناجمة عن مشاكل تقنية (مثل استخدام بارامترات اقتناء خاطئة، أو أداء دون المستوى لإعداد المجهر، أو عملية استرداد/تركيب خاطئة). عند الحصول على الصور على مدى فترات أطول من الزمن يجب أن تؤخذ هذه المتغيرات في الاعتبار.

وأخيراً، لأن الاضطرابات العصبية مثل بيان HD في حياة البالغين، لوحظ تأثير الشيخوخة على معدل تدهور HTT-D2. أجريت تجارب التحويل في الرأس والمناطق التيل من الشباب (اليوم 4) مقابل النيماتودا القديمة (يوم 10) في كل من سلالات HTT-D2 (الشكل 5). بالنسبة للخلايا العصبية الرأسية، لم يكن هناك تغيير كبير في معدل التدهور بسبب الشيخوخة في عمر كل من HTTQ25-D2 و HTTQ97-D2، ربما لأن HTT-D2 تمت إزالتها بالتساوي طوال حياة كل نعمة. ومع ذلك ، تم تسجيل تغيير كبير جدا عند مقارنة الديدان الخيطية القديمة التي تحتوي إما على امتداد الجلوتامين المرضي أو الفسيولوجي. HTTQ97-D2 لم تتحلل بكفاءة HTTQ25-D2، مما يسلط الضوء على عدم قدرة PN لإزالة الأنواع المجمعة وربما السامة من الصيد في الديدان الخيطية القديمة(الشكل 5أ). مرة أخرى، لوحظ دوران أكثر نشاطا وكبيرة في الخلايا العصبية الذيل. كما هو الحال في الخلايا العصبية الرأس، لم يلاحظ دوران أكثر قوة من HTTQ25-D2 في الخلايا العصبية ذيل من الديدان الخيطية الشباب مقارنة مع الفوج الأكبر سنا، وكان التدهور على قدم المساواة في اليوم 4 واليوم 10. وعلى العكس من ذلك، ظهرت تغيرات كبيرة في معدلات التحلل بين سلالات المكافحة وسلالات HTT-D2 المسببة للأمراض في أيام الشباب 4 من الديدان الخيطية، وأصبحت أكثر أهمية في اليوم العاشر. الأهم من ذلك، كانت الخلايا العصبية التيل قادرة على التعامل مع HTTQ97-D2 السامة في الديدان الخيطية الشباب، مما يدل على أن مختلف آليات PN المصاحبة قد تكون في العمل لإزالة HTT-D2(الشكل. 5B). وبشكل عام، تضاءل نشاط الـ PN مع مرور الوقت، ربما بسبب الآثار الضارة الناجمة عن الشيخوخة ووجود المجاميع.

Figure 1
الشكل 1: أعرب C. elegans huntingtin exon-1 تنصهر إلى Dendra2 في الجهاز العصبي. (أ)الشباب, اليوم 4 C. elegans عموم العصبية التعبير عن هنتتين إكسون-1 التي تحتوي على 25 الجلوتامين, تنصهر إلى Dendra2 في الإثارة الخضراء غير المحولة / دولة الانبعاثات. شريط مقياس = 100 μm. Insets تظهر صورة مكبرة من الرأس (أعلى) والذيل (أسفل) الخلايا العصبية. Inset مقياس شريط = 10 ميكرومتر. (ب) الشباب, اليوم 4 C. elegans عموم العصبية التعبير عن هنتتين إكسون-1 تحتوي على 97 الجلوتامين, تنصهر إلى Dendra2 في استثارة الخضراء unconverted / دولة الانبعاثات. شريط مقياس = 100 ميكرومتر. Insets تظهر صورة مكبرة من الذيل (أعلى) والرأس (أسفل) الخلايا العصبية، ورأس يوم 7 الديدان الخيطية (أقصى اليمين). شريط مقياس Inset = 10 ميكرومتر. تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى بؤر HTTQ97-D2 ، التي تصور مجاميع huntingtin. (C) صورة دمج القناة من HTTQ25-D2 مع تحويل المنطقة الرأس. مربع يمثل جزء من elegans C كله الذي تم uvdiated الأشعة فوق البنفسجية. شريط مقياس = 100 ميكرومتر. Inset يظهر انبعاث Dendra2 في 488 نانومتر (أعلى، أخضر) وعند 561 نانومتر (أسفل، أحمر). شريط مقياس = 10 ميكرومتر (D) صورة دمج القنوات من HTTQ97-D2 مع تحويل المنطقة الرأس. شريط مقياس = 100 μm. مربع يمثل جزء من elegans C كله الذي تم إشعاع الأشعة فوق البنفسجية. Inset يظهر انبعاث Dendra2 في 488 نانومتر (أعلى، أخضر) وعند 561 نانومتر (أسفل، أحمر). شريط مقياس = 10 μm. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: انخفض HTT-D2 الأحمر المحول بمرور الوقت في الخلايا العصبية الفردية. الخلايا العصبية ذيل HTTQ25-D2. يتم عرض اثنين من الخلايا العصبية في وقت واحد وبشكل مستقل photoconconverted. تصور الصور تسلسليا ثلاث نقاط زمنية: (أ) قبل التشعيع (قبل)، (B) مباشرة بعد التشعيع (التحويل)، و (C) 2 ح بعد التشعيع (بعد). اللوحة العلوية (القناة الخضراء) تمثل إشارة HTT-D2 التي تم جمعها عند 486-553 نانومتر اضحة/انبعاث. المنطقة البيضاء ذات الاهتمام ترسم الخلايا العصبية التي تم إشعاعها. تعرض اللوحة الوسطى (القناة الحمراء) إشارة HTT-D2 المحولة التي تم جمعها عند 580-740 نانومتر/الانبعاثات. اللوحة السفلية هي دمج للقنوتين. شريط مقياس = 5 ميكرومتر لجميع الصور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: أظهرت الخلايا العصبية الرأس والذيل معدلات تدهور مختلفة. تُظهر الرسوم البيانية لشريط الأعمدة النسبة المئوية للكثافة الحمراء بالنسبة للقيمة الأولية في وقت التحويل (أي 100٪). تحويل إشارة Dendra2 الحمراء انخفض عموما على مدى الفاصل الزمني 2 ح كما HTT-D2 كان المتدهورة داخل الخلايا العصبية من C. elegans. ضمن النيماتود العصبية العصبية أظهرت معدلات تدهور مختلفة، مع الخلايا العصبية التيل تظهر دوران أكثر نشاطا، ولكن فقط في الديدان الخيطية تحمل امتداد البوليغلوتامين غير باثاث. (أ)القياس الكمي للتدهور في الرأس HTTQ25-D2 مقابل الخلايا العصبية التيل. يعني ± SD، غير مُنْتَدِلَ إثنان الذيل اختبار t. N = 23-28 عينات / الديدان الخيطية صورة لكل منطقة، *P < 0.05. (ب)القياس الكمي للتحلل في الرأس HTTQ97-D2 مقابل الخلايا العصبية التيل. يعني ± SD، غير مُنْتَدِلَ إثنان الذيل اختبار t. N = 23-28 عينات / nematodes صورة لكل منطقة، ns = غير ذات دلالة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: HTTQ97-D2 لم يتم تطهيرها بشكل كبير بعد 24 ساعة. تُظهر الرسوم البيانية لشريط الأعمدة النسبة المئوية للكثافة الحمراء بالنسبة للقيمة الأولية في وقت التحويل (أي 100٪). تم تحويل إشارة Dendra2 الحمراء انخفضت كما HTT-D2 كان المتدهورة داخل الخلايا العصبية من C. elegans. وقد أظهرت HTT-D2 معدلات تدهور مختلفة. حتى على مدى فترات أطول من الزمن بعد التحويل، لا يمكن إزالة HTT-D2 المسببة للأمراض مقارنة مع التحكم الصحي. (أ)القياس الكمي لمعدل التحلل في HTTQ25-D2 عند نقطتين زمنيتين بعد التحويل (2 ح و 24 ح) في كل من الخلايا العصبية الرأس والذيل. يعني ± SD، في اتجاه واحد تحليل التباين (ANOVA). N = 21-28 عينات / الديدان الخيطية صورة لكل وقت / منطقة ، * P < 0.05 ، **** P < 0.0001. (ب)القياس الكمي لمعدل التحلل في HTTQ97-D2 عند نقطتين زمنيتين بعد التحويل (2 ساعة و 24 ساعة) في كل من الخلايا العصبية الرأسية وذيلها. يعني ± SD، في اتجاه واحد تحليل التباين (ANOVA) تليها اختبار Multi Comparison اللاحقة من توكي.  N = 21-28 عينات / nematodes صورة لكل وقت / منطقة ، ن إس = غير ذات دلالة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: لم تتحلل الديدان الخيطية القديمة والشباب التي تعبر عن HTT-D2 المسببة للأمراض من ذلك بشكل فعال. تُظهر الرسوم البيانية لشريط الأعمدة النسبة المئوية للكثافة الحمراء بالنسبة للقيمة الأولية في وقت التحويل (أي 100٪). انخفضت إشارة Dendra2 الحمراء المحولة حيث تم تدهور HTT-D2 داخل الخلايا العصبية. ومع عمر الخيط، كانت قدرته على تحلل HTT-D2 المسببة للأمراض ضعيفة بالإضافة إلى ذلك في جميع أنحاء جهازه العصبي. (أ)القياس الكمي لمعدل التحلل في الخلايا العصبية الرأس من الشباب (اليوم 4) والقديمة (اليوم 10) HTTQ25-D2 الديدان الخيطية مقارنة مع السن مطابقة HTTQ97-D2 الديدان الخيطية. يعني ± SD، في اتجاه واحد تحليل التباين (ANOVA). N = 23-28 عينات / nematodes صورة لكل سلالة / يوم ، **** P < 0.0001. (B) معدل التحلل 2 ح بعد التحويل في الخلايا العصبية ذيل الشباب (يوم 4) والقديمة (يوم 10) HTTQ25-D2 الديدان الخيطية، مقارنة مع السن مطابقة HTTQ97-D2 الديدان الخيطية. يعني ± SD، في اتجاه واحد تحليل التباين (ANOVA) تليها اختبار Multi Comparison اللاحقة من توكي. N = 23-28 عينات / nematodes صورة لكل سلالة / يوم ، * P < 0.05 ، *** P < 0.001 ، **** P < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لفهم وظيفة البروتين من المهم أن نفهم تركيبها، والموقع، والتدهور. مع تطور الرواية ، ومستقرة ، ومشرقة FPs ، تصور ورصد الملوثات العضوية الثابتة أصبحت أسهل وأكثر كفاءة. PAFPs الانصهار أعرب عنها وراثيا مثل Dendra2 هي في وضع فريد لدراسة استقرار POI. عند التعرض للضوء الأرجواني والأزرق، فواصل Dendra2 في مكان محدد داخل ثالوث من الأحماض الأمينية المحفوظة. الفلوروفور يخضع لتغيير هيكلي صغير، مما أدى إلى تحول كامل من الأطياف من الأخضر إلىالأحمر 23. ويسمح هذا التحول بالكشف عن أي POI مرتبط بـ Dendra2 ورصده. في الواقع، هذه الانشاءات الانصهار استخدمت لأول مرة لخلق سلالة مراسل C. elegans لدراسة نظام ubiquitin-proteasome في الجسم الحي16. كما تم توظيف Dendra2 لفهم ضعف الأنواع الفرعية العصبية الانتقائية وقدرتها على التعامل مع بروتينات البوليغلوتامين الموسعة24، أو مراقبة تحريض autophagy في نماذج من مرض الخلايا العصبية الحركية25.

يتم تقديم بروتوكول هنا لرصد في الجسم الحي تدهور huntingtin، وهو بروتين تجميعي مرتبط بالأمراض بطريقة غير باضعة. بعد بنجاح توليد نموذج ج. elegans الخلايا العصبية من HD, التعبير عن HTT-D2 عموم العصبية, تم تحديد كميا معدلات تدهور HTT الموسعة والمسببة للأمراض بالمقارنة مع نظيره الفسيولوجية. ولوحظت اختلافات مذهلة بين الأنواع الفرعية العصبية، وبين النيماتودا الشباب والمسنين، وبين قدرة PN على التعامل مع الأحمال الجلوتامين السامة مع مرور الوقت. ويمكن أيضا أن تطبق هذه التقنية لمتابعة موقع وحركة huntingtin وكذلك مصيرها عندما يتم إدخال الانزعاج إلى PN. يمكن كشف siRNA knockdown من المرافقين الرئيسية أو إدارة المركبات التي تمنع نشاط البروتيم وظيفة وأهمية هذه المكونات في البروتينات المعرضة للتجميع: على سبيل المثال، ما إذا كان PN ينشط العقد المحددة للتعويض عن أوجه القصور26. ويمكن أيضا أن يفسر الآثار الضارة الناجمة عن مرض بالمقارنة مع تلك التي من الشيخوخة العادية.

وعلى الرغم من أنه يمكن معالجة العديد من الأسئلة المختلفة باستخدام هذه التقنية، فإنه بمجرد إنشاء نموذج مرغوب فيه، يجب إنشاء بارامترات تحويل وكشف صحيحة للحصول على بيانات موثوقة. ومن الأهمية بمكان أيضا تحديد إعدادات التحويل التي تسمح بغلة كافية من البروتين المنشط دون الضوبلاخ أو الضوئي ودون تحويل غير مرغوب فيه. وعلاوة على ذلك، فإن كل بروتين تمت دراسته داخل نظام نموذجي محدد، إما في الجسم الحي السابق أو في الجسم الحي، من الضروري أن تحدد تجريبيا فترة زمنية كبيرة بما يكفي للسماح بالتدبير الكمي الدقيق لمعدل التحلل.

Dendra2 يقدم سلسلة من المزايا على PAFPs الأخرى: 1) فمن أحادية اللون ومشرق جدا; 2) لديها نسخة ضوئية عالية التباين وإشارة ضوئية مستقرة؛ 3) يمكن تفعيلها مع phototoxicity منخفضة بواسطة الليزر 488 نانومتر الأزرق، الذي هو جزء من معظم الأجهزة confocal الاجهزة؛ 4) أنه ينضج بكفاءة في 37 درجة مئوية للتطبيق في خلايا الثدييات؛ 5) ليس لديه آثار جانبية سامة عندما أعرب عن فترات طويلة من الوقت23،27؛ و 6) لا يتأثر النظام بالتغيرات في مستويات التعبير بين أو داخل كائن حي أو خلية ، حيث يتم تحديد كمية فقط نسبة إشارة Dendra2 قبل وبعد التحويل. جميع الخصائص المدرجة تجعل من Dendra2 الفلوروفور المثالي لتتبع ديناميات البروتين في الوقت الحقيقي ورصد مصير الخلية.

لسوء الحظ، Dendra2 البروتينات الانصهار تعاني من بعض القيود الشائعة لوضع العلامات البروتين الفلورية. البناء هو نوع من الشيميك غالبا ما يتم التعبير عنه بشكل تجريبي في الأنظمة البيولوجية ، على الرغم من أنه يمكن تأسيس التعبير الداخلي عن طريق الهندسة الجينومية. إن معدل تدهور Dendra2 نفسه يؤثر على تدهور البروتين المستهدف، على الرغم من أنه قد وصف بأنه بروتين مستقر للغاية وطويل العمر27. وعلاوة على ذلك، Dendra2 ليست مناسبة لتتبع البروتينات مع دوران سريع جدا كما أنه قد لا يكون الوقت لنضجها السليم. وأخيراً، فإن أشعة الليزر التي يبلغ طولها 405 نانومتر، والتي هي غير شائعة، مفضلة للتشذّر الضوئي الفعال، على الرغم من أنها أكثر سمية للعينة. في الواقع، يمكن استخدام الضوء الأزرق أقل الضوئية لتصور كل من Dendra2 الخضراء وتحويله عندما يكون الليزر في كثافة عالية. وينبغي أن يوضع في الاعتبار دائماً هذه الميزة الخاصة، لأن التعرض لفترات طويلة سينتج عنه تحويلاً غير مرغوب فيه وقياسات قد تكون خاطئة. وأخيراً، قد يكون من الصعب استخدام Dendra2 في تركيبة مع الفلوروفهور الأخضر أو الأحمر. ومع ذلك، تتوفر العديد من PAFPs المختلفة للتحقيق في ديناميات العديد من البروتينات في وقت واحد.

وقد تم ربط التجارب التي تستخدم Dendra2 وغيرها من PAFPs باسترداد الفلوريسنس بعد التصوير الضوئي (FRAP) وتقنيات وضع العلامات النبضية المشعة. في وضع FRAP من المستحيل التمييز بين البروتينات إعادة الدخول إلى عائد الاستثمار من البروتين الفلورسنت المشكلة حديثا، والرصد المستمر والتصور من العينة ضروري. مع Dendra2، يتم إنشاء اثنين من السكان مميزة بوضوح التي يمكن ملاحظتها بشكل مستقل مع مرور الوقت بحيث استبدال وحديثا synthetized شكل "غير نشط" من Dendra2 الخضراء يمكن تتبعها وكميا16. Dendra2 هو أيضا مسبار مفيد في المجهر فائقة القرار مثل مجموع المجهر الفلورسنت انعكاس داخلي (TIRF)28 وترجمة ضوئية المجهر (بالم)29. في المستقبل القريب مثل هذه التطورات سوف تسمح للتوطين أفضل وتتبع جزيء واحد محتمل من أي POI، مما يسمح للكشف عن الاختلافات أكثر دقة داخل وبين العينات، وتقديم معلومات جديدة في نهاية المطاف عن حياة ومصير أي POI داخل نظام بيولوجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ونحن نعترف DFG (KI-1988/5-1 إلى JK, NeuroCure دكتوراه الزمالة من قبل مجموعة NeuroCure التميز إلى MLP) للتمويل. كما أننا نعترف بمرفق التصوير الأساسي التابع لمعهد أبحاث لايبنتز لعلم الأدوية الجزيئية في برلين (FMP) لتوفيره التصوير. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر ديوغو فيليسيانو الذي أنشأ نظام Dendra2 في المختبر وقدم التعليمات.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH + Co. KG 5210.2 NGM component
Agarose, Universal Grade Bio & Sell GmbH BS20.46.500 Mounting slide component
BD Bacto Peptone BD-Bionsciences 211677 NGM component
Deckgläser-18x18mm Carl Roth GmbH + Co. KG 0657.2 Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 Carl Zeiss AG Objective
Fiji/ImageJ 1.52p NIH Analysis Software
Levamisole Hydrochloride AppliChem GmbH A4341 Anesthetic
LSM710-ConfoCor3 Carl Zeiss AG Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope Leica Camera AG Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2 this paper C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2 this paper C. elegans strain
OP50 Escherichia coli CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OP50 Nematode food source
Sodium Chloride Carl Roth GmbH + Co. KG 3957.2 NGM component
Standard-Objektträger Carl Roth GmbH + Co. KG 0656.1 Glass slides
ZEN2010 B SP1 Carl Zeiss AG Confocal acquisition software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
  2. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
  3. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
  4. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
  5. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  6. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
  7. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
  8. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
  9. Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
  10. Addgene. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd Edition, https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition 45-50 (2020).
  11. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  12. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  13. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
  14. Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  15. Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
  16. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
  19. Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
  22. Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
  23. Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
  24. Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
  25. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
  26. Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
  27. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
  28. Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
  29. Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).

Tags

علم الأحياء، العدد 160، C. elegans، huntingtin، شبكة البروتيوستاسيس، تدهور، Dendra2، تحويل ضوئي، المجهري confocal، فيجي / ImageJ
في فيفو الكم من دوران البروتين في الشيخوخة <em>C. Elegans</em> باستخدام Dendra2 قابلة للفوتونات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In… More

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter