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Biology

In Vivo Quantification du chiffre d’affaires des protéines dans le vieillissement C. Elegans à l’aide de Photoconvertible Dendra2

doi: 10.3791/61196 Published: June 13, 2020

Summary

Présenté ici est un protocole pour surveiller la dégradation de la protéine huntingtine fusionnée au fluorophore photoconvertible Dendra2.

Abstract

Les protéines sont synthétisées et dégradées constamment dans une cellule pour maintenir l’homéostasie. Être capable de surveiller la dégradation d’une protéine d’intérêt est essentiel pour comprendre non seulement son cycle de vie, mais aussi pour découvrir les déséquilibres dans le réseau de protéostase. Cette méthode montre comment suivre la dégradation de la huntingtine protéique causant la maladie. Deux versions de huntingtine fusionnées à Dendra2 sont exprimées dans le système nerveux de C. elegans : une version physiologique ou une avec une étendue étendue et pathogène de glutamines. Dendra2 est une protéine fluorescente photoconvertible; sur une courte impulsion d’irradiation ultraviolette (UV), Dendra2 passe de vert à rouge ses spectres d’excitation/émission. Semblable à une expérience de chasse à l’impulsion, le chiffre d’affaires du red-Dendra2 converti peut être surveillé et quantifié, indépendamment de l’interférence de la nouvelle synthèse verte-Dendra2. À l’aide de la microscopie confocale et de la transparence optique de C. elegans,il est possible de surveiller et de quantifier la dégradation de huntingtin-Dendra2 dans un organisme vivant et vieillissant. La huntingtine neuronale-Dendra2 est partiellement dégradée peu après la conversion et effacée plus loin au fil du temps. Les systèmes contrôlant la dégradation sont déficients en présence de huntingtine mutante et sont encore altérés par le vieillissement. Les sous-types neuronaux du même système nerveux présentent des capacités de rotation différentes pour huntingtin-Dendra2. Dans l’ensemble, la surveillance de toute protéine d’intérêt fusionnée à Dendra2 peut fournir des informations importantes non seulement sur sa dégradation et les acteurs du réseau de protéostase impliqués, mais aussi sur son emplacement, le trafic et le transport.

Introduction

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Le protéome d’un organisme vivant se renouvelle constamment. Les protéines sont continuellement dégradées et synthétisées en fonction de la demande physiologique d’une cellule. Certaines protéines sont rapidement éliminées, tandis que d’autres sont plus longues. La surveillance de la dynamique des protéines est une tâche plus simple, plus précise et moins invasive lors de l’utilisation de protéines fluorescentes génétiquement codées (FP). Les RP se forment automatiquement et peuvent être fusionnés à n’importe quelle protéine d’intérêt (POI), mais n’ont pas besoin d’enzymes pour plier ou ont besoin de cofacteurs sauf pour l’oxygène1. Une nouvelle génération de FP a récemment été conçue pour changer de couleur sur l’irradiation avec une impulsion lumineuse de longueur d’onde déterminée. Ces FPs photoactivables (PAFP) permettent l’étiquetage et le suivi des POI, ou des organites ou des cellules dans lesquelles ils résident, et d’examiner leurs paramètres quantitatifs et/ou qualitatifs2. Les FP permettent de suivre le mouvement, la directionnalité, le taux de locomotion, le coefficient de diffusion, les fractions mobiles par rapport aux fractions immobiles, le temps qu’il réside dans un compartiment cellulaire, ainsi que son taux de rotation. Pour des organites spécifiques, la locomotion et le transport, ou les événements de fission et de fusion peuvent être déterminés. Pour un type de cellule particulier, la position, le taux de division, le volume et la forme d’une cellule peuvent être établis. Surtout, l’utilisation de PAFPs permet le suivi sans visualisation continue et sans interférence à partir d’une sonde nouvellement synthétisée. Des études menées dans des cellules et dans des organismes entiers ont utilisé avec succès des PAFP pour aborder des questions biologiques in vivo, telles que le développement du cancer et de la métastase, l’assemblage ou le démontage du cytosquelette, et les interactions ARN-ADN/protéine3. Dans ce manuscrit, la microscopie légère et les PAFP sont utilisés pour découvrir les taux de rotation de la huntingtine protéique (HTT) à l’agrégation in vivo dans un modèle de C. elegans de la maladie neurodégénérative.

Le protocole décrit ici quantifie la stabilité et la dégradation de la protéine de fusion huntingtine-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 est un PAFP monomériquede deuxième génération qui commute irréversiblement ses spectres d’émission/excitation du vert au rouge en réponse à la lumière bleue UV ou visible, avec une augmentation de son intensité allant jusqu’à 4 000 fois5,6. Huntingtine est la protéine responsable de la cause de la maladie de Huntington (MH), un trouble neurodégénératif héréditaire mortel. Huntingtin exon-1 contient un tronçon de glutamines (CAG, Q). Lorsque la protéine est exprimée avec plus de 39Q, elle se replie mal en une protéine mutante, toxique et pathogène. Mutant HTT est sujette à l’agrégation et conduit à la mort et la dégénérescence des cellules neuronales, soit en tant qu’espèces oligomériques courtes ou comme plus grandes amyloïdes très structurées7.

Le nématode est un système modèle pour étudier le vieillissement et la neurodégénérescence grâce à sa facilité de manipulation, la nature isogénique, la courte durée de vie, et sa transparence optique8. Pour étudier la stabilité de HTT in vivo, une construction de fusion a été exprimée dans le système nerveux de C. elegans. Un transgène HTT-D2 contenant soit un tronçon physiologique de 25Qs (HTTQ25-D2) ou un tronçon pathologique de 97Qs (HTTQ97-D2) est surexprimé pan-neuronal tout au long de la durée de vie du nématode9. En soumettant C. elegans en direct à un point de lumière bref et concentré, un seul neurone est photoswitched et le HTT-D2 converti est suivi au fil du temps. Pour établir la quantité de HTT-D2 dégradée, la différence entre le signal rouge du HTT-D2 fraîchement converti est comparée au signal rouge restant de HTT-D2 après une période déterminée. Par conséquent, il devient possible d’étudier comment la huntingtine est dégradée lorsqu’elle est trouvée sous sa forme étendue et toxique par rapport à sa forme physiologique; comment les neurones antérieurs ou postérieurs réagissent différemment à la présence de Q97 par rapport au Q25, en particulier sur des périodes prolongées; et comment l’effondrement du réseau de protéostase (PN) pendant le vieillissement contribuent aux différences dans les taux de dégradation. Ces résultats ne décrivent qu’un petit ensemble d’observations sur le chiffre d’affaires de HTT-D2. Cependant, beaucoup plus de questions biologiques pertinentes à la fois dans le domaine de l’agrégation des protéines et de la protéostasie peuvent être abordées avec cette application in vivo.

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Protocol

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1. Génération de C. elegans exprimant la protéine de fusion neuronale Huntingtin-Dendra2

  1. Clonez le gène codant le POI dans un vecteur d’expression nématode (c.-à-d. pPD95_75, Addgene #1494), par l’enzyme de restriction traditionnelle digest10, Gibson assembly11, ou n’importe quelle méthode de choix. Insérez un promoteur pour conduire l’expression dans un tissu désiré ou à un stade de développement souhaité. Insérez le fluorophore Dendra2 en phase terminale N ou C avec le POI.
  2. Générer transgénique C. elegans exprimant la construction de fusion (par exemple, par microinjection)12.
    REMARQUE : Le plasmide transportant le transgène restera comme un réseau extrachromosomique. L’intégration de la construction n’est pas nécessaire mais peut être effectuée si désiré13. Dans ce protocole, C. elegans ont été microinjectés avec un plasmide portant la fusion construction huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) sous le contrôle du promoteur pan-neuronal Prgef-1. L’épine dorsale d’expression de C. elegans a été obtenue de Kreis et coll.14, l’exon de huntingtin 1 avec Q25 ou Q97 a été obtenu de Juenemann et al.15, et Dendra2 a été obtenu de Hamer et al.16.

2. Appariement de l’âge et entretien de C. elegans

  1. L’âge correspond à tous les nématodes en synchronisant soit avec le traitement de solution d’hypochloritealcaline 17 ou par la ponte pendant 4 h à 20 °C. Pour la ponte, placer 10 adultes gravid sur une plaque de milieu de croissance de nématodes fraîchement ensemencés (NGM) et laisser reposer 4 h avant d’enlever. Les œufs pondus dans ce laps de temps donneront lieu à des nématodes synchronisés.
  2. Conservez des plaques expérimentales de C. elegans sur des plaques de milieux de croissance de nématode (NGM) ensemencées avec la source bactérienne de nourriture E. coli OP50, suivant l’élevage standard de nématode18.
  3. Cultiver les nématodes à 20 °C jusqu’au stade désiré. Pour ce protocole, les âges requis sont les jours 4 et 10.
    REMARQUE : Les jeunes adultes au jour 4 peuvent être identifiés par la présence d’œufs dans leurs gonades et leur grande mobilité. Les nématodes âgés de 10 jours sont post-fertiles et subissent une détérioration des tissus et un déclin des locomotives19.
  4. Pour le jour 10 nématodes, passage tous les jours après l’étape L4 au jour 3, une fois que les nématodes sont fertiles, pour éviter une population mixte.

3. Préparation de lames de microscopie pour l’imagerie

  1. Préparez les diapositives de microscopie le jour de l’imagerie. Dans un four à micro-ondes, faire fondre l’agarose générale de qualité générale à une concentration de 3 % (w/v) en ddH2O. Laisser refroidir légèrement.
  2. Couper la pointe d’une pipette de 1 mL et aspirate environ 400 μL d’agarose fondue. Placez doucement quelques gouttes d’agarose sur une glissière en verre propre et placez immédiatement une autre diapositive sur le dessus, en veillant à ce qu’un mince tampon d’agarose soit créé entre les deux. Laisser sécher avant de glisser doucement ou de soulever la lame supérieure.
  3. Placez les toboggans de la garniture d’agarose dans un récipient humidifié pour les empêcher de sécher. Ceux-ci peuvent être utilisés dans les 2-3 h.
    REMARQUE : Évitez la formation de petites bulles dans l’agarose, car les nématodes peuvent être emprisonnés à l’intérieur.

4. Définition des paramètres du microscope confocal

REMARQUE : Avant de monter les nématodes et l’acquisition de données, définissez tous les paramètres du logiciel d’acquisition confocal. Les paramètres peuvent être adaptés au matériel d’imagerie et aux logiciels de choix.

  1. Ouvrez le logiciel confocal et définissez les paramètres d’imagerie laser. Définissez le chemin lumineux pour l’excitation/émission pour le Vert Dendra2 à 486-553 nm et pour le rouge Dendra2 à 580-740 nm. Ajuster la puissance et le gain des deux canaux/lasers en fonction de l’intensité du fluorophore. Ne modifiez pas le gain ou le décalage numérique et définissez le trou d’épingle comme étant entièrement ouvert.
  2. Définissez la configuration de l’acquisition : sélectionnez un mode de canal séquentiel et passez une piste de chaque image. Définissez le mode d’analyse comme cadre et la taille du cadre comme 1 024 x 1 024, avec une étape de ligne de 1. Définissez la moyenne à 2, et la moyenne par méthode moyenne et le mode de ligne unidirectionnelle. Réglez la profondeur du bit à 8 bits.
  3. Définissez les paramètres d’acquisitions multidimensionnelles pour la conversion de Dendra2. Pour la conversion et le blanchiment, utilisez le laser à diodes de 405 nm réglé à 60% de puissance énergétique. Si disponible, activez le gaAsP de blanchiment sécuritaire pour protéger les détecteurs.
  4. Sélectionnez une série de temps de deux cycles, avec un intervalle de 0,0 ms entre les deux, et début et arrêt normal. Commencez le blanchiment après l’analyse 1 sur 2 et répétez pour 30 itérations. Arrêtez le blanchiment lorsque l’intensité tombe à 50%.
  5. Définissez la vitesse d’acquisition/pixel habiter aussi rapidement (p. ex., maximum = 12) pour la conversion, et à vitesse moyenne (p. ex., moyenne = 5) pour capturer une image en forme.
    REMARQUE : Les paramètres de blanchiment définis ici sont des lignes directrices. Pour d’autres POI marqués Dendra2, les paramètres de puissance laser et les itérations et valeurs de blanchiment doivent être établis empiriquement.

5. Montage de C. elegans sur des lames de microscopie

REMARQUE : Si possible, placez un stéréomicroscope de montage près de la configuration du microscope confocal et montez les nématodes juste avant l’imagerie.

  1. Sur la glissière de couverture de verre sur le côté opposé de la garniture d’agarose, dessinez une fenêtre avec quatre carrés avec un marqueur permanent et les numérotez.
  2. Pipette 15 μL de levamisole au milieu de la garniture d’agarose. La concentration de levamisole variera selon l’âge du nématode : Lorsque les nématodes du jour 4 utilisent 2 mM de levamisole; lorsque l’imagerie jour 10 nématodes utilisent 0,5 mM levamisole.
  3. Transférer quatre nématodes dans le liquide à l’aide d’un pic à fil. À l’aide d’un pic à cils, déplacez doucement chaque nématode individuel sur un carré de fenêtre. Pivoter le cil de sorte que toute trace de E. coli OP50 est diluée et son fond fluorescent n’interfère pas avec l’acquisition du signal.
  4. Attendez que les nématodes cessent presque de bouger et placez doucement un couvercle sur le liquide pour immobiliser les nématodes dans la couche de levamisole entre le tampon agarose et le glissement de couverture.
  5. Placez la diapositive inversée sur la scène confocale pour imager les nématodes.

6. Conversion du vert Dendra2 : Acquisition de données au moment zéro

REMARQUE : Les expériences de chasse aux impulsions commencent par convertir de façon irréversible la protéine de fusion Dendra2 d’un fluorophore vert émettant à une protéine rouge.

  1. À l’aide de l’oculaire du microscope, localiser le premier nématode avec un objectif de 20x sous fluorescence verte. Concentrez-vous sur la tête ou la queue et passez en mode confocal.
  2. Commencez le balayage laser en direct avec le laser bleu de 488 nm pour visualiser le Dendra2 vert dans le canal vert EGFP (ex/em = 486-553 nm). Sélectionnez un seul neurone et mettant en évidence. Zoomez en 3x et augmentez la cible du faisceau laser4.
    REMARQUE : Sélectionnez un neurone par nématode. Chaque neurone constituera un échantillon ou un point de données.
  3. Trouvez le plan de projection maximal et, selon la luminosité du fluorophore, augmentez ou diminuez la puissance du gain ou du laser pour obtenir une image saturée mais non surexposée identifiable par l’indicateur de la plage de couleurs. Une fois cela défini, arrêtez la numérisation.
    REMARQUE : Ne pas irradier l’échantillon trop longtemps ou avec trop de puissance, car l’excitation avec la lumière bleue visible de 488 nm peut également convertir Dendra2, quoique lentement et moins efficacement4.
  4. Dans le logiciel, ouvrez l’onglet pour sélectionner les régions d’intérêt (ROI) et dessinez un premier retour sur investissement autour du neurone sélectionné. Définissez une deuxième région d’intérêt plus grande englobant la tête du nématode et y compris le premier retour sur investissement.
  5. Dans les paramètres de blanchiment, sélectionnez pour le premier retour sur investissement à acquérir, blanchir et analyser. Sélectionnez pour le deuxième retour sur investissement à acquérir et à analyser, mais non blanchi.
  6. Réglez la vitesse de numérisation au maximum (c.-à-d. l’habitation rapide des pixels) et commencez l’expérience pour convertir les neurones Dendra2 sélectionnés.
    REMARQUE : Une fois l’expérience terminée, l’image acquise se traduira par deux images : une avant et une après la conversion. Pour le canal vert, la première image doit avoir un signal vert plus élevé qui diminue dans la deuxième image en raison de la conversion du Vert Dendra2. Pour le canal rouge, la première image doit être négative et ne montrer aucun signal, avec un signal rouge apparaissant dans l’image après la conversion. Si le signal vert ne diminue pas, la conversion n’a pas eu lieu et les paramètres, tels que la puissance laser 405 ou le nombre d’itérations, doivent être modifiés. S’il y a un signal rouge dans la première image, alors la puissance laser de 488 nm utilisée était trop élevée et une partie du Dendra2 vert a déjà été convertie en rouge. Dans ce cas, un nouveau neurone/nématode doit être sélectionné.
  7. Immédiatement après la conversion, commencez à scanner en direct avec le laser vert 561 nm pour visualiser Dendra2 dans le canal rouge (ex/em = 580-740 nm). Trouvez la mise au point et la projection maximale respective du neurone converti à l’aide de l’indicateur de couleur de plage pour éviter la surexposition.
  8. Réglez rapidement le taux d’analyse à une vitesse d’habitation inférieure de pixel (par exemple, 5x) et obtenez une image instantanée des deux canaux à une résolution plus élevée. Cette image est définie comme point de temps zéro (T0) après conversion.
    REMARQUE : La vitesse d’acquisition de l’image convertie peut être variée. Toutefois, une fois choisie, cette vitesse doit rester constante tout au long de la collecte de données.
  9. Enregistrez l’analyse avec un nom et/ou un numéro identifiable, suivi de l’étiquette time zero (T0).
    REMARQUE : Il est conseillé de sauvegarder également l’image de l’expérience de conversion (étape 6.6) pour illustrer l’absence de signal rouge avant la conversion et son apparence par la suite.

7. Imagerie de Dendra2 rouge converti pour l’acquisition de données à un deuxième point de temps sélectionné

  1. Pour suivre la dégradation de Dendra2 au fil du temps, définissez un deuxième timepoint pour reimager le même nématode/neurone. Sélectionnez le deuxième point de temps expérimentalement pour répondre à toute question biologique pertinente. Pour le protocole décrit ici, Dendra2 est photographié à la fois à 2 h (T2) et 24 h (T24) après la conversion.
    1. Au point de temps sélectionné, trouver le même nématode / neurone avec l’utilisation de l’oculaire et la fluorescence rouge.
    2. Ouvrez l’image T0 du nématode/neurone respectif et rechargez/réutilisez les paramètres de l’image. Assurez-vous que les paramètres d’acquisition de l’instantané sont exactement les mêmes lors de l’acquisition des images T0, T2 et T24 h.
    3. Numérisation en direct dans le canal rouge, mettre le neurone rouge converti au point. Étant donné que le Dendra2 rouge se dégrade au fil du temps, l’indicateur de plage affichera une projection maximale moins intense. Ne modifiez aucun paramètre d’acquisition et obtenez un instantané à la même vitesse (p. ex., 5x) que la première image.
  2. Pour suivre la dégradation de Dendra2 après 4 h ou plus, sauvez les nématodes après la conversion.
    1. Retirez la lame du microscope immédiatement après la conversion et l’imagerie des quatre nématodes. Retirez doucement le couvercle et à l’aide d’un pic, soulevez chaque nématode du tampon agarose.
    2. Placez chaque nématode individuellement sur une plaque NGM bien étiquetée et identifiable.
    3. Pour le deuxième point, montez à nouveau le nématode sur un tampon d’agarose frais et procédez à l’imagerie du Dendra2 rouge converti suivant les instructions de la section 6.

8. Analyse d’image de Dendra2 converti

NOTE: L’analyse de la dégradation de Dendra2 est effectuée avec le logiciel Fidji/ImageJ20.

  1. Ouvrez Fidji et faites glisser et déposez le fichier .lsm dans la barre des Fidji. Ouvrez l’image T0 prise juste après la conversion et l’image du même nématode prise au moment sélectionné après la conversion (T2 ou T24 h).
    REMARQUE : Pour suivre la dégradation de la protéine d’intérêt fusionnée à Dendra2, seul le canal rouge doit être analysé.
  2. Établir les paramètres de mesure à partir du menu : Analyser | Définir les mesures. Sélectionnez les fonctions Zone et Densité intégrée.
  3. Sélectionnez l’image obtenue avec le canal rouge. Sélectionnez l’outil de sélection Polygone dans la barre Fidji.
  4. Identifiez le neurone converti sur l’image T0 et dessinez un retour sur investissement à l’aide de l’outil de sélection.
    1. Pour identifier correctement les contours du neurone, mettez en évidence les seuils d’intensité en sélectionnant dans la barre Image | Ajuster | Seuil. Faites glisser le curseur de la barre pour délimiter le seuil et suivre autour de cette zone à l’application polygone. Pour générer un retour sur investissement précis, il est également possible d’utiliser le contour du neurone sélectionné à partir du canal vert.
  5. Une fois que la sélection a été faite dans la fenêtre du canal rouge, appuyez sur Analyser | Mesure. Une fenêtre contextuelle nommée Résultats s’affiche et inclut les valeurs de retour sur investissement pour Area, IntDenet RawIntDen.
  6. Effectuer le même processus de sélection et de mesure pour l’image du deuxième point de temps (T2 ou T24 h).
  7. Copiez les valeurs obtenues dans un logiciel de feuille de calcul, en prenant soin d’enregistrer correctement les valeurs à T0 après la conversion, et à T2 ou T24 h après la conversion.

9. Calcul du rapport de dégradation de Dendra2

  1. Pour calculer le rapport de dégradation, attribuer d’abord une valeur de 1 (ou 100%) temps de la dégradation à partir du point de temps zéro (c.-à-d. juste après la conversion, lorsque tous les Dendra2 rouges convertis sont toujours présents). Cela résulte de la division de la valeur d’IntRawDen de T0 par elle-même.
  2. Pour calculer la réduction du signal d’intensité rouge Dendra2 au fil du temps, et la dégradation, divisez la valeur de RawIntDen du deuxième point de temps (par exemple, T2 ou T24 h) par la valeur du RawIntDen de T0. Le nombre qui en résulte doit être inférieur à 1. Ces valeurs peuvent également être exprimées en pourcentages, définissant T0 comme 100%.
  3. Répétez la section 7 pour chaque nématode converti. Pour une représentation graphique de la dégradation de Dendra2, tracez une parcelle de dispersion ou un graphique à barres avec le pourcentage ou les valeurs de rapport de diminution de fluorescence obtenus dans l’axe y. Appliquez toute analyse statistique souhaitée et illustrez-la sur le graphique.

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Representative Results

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Deux souches de nématode exprimant le fragment de protéine de huntingtine exon-1 dans le cadre avec la protéine photoconvertitible Dendra2 ont été obtenues par microinjection et les plasmides ont été conservés comme un tableau extrachromosomique. La construction de fusion a été exprimée dans l’ensemble du système nerveux de C. elegans du développement tout au long du vieillissement. Ici, HTT-D2 contenait soit l’étirement physiologique de 25 polyglutamine (HTTQ25-D2, figure 1A)ou une répétition entièrement pénétrante et pathogène avec 97 glutamines (HTTQ97-D2, figure 1B). Initialement, la protéine de fusion a été testée pour s’assurer qu’elle changeait de son spectre vert à son spectre rouge lors de l’irradiation UV. HTT-D2 est passé avec succès du vert au rouge exclusivement dans la région illuminée. Selon la puissance et les itérations de l’impulsion UV, et en fonction du z-plane et de la pénétrance du faisceau laser à travers la cuticule du nématode, une partie définie de HTT-D2 a été convertie, mais pas toutes. Un signal rouge est apparu dans les neurones photoconvertis, colocalisant avec le vert nonconverti HTT-D2 (Figure 1C,D). En raison de la précision des faisceaux de photons à balayage laser, il a été possible de convertir un retour sur investissement précis correspondant à un seul neurone. Avant la conversion, aucun signal rouge n’était visible lorsque l’échantillon était excité dans le canal rouge (figure 2A). Lors de l’irradiation UV, le signal vert a diminué à mesure que le HTT-D2 était converti etqu’unsignal rouge apparaissait enfin ( figure 2B). Le HTT-D2 a ensuite été dégradé au fil du temps, ce qui a entraîné une réduction des niveaux de HTT-D2 rouge(figure 2C)et une augmentation possible du signal vert HTT-D2, car plus de protéine de fusion a été nouvellement synthétisée. Étant donné qu’une diminution significative était déjà importante à 2 h après la conversion, cet intervalle pour détecter et quantifier la dégradation du HTT-D2 a été maintenu. Il est important de noter que la dégradation n’est pas le seul processus qui peut se produire après la conversion de HTT-D2. Le HTT-D2 converti pourrait être trafiqué et transporté le long des axones, ce qui entraînerait une diminution du signal rouge qui n’est pas due au dégagement. Cependant, avec les paramètres utilisés ici et sur la courte période de 2 h, aucune diffusion du signal rouge n’a été observée, peut-être en raison du fait que le petit HTT-D2 a été déplacé de la soma à l’axone. En outre, la conversion et l’imagerie d’un seul soma neuronal entier a aidé à exclure les effets de la diffusion HTT-D2 dans le même neurone, parce que tous les compartiments cellulaires ont été analysés simultanément. Pour étudier à la fois la diffusion ou le transport/trafic, il est conseillé d’obtenir des images de grossissement rapides et plus élevées et de suivre une fraction plus petite et peut-être plus motile de la protéine d’intérêt. Il est également important de noter que dans un ensemble d’expériences, chaque animal représentait une répétition biologique. Un seul neurone par nématode a été photographié, chaque animal a été photographié une fois par session, et l’imagerie s’est produite sur trois sessions, qui ont constitué des répétitions techniques. Les trois séances ont exigé que les animaux soient synchronisés sur des plaques fraîches avant chaque expérience, soit le jour 4 ou le jour 10, ce qui permet toute variabilité environnementale imposée aux nématodes. Trois séances expliquent également toute variabilité résultant de l’imagerie mise en place (p. ex., la puissance laser varie en raison d’une température différente entre les expériences). Toutes les répliques biologiques obtenues au cours des trois séances (un minimum de 20 animaux) ont été considérées comme des échantillons individuels et utilisées pour établir une signification statistique.

Après avoir confirmé que les deux souches de C. elegans HTT-D2 étaient efficaces et établissant les paramètres de conversion optimaux, les différences entre le chiffre d’affaires d’une protéine HTT-D2 causant la maladie (c.-à-d. HTTQ97-D2) par rapport à son contrôle physiologiquement pertinent (HTTQ25-D2) ont été étudiées. Tout d’abord, la dégradation du HTT-D2 dans différents neurones a été observée (figure 3). Il est connu que les sous-types de neurones dans le système nerveux du nématode varient dans leur activité métabolique et la morphologie21, peut-être faire une différence dans la dégradation et le rééquilibrage du protéome. Les neurones de la région de la queue ont été comparés à ceux de la tête et se sont avérés beaucoup plus actifs (Figure 3A). Cette constatation n’était valable que pour HTTQ25-D2 et non pour le HTTQ97-D2 pathogène, ce qui suggère que le PN n’a pas été en mesure d’enlever le HTT-D2 contenant des étirements plus longs de glutamine dans tout le système nerveux (Figure 3B).

Pour confirmer en outre que le système modèle s’est comporté comme prévu, des expériences de conversion ont été effectuées sur une plus longue période, permettant aux voies de dégradation des cellules d’éliminer presque complètement la protéine d’intérêt (figure 4). En effet, il y avait beaucoup plus de dégradation du contrôle HTTQ25-D2 24 h après conversion qu’après 2 h dans les neurones de la tête, et beaucoup plus dans les neurones de la queue (Figure 4A). Encore une fois, les neurones postérieurs de la queue ont plus activement enlevé le HTT-D2 rouge, même sur une période accrue. Une tendance similaire a été détectée pour le HTTQ97-D2, causant la maladie, avec une très légère réduction du signal rouge HTT-D2 sur 24 h. Cependant, HTTQ97-D2 n’a pas été enlevé aussi facilement que HTTQ25-D2, surtout après 24 h. Il se peut que seule la fraction soluble HTTQ97-D2 soit efficacement dégradée, ce qui explique la diminution initiale du signal rouge et sa diminution encore légère au fil du temps. Fait important, il y avait deux populations de neurones après 24 h : l’une avec un taux de dégradation plus élevé et l’autre où le signal HTT-D2 rouge n’était pas du tout dégradé, ou potentiellement même augmenté (figure 4B). Le signal accru et stable représente peut-être des espèces déjà agrégées ou en agrégation continue qui étaient beaucoup plus difficiles à éliminer des cellules en raison de leur nature amyloïde étroitement emballée. Ces inclusions, présentes exclusivement lorsque la glutamine s’étend dépassé le seuil de répétition de 40, et qui sont apparus au microscope comme des foyers, ont été supposés s’accumuler comme dépôts qui ne peuvent pas être facilement enlevés22. Il est également possible qu’une augmentation du signal fluorescent rouge ait été un artefact résultant de problèmes techniques (p. ex., utilisation de paramètres d’acquisition erronés, performances inférieures à la normale de la configuration de la microscopie ou processus de récupération/montage erroné). Lors de l’acquisition d’images sur de plus longues périodes de temps, ces variables doivent être prises en compte.

Enfin, parce que les désordres neurodégénératifs tels que HD manifestent dans la vie adulte, l’effet du vieillissement sur le taux de dégradation de HTT-D2 a été observé. Des expériences de conversion ont été effectuées dans la tête et les régions de queue des jeunes (jour 4) par rapport aux vieux (jour 10) des nématodes dans les deux souches HTT-D2 (Figure 5). Pour les neurones de tête, il n’y avait aucun changement significatif dans le taux de dégradation dû au vieillissement dans la vie de HTTQ25-D2 et HTTQ97-D2, peut-être parce que HTT-D2 a été enlevé également tout au long de la vie de chaque nématode. Cependant, un changement très significatif a été enregistré en comparant de vieux nématodes contenant un étirement pathologique ou physiologique de glutamine. Le HTTQ97-D2 n’a pas été dégradé aussi efficacement que le HTTQ25-D2, ce qui souligne l’incapacité du PN à éliminer les espèces agrégées et éventuellement toxiques de huntingtine dans les nématodes plus anciens (figure 5A). Encore une fois, un roulement plus actif et significatif dans les neurones de queue a été observé. Comme dans les neurones de tête, un chiffre d’affaires plus robuste de HTTQ25-D2 n’a pas été observé dans les neurones de queue des jeunes nématodes comparés à la cohorte plus âgée, et la dégradation était égale au jour 4 et jour 10. Inversement, des changements significatifs dans les taux de dégradation entre le contrôle et les souches pathogènes HTT-D2 sont apparus dans les jeunes nématodes de jour 4, devenant encore plus significatifs au jour 10. Fait important, les neurones de la queue ont été en mesure de faire face à la toxicité HTTQ97-D2 chez les jeunes nématodes, illustrant que divers mécanismes concomitants PN pourraient être à l’œuvre pour enlever HTT-D2 (Figure. 5B). Dans l’ensemble, l’activité de PN a diminué au fil du temps, probablement en raison des effets néfastes causés par le vieillissement et la présence d’agrégats.

Figure 1
Figure 1 : C. elegans a exprimé huntingtin exon-1 fusionné à Dendra2 dans le système nerveux. (A) Jeune, jour 4 C. elegans exprimant pan-neuronally huntingtin exon-1 contenant 25 glutamines, fusionné à Dendra2 dans son état d’excitation/émission verte non convertie. Barre d’échelle = 100 μm. Les insets montrent une image magnifiée de la tête (en haut) et des neurones de la queue (en bas). Barre d’échelle encastrée = 10 μm. (B) Jeune, jour 4 C. elegans exprimant pan-neuronally huntingtin exon-1 contenant 97 glutamines, fusionnée à Dendra2 dans son état d’excitation/émission verte non convertie. Barre d’échelle = 100 μm. Les insets montrent une image magnifiée de la queue (en haut) et de la tête (en bas) des neurones, et de la tête d’un nématode du jour 7 (extrême droite). Barre d’échelle encastrée = 10 μm. Les pointes de flèche blanche pointent vers les foyers HTTQ97-D2, représentant des agrégats de huntingtine. (C) Image de fusion de canal de HTTQ25-D2 avec conversion de la région de tête. La boîte représente la partie entière de l’ensemble de C. elegans qui a été irradiée UV. Barre d’échelle = 100 μm. Inset affiche l’émission Dendra2 à 488 nm (haut, vert) et à 561 nm (en bas, rouge). Barre d’échelle = 10 μm. (D) Image de fusion de canal de HTTQ97-D2 avec conversion de la région de tête. Barre d’échelle = 100 μm. La boîte représente la partie entière de l’ensemble de C. elegans qui a été irradiée UV. L’encart montre l’émission Dendra2 à 488 nm (en haut, vert) et à 561 nm (en bas, rouge). Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Le HTT-D2 rouge converti a diminué au fil du temps dans les neurones simples. Neurones de queue de HTTQ25-D2. Deux neurones sont montrés simultanément et indépendamment photoconvertis. Les images représentent séquentiellement trois points de temps : (A) Avant l’irradiation (avant), (B) immédiatement après l’irradiation (conversion), et (C) 2 h après irradiation (après). Le panneau supérieur (canal vert) représente le signal HTT-D2 recueilli à 486-553 nm excitation/émission. La région blanche d’intérêt délimite les neurones qui ont été irradiés. Le panneau central (canal rouge) affiche le signal HTT-D2 converti recueilli à 580-740 nm excitation/émission. Le panneau inférieur est une fusion des deux canaux. Barre d’échelle = 5 μm pour toutes les images. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Les neurones de la tête et de la queue présentaient des taux de dégradation différents. Les graphiques à barres de colonne montrent le pourcentage d’intensité rouge par rapport à la valeur initiale au moment de la conversion (c.-à-d. 100 %). Le signal rouge converti Dendra2 a diminué globalement au cours de l’intervalle de 2 h que HTT-D2 a été dégradé dans les neurones de C. elegans. Dans le système nerveux du nématode, les sous-types neuronaux présentaient des taux de dégradation différents, les neurones de queue montrant un roulement plus actif, mais seulement dans les nématodes portant un étirement de polyglutamine non pathogène. (A) Quantification de la dégradation des neurones de la tête HTTQ25-D2 par rapport aux neurones de queue. Moyenne ± SD, non apparié à deux queues T-test de l’étudiant. N = 23-28 échantillons/nématodes photographiés par région, *P < 0,05. (B) Quantification de la dégradation dans les neurones de tête de HTTQ97-D2 par rapport aux neurones de queue. Moyenne ± SD, non apparié à deux queues T-test de l’étudiant. N = 23-28 échantillons/nématodes photographiés par région, ns = non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Le HTTQ97-D2 n’a pas été autorisé de façon significative après 24 h. Les graphiques à barres de colonne montrent le pourcentage d’intensité rouge par rapport à la valeur initiale au moment de la conversion (c.-à-d. 100 %). Le signal rouge converti Dendra2 a diminué pendant que HTT-D2 a été dégradé dans les neurones de C. elegans. HTT-D2 a montré différents taux de dégradation. Même sur de plus longues périodes de temps après la conversion, le HTT-D2 pathogène n’a pas pu être enlevé par rapport à son contrôle sain. (A) Quantification du taux de dégradation dans HTTQ25-D2 à deux points de temps après conversion (2 h et 24 h) dans les neurones de la tête et de la queue. Moyenne ± SD, analyse à sens unique de la variance (ANOVA). N = 21-28 échantillons/nématodes photographiés par temps/région, *P < 0,05, ****P < 0,0001. (B) Quantification du taux de dégradation dans HTTQ97-D2 à deux points de temps après conversion (2 h et 24 h) dans les neurones de la tête et de la queue. Moyenne ± SD, analyse à sens unique de la variance (ANOVA) suivie du test post hoc de comparaison multiple de Tukey.  N = 21-28 échantillons/nématodes photographiés par temps/région, ns = non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Les nématodes anciens et jeunes exprimant le HTT-D2 pathogène ne l’ont pas dégradé efficacement. Les graphiques à barres de colonne montrent le pourcentage d’intensité rouge par rapport à la valeur initiale au moment de la conversion (c.-à-d. 100 %). Le signal rouge converti Dendra2 a diminué pendant que HTT-D2 a été dégradé dans les neurones. Comme le nématode vieilli, sa capacité à dégrader pathogène HTT-D2 a été en outre altérée dans tout son système nerveux. (A) Quantification du taux de dégradation dans les neurones de la tête des jeunes (jour 4) et vieux (jour 10) HTTQ25-D2 nématodes par rapport aux nématodes HTTQ97-D2 assortis à l’âge. Moyenne ± SD, analyse à sens unique de la variance (ANOVA). N = 23-28 échantillons/nématodes photographiés par souche/jour, ****P < 0,0001. (B) Taux de dégradation 2 h après conversion dans les neurones de la queue des jeunes (jour 4) et vieux (jour 10) HTTQ25-D2 nématodes, par rapport aux nématodes HTTQ97-D2 assortis à l’âge. Moyenne ± SD, analyse à sens unique de la variance (ANOVA) suivie du test post hoc de comparaison multiple de Tukey. N = 23-28 échantillons/nématodes photographiés par souche/jour, *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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Pour comprendre la fonction d’une protéine, il est important de comprendre sa synthèse, son emplacement et sa dégradation. Avec le développement de FP nouveaux, stables et brillants, la visualisation et la surveillance des POI sont devenues plus faciles et plus efficaces. Les PAFP de fusion génétiquement exprimés comme Dendra2 sont particulièrement bien placés pour étudier la stabilité d’un POI. Lors de l’exposition à la lumière bleu pourpre, Dendra2 se brise à un endroit précis dans une triade d’acides aminés conservés. Le fluorophore subit un petit changement structurel, entraînant un déplacement complet des spectres du vert au rouge23. Ce changement permet la détection et la surveillance de tout POI lié à Dendra2. En effet, ces constructions de fusion ont d’abord été utilisées pour créer une souche de journaliste C. elegans pour étudier le système ubiquitine-protéasome in vivo16. Dendra2 a également été utilisé pour comprendre la vulnérabilité des sous-types neuronaux sélectifs et leur capacité à traiter avec les protéines de polyglutamine élargies24, ou de surveiller l’induction de l’autophagie dans les modèles de la maladie des neurones moteurs25.

Un protocole est présenté ici pour surveiller in vivo la dégradation de la huntingtine, une protéine sujette à l’agrégation liée à la maladie d’une manière non invasive. Après avoir réussi à générer un modèle neuronal C. elegans de HD, exprimant HTT-D2 pan-neuronalally, les taux de dégradation de HTT élargi et pathogène par rapport à son homologue physiologique ont été quantifiés. Des différences frappantes ont été observées entre les sous-types neuronaux, entre les nématodes jeunes et âgés, et entre la capacité du PN à traiter les charges toxiques de glutamine au fil du temps. Cette technique peut également être appliquée pour suivre l’emplacement et le mouvement de huntingtine ainsi que son sort lorsque des perturbations à la PN sont introduites. siRNA knockdown des chaperons clés ou l’administration de composés qui inhibent l’activité protéasome peut découvrir la fonction et l’importance de ces composants dans les protéines sujettes à l’agrégation: par exemple, si le PN active des nœuds spécifiques pour compenser les carences26. Il peut également expliquer les effets néfastes causés par une maladie par rapport à ceux du vieillissement normal.

Bien que de nombreuses questions différentes puissent être abordées à l’aide de cette technique, une fois qu’un modèle souhaité a été généré, des paramètres de conversion et de détection corrects doivent être établis pour obtenir des données fiables. Il est également crucial de déterminer les paramètres de conversion qui permettent un rendement suffisant de protéines activées sans photobleaching ou phototoxicité et sans conversion indésirable. En outre, pour chaque protéine étudiée dans un système modèle spécifique, ex vivo ou in vivo, il est nécessaire d’établir expérimentalement une période suffisamment grande pour permettre une quantification précise du taux de dégradation.

Dendra2 offre une série d’avantages par rapport aux autres PAFP: 1) il est monomérique et très lumineux; 2) il a une photoconversion de contraste élevé et un signal photoconverti stable ; 3) il peut être activé avec une faible phototoxicité par un laser bleu de 488 nm, qui fait partie de la plupart des configurations matérielles confocales; 4) il mûrit efficacement à 37 °C pour l’application dans les cellules de mammifères; 5) il n’a pas d’effets secondaires toxiques lorsqu’il est exprimé pendant de longues périodes de temps23,27; et 6) le système n’est pas affecté par des variations des niveaux d’expression entre ou à l’intérieur d’un organisme ou d’une cellule, car seul le rapport du signal Dendra2 avant et après la conversion est quantifié. Toutes les propriétés répertoriées font de Dendra2 un fluorophore idéal pour suivre la dynamique des protéines en temps réel et surveiller le sort des cellules.

Malheureusement, les protéines de fusion Dendra2 souffrent de certaines limitations communes de l’étiquetage des protéines fluorescentes. La construction est une espèce chimérique souvent expérimentalement surexprimée dans les systèmes biologiques, bien que l’expression endogène pourrait être établie par l’ingénierie génomique. Le taux de dégradation de Dendra2 lui-même influe potentiellement sur la dégradation de la protéine cible, bien qu’elle ait été décrite comme une protéine très stable et à longue durée de vie27. En outre, Dendra2 n’est pas approprié pour suivre les protéines avec des rotations très rapides car il pourrait ne pas avoir le temps pour sa propre maturation appropriée. Enfin, les lasers 405 nm, qui sont rares, sont préférés pour le photoswitching efficace, bien qu’ils soient plus toxiques pour l’échantillon. En effet, la lumière bleue moins phototoxique peut être utilisée à la fois pour visualiser dendra2 vert et la convertir lorsque la puissance laser est à haute intensité. Cette caractéristique particulière doit toujours être gardée à l’esprit, car une exposition prolongée produira une conversion non désirée et des mesures potentiellement erronées. Enfin, il peut être problématique d’utiliser Dendra2 en combinaison avec des fluorophores verts ou rouges. Cependant, de nombreux PAFP différents sont disponibles pour étudier la dynamique de plusieurs protéines simultanément.

Des expériences utilisant Dendra2 et d’autres PAFP ont été liées à la récupération de la fluorescence après le photobleaching (FRAP) et aux techniques d’étiquetage de la chasse aux impulsions radioactives. Dans un contexte frap, il est impossible de distinguer les protéines réinténéraient un retour sur investissement par rapport aux protéines fluorescentes nouvellement formées, et une surveillance et une visualisation constantes de l’échantillon sont nécessaires. Avec Dendra2, deux populations clairement distinctes sont générées qui peuvent être observées indépendamment au fil du temps de sorte que la forme « inactive » remplacée et nouvellement synthétisée de Dendra2 vert peut être suivie et quantifiée16. Dendra2 est également une sonde utile dans la microscopie de super résolution telle que la microscopie fluorescente de réflexion interne totale (TIRF)28 et la microscopie de localisation de photoactivation (PALM)29. Dans un proche avenir, de telles avancées permettront une meilleure localisation et un suivi potentiellement unique des molécules de toute poi, permettant de découvrir des différences plus subtiles à l’intérieur et entre les échantillons et, en fin de compte, de produire de nouvelles informations sur la vie et le sort de toute poi au sein d’un système biologique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous reconnaissons le DFG (KI-1988/5-1 à JK, NeuroCure PhD fellowship par le NeuroCure Cluster of Excellence à MLP) pour le financement. Nous reconnaissons également le centre d’imagerie du Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) pour fournir l’imagerie mise en place. En outre, nous tenons à remercier Diogo Feleciano qui a établi le système Dendra2 dans le laboratoire et fourni des instructions.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH + Co. KG 5210.2 NGM component
Agarose, Universal Grade Bio & Sell GmbH BS20.46.500 Mounting slide component
BD Bacto Peptone BD-Bionsciences 211677 NGM component
Deckgläser-18x18mm Carl Roth GmbH + Co. KG 0657.2 Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 Carl Zeiss AG Objective
Fiji/ImageJ 1.52p NIH Analysis Software
Levamisole Hydrochloride AppliChem GmbH A4341 Anesthetic
LSM710-ConfoCor3 Carl Zeiss AG Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope Leica Camera AG Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2 this paper C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2 this paper C. elegans strain
OP50 Escherichia coli CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OP50 Nematode food source
Sodium Chloride Carl Roth GmbH + Co. KG 3957.2 NGM component
Standard-Objektträger Carl Roth GmbH + Co. KG 0656.1 Glass slides
ZEN2010 B SP1 Carl Zeiss AG Confocal acquisition software

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In Vivo Quantification du chiffre d’affaires des protéines dans le vieillissement <em>C. Elegans</em> à l’aide de Photoconvertible Dendra2
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Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).More

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).

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