Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

ב Vivo פיקציה של מחזור החלבון בהזדקנות C. אלגיה באמצעות Photoconvertible המרה Dendra2

doi: 10.3791/61196 Published: June 13, 2020

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול כדי לפקח על השפלה של החלבון huntingtin התמזגו הפוטוורידים פלואורואופפור Dendra2.

Abstract

חלבונים מסונתז ומושפל באופן קבוע בתוך התא כדי לשמור על הומאוסטזיס. היכולת לפקח על השפלה של חלבון של עניין היא המפתח להבנת לא רק מחזור החיים שלה, אלא גם לחשוף חוסר איזון ברשת פרוטאוסטזיס. שיטה זו מראה כיצד לעקוב אחר ההשפלה של מחלת החלבון הגורם למחלות. שתי גרסאות של huntingtin התמזגו ל Dendra2 מבוטא במערכת העצבים של C. אלגיה : גרסה פיזיולוגית או אחת עם מתיחה מורחבת ופתוגניים של glutamines. Dendra2 הוא חלבון פלורסנט פוטולהמרה; על פולס אולטרה סגול (UV) הקרנה, Dendra2 מעביר את הריגוש שלה/פליטה ספקטרום מירוק לאדום. בדומה לניסוי מרדף דופק, המחזור של red-Dendra2 המרה יכול להיות מנוטר וכימות, ללא קשר להפרעה מחדש מסונתז ירוק-Dendra2. בעזרת מיקרוסקופ מבוסס-מיקוד ובגלל השקיפות האופטית של ה -"אלאלגיה", ניתן לנטר ולכמת את ההשפלה של הDendra2 באורגניזם חי ומזדקן. הDendra2 הנוירוונאליות מושפלת באופן חלקי מיד לאחר ההמרה ומנוקה לאורך זמן. מערכת השליטה בירידה בנוכחות מוטציות huntingtin והיא לקויה עוד יותר עם הזדקנות. תת העצבי בתוך מערכת העצבים אותה מוצג קיבולות מחזור שונות עבור huntingtin-Dendra2. בסך הכל, ניטור כל חלבון של עניין התמזגו Dendra2 יכול לספק מידע חשוב לא רק על השפלה שלה ואת השחקנים של הרשת פרוטאוסטזיס מעורב, אלא גם על מיקומו, סחר, ותחבורה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הפרוטאום של אורגניזם חי מתחדש באופן תמידי. חלבונים מושפל ברציפות ומסונתז בהתאם לדרישת הפיסיולוגית של תא. חלבונים מסוימים מסולקים במהירות, בעוד אחרים חיים יותר. ניטור הדינמיקה חלבון הוא משימה פשוטה יותר, מדויקת יותר, פחות פולשנית בעת שימוש בחלבונים פלואורסצנטי מקודד גנטית (FPs). FPs טופס אוטוזרז והוא יכול להיות מותך כל חלבון של עניין (פוי), אבל לא דורשים אנזימים לקפל או צריך קופנים לשמור עבור חמצן1. דור חדש של FPs ההונדס לאחרונה כדי לעבור צבע על הקרנה עם דופק קל של אורך גל נקבע. התמונות האלה FPs (פפס) לאפשר תיוג ומעקב של POIs, או ארגונית או התאים שהם מתגוררים, וכיצד לבחון את הפרמטרים כמותיים ו/או איכותניים שלהם2. FPs לאפשר מעקב אחר כל התנועה של פוי, כיוון, שיעור של תנועה, מקדם דיפוזיה, נייד לעומת שברים משותק, הזמן שהוא שוכן בתא הסלולר אחד, כמו גם קצב המחזור שלה. ניתן לקבוע את התנועה לארגון מסוים, לתחבורה, לאירועים ביקוע ולהיתוך. עבור סוג תא מסוים, ניתן ליצור מיקום תא, קצב החילוק, אמצעי האחסון והצורה. באופן מכריע, השימוש ב-פפס מאפשר מעקב ללא הדמיה רציפה וללא הפרעות מכל מכשיר שהוא לאחרונה. מחקרים הן בתאים והן באורגניזמים שלמים המועסקים בהצלחה פפס לטיפול שאלות ביולוגיות בvivo, כגון התפתחות של סרטן גרורות, הרכבה או פירוק של שלד התא, ו-RNA-DNA/חלבון אינטראקציות3. בכתב יד זה, מיקרוסקופ אור ו פפס משמשים כדי לחשוף את שיעורי המחזור של huntingtin חלבון הנוטה לצבור (HTT) בvivo במודל של C. אלגיה של מחלת ניווניות.

הפרוטוקול המתואר כאן ככמת את היציבות וההשפלה של חלבון ההיתוך huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 הוא הדור השני monomeric פמפ4 כי בוררים הפיך הפליטה שלה/עירור ספקטרום מירוק לאדום בתגובה או UV או אור כחול גלוי, עם גידול בעוצמתו של עד 4,000-קיפול5,6. Huntingtin הוא החלבון האחראי לגרימת מחלת הנטינגטון (HD), הפרעת ניווניות תורשתי קטלנית. הhuntingtin exon-1 מכיל קטע של glutamines (הקאג, Q). כאשר החלבון מתבטא עם מעל 39, הוא מתקפל לתוך חלבון מוטציה, רעיל ופתוגניים. מוטציה HTT הוא נוטה לצבור ומוביל מוות עצבי תאים וניוון, או מינים oligomeric קצרים או גדול מאוד בנוי amyloids7.

נמטודות היא מערכת מודל ללמוד הזדקנות ניוון נוירואני בזכות הקלות של מניפולציה, הטבע האיזוגני, תוחלת חיים קצרה, ושקיפות אופטית שלה8. כדי ללמוד את יציבותו של HTT בvivo, מבנה היתוך התבטא במערכת העצבים של הג. העברה של HTT-D2 המכיל מתיחה פיזיולוגית של 25Qs (HTTQ25-D2) או מתיחה פתולוגית של 97Qs (HTTQ97-D2) הוא הביע מוגזם פאן-neuronally בכל תקופת החיים של nematode9. על ידי העברת החיים C. אלגיה לנקודה קצרה וממוקדת של אור, תא העצב בודד הוא מיתוג והמרה htt-D2 מתבצע במשך הזמן. כדי לקבוע את כמות HTT-D2 המושפל, ההפרש בין האות האדום של HTT-D2 הטרי המומר מושווה לאות האדום הנותרים של HTT-D2 לאחר פרק זמן קבוע. לפיכך, ניתן לחקור את האופן שבו הונטינטין מושפל כאשר הוא נמצא בצורתו המורחבת והרעילה בהשוואה לצורתו הפיזיולוגית; כיצד הנוירונים הקדמי או האחורי להגיב באופן שונה לנוכחות של Q97 לעומת Q25, במיוחד על תקופות זמן ממושך; וכיצד התמוטטות הרשת פרוטאוסטזיס (PN) במהלך הזדקנות תורמים להבדלים בשיעורי השפלה. תוצאות אלה מתארות רק קבוצה קטנה של תצפיות על תחלופת HTT-D2. עם זאת, שאלות רבות יותר ביולוגיות הרלוונטיות הן לתחום של צבירת חלבון ו פרוטאוסטזיס יכול להיות ממוען עם זה ביישום vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. דור של C. אלגיה המבטא חלבון היתוך הDendra2

  1. שיבוט הקידוד הגנטי פוי ב ביטוי נמטודות וקטור (כלומר, pPD95_75, addgene #1494), על ידי הגבלה אנזים ההגבלה המסורתית10, גיבסון האסיפה11, או כל שיטה של בחירה. הכנס מקדם לביטוי כונן ברקמה רצויה או בשלב התפתחותי רצוי. הכנס את Dendra2 fluorophore פור או N-או C-סופני במסגרת עם פוי.
  2. צור מיקרוגניים C. אלגיה המבטא את מבנה ההיתוך (למשל, באמצעות מיקרו הזרקה)12.
    הערה: הפלסמיד הנושא את המשגר יישאר כמערך מיותר כרומוזום. שילוב המבנה אינו הכרחי, אך ניתן לבצעו במידת הצורך13. בפרוטוקול זה, C. אלגיה היו מיקרווזרק עם פלס1 הנושאת את מבנה ההיתוך הונטיטין אקסון Dendra2 (htt-D2) תחת שליטה של הפאן-עצבי מיזם prgef-1. עמוד השדרה של ביטוי C. אלגיה התקבל מ-קריס ואח '14, הונטינב אקסון 1 עם או Q25 או Q97 התקבל מ juאויבי ואח '15, ו Dendra2 התקבל מ hamer et al.16.

2. התאמת גיל ואחזקה של הג

  1. גיל להתאים את כל נמטודות על ידי סנכרון או עם הטיפול היפוכלוריט בסיסית הפתרון17 או באמצעות הנחת ביצה עבור 4 h ב 20 ° c. עבור הנחת ביצים, מקום 10 gravid מבוגרים על מדיה צמיחה נמטודות טרי (ngm) צלחת לעזוב עבור 4 h לפני ההסרה. הביצים שהונחו בזמן זה יהיה להצמיח nematodes מסונכרן.
  2. לשמור על הניסוי C. אלגיה על מדיה צמיחה נמטודות (ngm) צלחות שנזרע עם מקור המזון החיידקי E. coli OP50, בעקבות גידול נמטודות רגיל18.
  3. לגדול בשעה 20 ° c עד לשלב הרצוי. עבור פרוטוקול זה, הגילאים הנדרשים הם ימים 4 ו-10.
    הערה: מבוגרים צעירים ביום 4 יכולים להיות מזוהים על ידי נוכחות של ביצים בבלוטת המין שלהם והניידות הגבוהה שלהם. יום מיושן 10 הנמדות הם פוסט פורה, ועוברים הידרדרות רקמות וירידה בקטר19.
  4. ליום 10 נמטודות, מעבר יומי לאחר השלב L4 ביום 3, לאחר נמטודות הם פוריים, כדי למנוע אוכלוסיה מעורבת.

3. הכנת שקופיות מיקרוסקופיה להדמיה

  1. הכינו את שקופיות המיקרוסקופיה ביום ההדמיה. במיקרוגל, להמיס כיתה כללית agarose בריכוז של 3% (w/v) ב ddH2O.. השאר להתקרר מעט
  2. חותכים את הקצה של טיפ 1 מ ל ומותכים בערך 400 μL של הצמח הנמס. הניחו בעדינות מספר טיפות של מעלות על שקופית זכוכית נקייה והציבו מיד שקופית נוספת למעלה, ודאו שנוצרת משטח דק בין השניים. הנח להתייבש לפני הזזה עדינה או הסרת השקופית העליונה.
  3. הניחו את השקופיות המכולות במיכל לחות כדי למנוע את התייבשות. אלה יכולים לשמש בתוך 2-3 h.
    הערה: הימנע מהיווצרות בועות קטנות בתוך הצמח, כמו הנמטודות יכול להיות לכוד בפנים.

4. הגדרת פרמטרים של מיקרוסקופ קונפרטד

הערה: לפני טעינת הנמטודות ורכישת הנתונים, הגדירו את כל ההגדרות בתוכנת הרכישה הקונפוקלית. ניתן להתאים את ההגדרות לחומרת הדימות ולתוכנה של בחירה.

  1. פתח את התוכנה הקונקלית והגדר את הגדרות הדימות לייזר. הגדר את נתיב האור עבור עירור/פליטה עבור ירוק Dendra2 ב 486-553 nm ו Dendra2 אדום ב 580-740 nm. כוונן את העוצמה והרווח של שני הערוצים/לייזרים בהתאם לעוצמת ה-fluorophore. אין לשנות את הרווח או ההסטה הדיגיטליים ולהגדיר את החור הפעור כפתוח לגמרי.
  2. הגדירו את כיוונון הרכישה: בחרו מצב ערוץ רציף והחליפו מעקב אחר כל מסגרת. הגדר את מצב הסריקה כמסגרת, ואת גודל המסגרת כ-1,024 x 1,024, עם שלב קו של 1. הגדר את הממוצע ל-2, וממוצע לפי שיטה ומצב של קו חד כיווני. הגדר את עומק הסיביות ל-8 סיביות.
  3. הגדירו את הגדרות הרכישות רב ממדיים עבור ההמרה של Dendra2. עבור המרה הלבנה להשתמש 405 ננומטר לייזר דיודה להגדיר ב 60% כוח אנרגיה. אם זמין, להפעיל את הלבנת בטוח GaAsP כדי להגן על גלאי.
  4. בחר סידרת זמן של שני מחזורים, עם מרווח של 0.0 אלפיות השנייה באמצע, ולהתחיל ולהפסיק רגיל. הפעל הלבנה לאחר סריקה 1 של 2 וחזור על 30 איטראציות. הפסק הלבנת כאשר העוצמה יורדת ל 50%.
  5. להגדיר את המהירות של רכישה/פיקסל לשכון מהר (למשל, מקסימום = 12) עבור המרה, מהירות בינונית (למשל, בינונית = 5) ללכידת תמונה הצמדה.
    הערה: הערכים הלבנת שהוגדרו כאן הם קווים מנחים. עבור אחרים Dendra2 מתויג POIs הגדרות כוח הלייזר הלבנת איטראציות וערכים חייב להיות מבוסס באמפירי.

5. הרכבה של ג. אלאנים על שקופיות מיקרוסקופית

הערה: במידת האפשר, הציבו stereomicroscope הרכבה קרוב לכיוונון המיקרוסקופ הקונמטאני ומהר את הנמטודות בדיוק לפני ההדמיה.

  1. על שקופית מכסה הזכוכית בצד הנגדי של כרית agarose, לצייר חלון עם ארבעה ריבועים עם סמן קבוע ומספר להם.
  2. פיפטה 15 μL של לויאמאסב. באמצע משטח הצמח הריכוז של levamisole ישתנה בהתאם לגיל nematode: כאשר הדמיה יום 4 nematode להשתמש 2 מ"מ לויתן; כאשר יום הדמיה 10 נמטודות להשתמש 0.5 mM levamisole.
  3. העבר ארבע מנודות לתוך הנוזל באמצעות בוחר התיל. בעזרתו של בוחר עפעף, בעדינות להעביר כל נמטודות בודדים למשבצת חלון. סיבוב הריס כך כל סימן של E. coli OP50 הוא מדולל ורקע הפלורסנט שלה לא מפריעה לרכישת אותות.
  4. לחכות נמטודות כמעט להפסיק לנוע ובעדינות למקם שובר כיסוי על גבי הנוזל כדי לשתק את הנמטודות בשכבה של levamisole בין הלוח הצמח ושובר הכיסוי.
  5. הניחו את השקופית ההפוכה על הבמה הקונמטאבית כדי לדמות את הנמטודות.

6. המרה של Dendra2 ירוק: רכישת נתונים בזמן אפס

הערה: הניסויים מרדף הדופק להתחיל על ידי המרה הפיכה חלבון Dendra2 היתוך מ פלואור פולטות ירוק אחד אדום.

  1. באמצעות העין של המיקרוסקופ, לאתר נמטודות הראשון עם מטרה 20x תחת זריחה ירוקה. להתמקד בראש או בזנב ולעבור למצב קונפוקלית.
  2. להתחיל סריקת לייזר עם 488 ננומטר לייזר כחול לדמיין את Dendra2 ירוק בערוץ EGFP ירוק (לשעבר/em = 486-553 nm). בחר תא עצב בודד והבא אותו לפוקוס. זום ב 3x ולהגדיל את היעד של קרן לייזר4.
    הערה: בחר תא עצב אחד לכל nematode. כל תא מעצב יהווה דגימה אחת או נקודת נתונים.
  3. מצא את מישור ההקרנה המקסימלי, בהתאם לבהירות של fluorophore להגדיל או להקטין את הרווח או לייזר כדי לקבל תמונה רוויה אך לא מוגזם לזיהוי על ידי מחוון טווח הצבע. , ברגע שזה מוגדר. הפסיקו את הסריקה
    הערה: אל תעביר את המדגם במשך זמן רב מדי או עם כוח רב מדי, כמו עירור עם אור כחול 488 ננומטר לעין יכול גם להמיר Dendra2, אם כי לאט וביעילות פחות4.
  4. בתוכנה, פתח את הכרטיסיה כדי לבחור את אזורי הריבית (ROIs) ולצייר הROI הראשון סביב תא העצב הנבחר. להגדיר אזור שנייה גדולה יותר של עניין המקיף את ראשו של nematode וכולל את ההחזר הראשון.
  5. בהגדרות הלבנה, בחר עבור ההחזר הראשון שנרכש, הולבן ונותח. בחר עבור ההחזר השני לרכישה וניתוח אך לא לולבן.
  6. להגדיר את המהירות של סריקה למקסימום (כלומר, פיקסל מהיר לשכון) ולהתחיל את הניסוי כדי להמיר את Dendra2 נוירונים שנבחרו.
    הערה: לאחר שהניסוי נעשה התמונה הנרכשת תגרום לשתי תמונות: אחת לפני ואחת אחרי ההמרה. עבור הערוץ הירוק, התמונה הראשונה צריכה להיות אות ירוק גבוה יותר הפוחתת בתמונה השנייה בשל ההמרה של Dendra2 ירוק. עבור הערוץ האדום, התמונה הראשונה צריכה להיות שלילית ולא להראות אות, עם אות אדום המופיעים בתמונה לאחר ההמרה. אם האות הירוק אינו מצמצם, ההמרה לא התרחשה, ואת ההגדרות, כגון כוח הלייזר 405 או מספר האיטראציות, יש לשנות. אם יש אות אדום בתמונה הראשונה, אז כוח הלייזר 488 ננומטר בשימוש היה גבוה מדי וחלק של Dendra2 ירוק כבר המרה לאדום. במקרה זה, תא העצב/nematode חדש יש לבחור.
  7. מיד לאחר ההמרה, התחל לחיות סריקה עם ירוק 561 ננומטר לייזר לדמיין Dendra2 בערוץ אדום (לשעבר/em = 580-740 ננומטר). מצא את הפוקוס ואת ההקרנה המקסימלית המתאימה של תא העצב שהומר באמצעות מחוון צבע הטווח כדי למנוע חשיפה יתר.
  8. הגדר במהירות את קצב הסריקה למהירות נמוכה יותר לשכון בפיקסלים (לדוגמה, 5x) ורכוש תמונת תמונה של שני הערוצים ברזולוציה גבוהה יותר. תמונה זו מוגדרת כtimepoint 0 (T0) לאחר ההמרה.
    הערה: מהירות הרכישה עבור התמונה המומרת עשויה להיות מגוונת. עם זאת, לאחר שנבחר, מהירות זו צריכה להישאר קבועה בכל איסוף הנתונים.
  9. שמור את הסריקה באמצעות שם ו/או מספר הניתנים לזיהוי, ואחריו תווית השעה אפס (T0).
    הערה: מומלץ גם לשמור את התמונה של ניסוי ההמרה (שלב 6.6) כדי להמחיש את היעדר האות האדום לפני ההמרה והופעתו לאחר מכן.

7. הדמיה של Dendra2 אדום המרה לרכישת נתונים בנקודת הזמן השנייה שנבחרה

  1. כדי לעקוב אחר השפלה Dendra2 במשך הזמן, הגדר מועד שני ליצור מחדש את אותו מזהה/עצב. בחר את נקודת הזמן השנייה הנסבית לטיפול בכל שאלה ביולוגית רלוונטית. עבור הפרוטוקול המתואר כאן, Dendra2 הוא התמונה הן ב 2 h (T2) ו 24 h (T24) post המרה.
    1. בנקודת הזמן שנבחרה, למצוא את אותו nematode/תא העצב עם השימוש של עינית ו זריחה אדומה.
    2. פתח את התמונה T0 של nematode/תא העצב בהתאמה רענן/שימוש חוזר בהגדרות התמונה. ודא שהגדרות הרכישה של התמונה זהות בדיוק בעת הרכישה של תמונות T0, T2 ו-T24 h.
    3. , סריקה חיה בערוץ האדום. הביאי את העצב האדום המומר לפוקוס בגלל שDendra2 האדום מבזה לאורך הזמן מחוון הטווח יראה הקרנה מקסימלית פחות אינטנסיבי. אין לשנות פרמטרים של רכישה ולקבל תמונה באותה מהירות (לדוגמה, 5x) כתמונה הראשונה.
  2. כדי לעקוב אחר ההשפלה של Dendra2 אחרי 4 h או יותר, להציל את נמטודות לאחר ההמרה.
    1. הסר את השקופית מתוך המיקרוסקופ מיד לאחר המרת והדמיה של ארבע nematodes. להסיר בעדינות את הכיסויים עם השימוש של התיל לאסוף, להרים כל נמטודות מן הלוח agarose.
    2. מניחים כל נמטודות בנפרד על צלחת מתויג כראוי לזיהוי ngm.
    3. עבור נקודת הזמן השנייה, הר נמטודות שוב על משטח agarose טריים ולהמשיך עם הדמיה של Dendra2 אדום המרה בעקבות ההוראות בסעיף 6.

8. ניתוח תמונה של Dendra2 המרה

הערה: ניתוח ההשפלה של Dendra2 מבוצע עם תוכנת פיג'י/ImageJ20.

  1. פתח את פיג'י וגרור ושחרר את קובץ ה-lsm בבר של פיג'י. פתח את התמונה T0 נלקח רק לאחר ההמרה ואת התמונה של נמטודות אותו נלקח בנקודת הזמן שנבחרה לאחר ההמרה (T2 או T24 h).
    הערה: כדי לעקוב אחר ההתדרדרות של החלבון הקשור לריבית ל Dendra2 רק הערוץ האדום צריך להיות מנותח.
  2. קביעת פרמטרי המדידה מהתפריט: ניתוח | הגדר מדידות. בחר את האזור ואת פונקציות הדחיסות המשולבות .
  3. בחר את התמונה שמתקבלת בערוץ האדום. בחרו בכלי בחירת המצולע מהבר של פיג'י.
  4. זהה את תא העצב המומר בתמונה T0 וצייר ROI סביבו באמצעות כלי הבחירה.
    1. כדי לזהות כראוי את קווי המתאר של תא העצב, סמן את סף העוצמה על-ידי בחירה מתוך התמונה בסרגל | כוונן | . אנימבין. גררו את סמן הסרגל כדי להתוות את הסף ולעקוב סביב אזור זה בעזרת כלי המצולע. כדי ליצור ROI מדויק, ניתן גם להשתמש במתאר של תא העצב הנבחר מהערוץ הירוק.
  5. לאחר שהבחירה נעשתה בחלון הערוץ האדום, לחץ על לנתח | . מידה מדידה חלון מוקפץ בשם תוצאות יופיע ויכלול את ערכי ה-ROI עבור אזור, Intdenו- rawintden.
  6. בצע את אותו תהליך של בחירה ומדידה עבור התמונה של נקודת הזמן השנייה (T2 או T24 h).
  7. העתק את הערכים שהושגו לתוך תוכנת גיליון אלקטרוני, ודאג להקליט כראוי את הערכים ב-T0 לאחר ההמרה, וב-T2 או T24 h לאחר ההמרה.

9. חישוב היחס של השפלה Dendra2

  1. כדי לחשב את היחס בין השפלה, הקצה תחילה ערך של 1 (או 100%) לזמן השפלה מנקודת זמן אפס (כלומר, רק לאחר ההמרה, כאשר כל הDendra2 האדום המרה עדיין נוכח). התוצאה היא חלוקת הערך של החלק הפנימי של T0 בפני עצמו.
  2. כדי לחשב את הפחתת האות האדום Dendra2 האינטנסיביות לאורך זמן, ואת ההשפלה, לחלק את הערך של Rawintden של נקודת הזמן השנייה (למשל, T2 או T24 h) לפי הערך של Rawintden של T0. על המספר שהתקבל להיות קטן מ-1. ערכים אלה יכולים גם להתבטא כאחוזים, המגדירים T0 כ-100%.
  3. חזור על סעיף 7 עבור כל נמטודות שהומר. לייצוג גרפי של השפלה של Dendra2, התרשים מתווה פיזור או גרף עמודות עם ערכי האחוזים או היחס של ירידת הזריחה המתקבלת בציר y. החל כל ניתוח סטטיסטי רצוי והמחשה בגרף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

שני זנים נמטודות המבטא huntingtin exon-1 מרסיס חלבון במסגרת עם Dendra2 חלבון ההמרה התקבלו באמצעות מיקרוהזרקות והפלמידים נשמרו כמערך מיותר כרומוזומלית. בניית ההיתוך באה לידי ביטוי במערכת העצבים השלמה מהתפתחות הזדקנות ברחבי העולם. כאן, HTT-D2 הכיל את המתיחה הפיזיולוגית 25 polyglutamine (HTTQ25-D2, איור 1א) או החדירה לחלוטין הפתוגניים חוזר עם 97 Glutamines (HTTQ97-D2, איור 1B). בתחילה חלבון ההיתוך נבדק כדי לוודא שהוא השתנה מהספקטרום הירוק שלה לספקטרום האדום שלה על הקרנה UV. HTT-D2 עבר בהצלחה מירוק לאדום באופן בלעדי באזור מואר. על פי הכוח והחזרות של הדופק UV, ובהתאם z-מישור והחדירה של קרן הלייזר דרך הקוטיקולה של nematode, חלק מוגדר של HTT-D2 הוסב, אבל לא כל. אות אדום הופיע בתוך הנוירונים המרה, לוקליזציה עם HTT ירוק לא מומר-D2 (איור 1ג, ד). בשל הדיוק של לייזר סריקת קורות פוטון זה היה אפשרי להמיר ROI מדויק המתאים לעצב אחד. לפני ההמרה, לא היה אות אדום גלוי כאשר המדגם היה נרגש בערוץ אדום (איור 2א). על הקרנה UV, האות הירוק פחתה כמו HTT-D2 הוסב ואות אדום הופיע לבסוף (איור 2ב). Htt-D2 היה אז מושפל לאורך זמן, וכתוצאה מכך ירידה ברמות של htt-d2 אדום (איור 2ג) ועלייה אפשרית של האות htt-d2 ירוק, כמו חלבון היתוך יותר היה מסונתז לאחרונה. בגלל ירידה משמעותית היה כבר בולט 2 h לאחר ההמרה, מרווח זה לגילוי וכימות השפלה של HTT-D2 נשמר. חשוב לציין כי השפלה אינה התהליך היחיד שיכול להתרחש לאחר ההמרה של HTT-D2. המרה HTT-D2 יכול להיות נסחר ומועברים לאורך axons, והתוצאה היא ירידה באות האדום לא בשל אישור. עם זאת, עם הגדרות המועסקים כאן ומעל טווח זמן קצר של 2 h, לא הפצת האות האדום נצפתה, אולי בשל העובדה HTT-D2 קטן הועבר מן הסומה ל axon. יתר על כן, המרה והדמיה של כולו נוירואליות שלמה אחת סייעו להוציא את ההשפעות של HTT-D2 דיפוזיה בתוך אותו תא העצב, כי כל התאים הסלולריים נותחו בו. כדי ללמוד גם דיפוזיה או הובלה/סחר מומלץ לקבל תמונות הגדלה מהירה וגבוהה יותר ולעקוב אחר חלק קטן יותר ואולי יותר מורצפת של חלבון הריבית. חשוב גם לציין שבתוך מערכת ניסויים, כל בעל חיים ייצג חזרה ביולוגית אחת. רק תא מעצב אחד לכל נמטודות היה בתמונה, כל חיה היתה מנויית פעם אחת בכל הפעלה, והדמיה אירעה לאורך שלושה מפגשים, אשר היוו חזרה טכנית. שלושת המפגשים הנדרשים כי בעלי החיים יהיו מסונכרנים על צלחות טריות לפני כל ניסוי ביום 4 או יום 10, מה שמאפשר השונות הסביבתית מוטלות על nematodes. שלושה הפעלות גם לחשבון עבור כל השינויים הנובעים הדמיה להגדיר (למשל, כוח הלייזר משתנה עקב טמפרטורה שונה בין ניסויים). כל השכפול הביולוגי שהושג בשלושת המפגשים (לפחות 20 בעלי חיים) נחשבו לדגימות אישיות ומנוצלים ליצירת משמעות סטטיסטית.

לאחר אישור כי הן C. אלגיה htt-D2 הזנים היו יעילים והקמת פרמטרים מיטביים המרה, ההבדלים בין מחזור של מחלה הגורם Htt-d2 חלבון (כלומר, HTTQ97-d2) לעומת השליטה הרלוונטית הפיזיולוגית שלה (HTTQ25-d2) נחקרו. ראשון, השפלה של HTT-D2 בנוירונים שונים נצפתה (איור 3). ידוע כי תת הנוירונים בתוך מערכת העצבים של nematode להשתנות בפעילות חילוף החומרים שלהם מורפולוגיה21, אולי ביצוע הבדל השפלה ואיזון מחדש של פרוטדום. הנוירונים באזור הזנב הושוו עם אלה של הראש ונמצאו באופן משמעותי יותר פעיל (איור 3א). ממצא זה היה תקף רק עבור HTTQ25-D2 ולא עבור הפתוגניים HTTQ97-D2, הרומז כי PN לא היה מסוגל להסיר HTT-D2 המכילים גלוטמין יותר מותח ברחבי מערכת העצבים (איור 3ב).

כדי לוודא נוספת כי מערכת המודל התנהג כצפוי, ניסויים ההמרה נערכו במשך תקופה ארוכה יותר, המאפשר למסלולי השפלה של התאים כדי לחסל את חלבון הריבית כמעט לחלוטין (איור 4). אכן, היה השפלה יותר משמעותית של שליטה HTTQ25-D2 24 שעות לאחר ההמרה מאשר לאחר 2 h בנוירונים בראש, ובהרחבה יותר בנוירונים הזנב (איור 4א). שוב, הנוירונים הזנב האחורי הוסרו באופן פעיל יותר HTT-D2 אדום, אפילו על זמן מוגבר. מגמה דומה זוהה עבור המחלה-גרימת HTTQ97-D2, עם ירידה קלה מאוד של אות HTT-D2 אדום מעל 24 שעות. עם זאת, HTTQ97-D2 לא הוסר בקלות כמו HTTQ25-D2, במיוחד לאחר 24 שעות. ייתכן כי רק את השבר HTTQ97-D2 מסיסים ביעילות מושפל, החשבונאי הפחתת הראשונית של האות האדום וירידה קלה נוספת שלה לאורך זמן. חשוב מכך, היו שתי אוכלוסיות של נוירונים אחרי 24 שעות: אחד עם שיעור השפלה גבוה יותר ואחד שבו האות HTT-D2 האדום לא היה מושפל כלל, או אפילו גדל (איור 4ב). האות מוגברת יציב יכול לייצג כבר מצטברים או ברציפות צובר מינים אשר היו קשים באופן משמעותי כדי לנקות מן התאים בשל הטבע עמילואיד שלהם בחוזקה. אלה הכללות, הנוכחי באופן בלעדי כאשר גלוטמין מתיחה חרג מסף חוזר 40, ואשר הופיע מאכל foci, כבר המשוערות לצבור כמו פיקדונות כי לא ניתן להסיר בקלות22. ייתכן גם כי גידול באות פלורסנט אדום היה חפץ כתוצאה מבעיות טכניות (למשל, שימוש בפרמטרי רכישה שגויים, ביצועים תת-משתנים של הגדרת המיקרוסקופיה, או תהליך התאוששות/הרכבה מוטעה). בעת השגת תמונות בפרקי זמן ארוכים יותר, יש לקחת בחשבון את המשתנים הללו.

לבסוף, בגלל הפרעות ניווניות כגון מניפסט HD בחיים מבוגרים, ההשפעה של הזדקנות על קצב של HTT-D2 השפלה נצפתה. ניסויים המרה בוצעו בראש ובאזורים הזנב של צעירים (יום 4) לעומת הישן (יום 10) נמטודות בשני htt-D2 זנים (איור 5). עבור הנוירונים בראש, לא היה שינוי משמעותי בקצב של השפלה בשל הזדקנות בתוך החיים של שני HTTQ25-D2 ו HTTQ97-D2, אולי בגלל HTT-D2 הוסר באופן שווה לאורך כל החיים של כל nematode. עם זאת, הוקלט שינוי משמעותי מאוד בעת השוואת נמטודות ישנים המכילים או פתולוגית או מתיחה של גלוטמין. HTTQ97-D2 לא היה מושפל ביעילות כמו HTTQ25-d2, הדגשת חוסר יכולת של PN להסיר מינים צבורים ואולי רעיל של huntingtin נמטודות ישנים (איור 5א). שוב, מחזור פעיל יותר משמעותי ב נוירונים הזנב נצפתה. כמו בראש נוירונים, מחזור חזק יותר של HTTQ25-D2 לא נצפתה הנוירונים הזנב של נמטודות צעירים לעומת הקבוצה הבוגרת, והשפלה היה שווה ביום 4 ויום 10. לעומת זאת, שינויים משמעותיים בשיעורי השפלה בין הפקד והזנים HTT הפתוגניים הופיעו ביום הצעיר 4 nematodes, הופכים אפילו יותר משמעותי ביום 10. חשוב מכך, הנוירונים הזנב היו מסוגלים להתמודד עם רעילים HTTQ97-D2 ב nematodes צעירים, הממחישות כי מנגנונים PN שונים במקביל יכול להיות בעבודה כדי להסיר HTT-D2 (איור .5B). בסך הכל, פעילות PN פחתה לאורך זמן, אולי עקב תופעות מזיקות שנגרמו על ידי הזדקנות ונוכחות של אגרגטים.

Figure 1
איור 1: ס. אלאים הביעו הDendra2 במערכת העצבים. (א) צעיר, יום 4 ג. אלגיה פאן-neuronally ביטוי exon-1 המכיל 25 Glutamines, התמזגו Dendra2 במצב הירוק המרה שלה עירור/פליטה. סרגל בקנה מידה = 100 μm. Insets להראות תמונה מוגדלת של הראש (למעלה) ואת זנב (למטה) נוירונים. שיבוץ סרגל בקנה מידה = 10 μm. (ב) צעיר, יום 4 ג. אלגיה פאן-neuronally ביטוי exon-1 המכיל 97 Glutamines, התמזגו Dendra2 במצב הירוק המרה שלה עירור/פליטה. סרגל קנה מידה = 100 μm. insets להראות תמונה מוגדלת של הזנב (למעלה) ואת הראש (למטה) נוירונים, ואת הראש של יום 7 נמטודות (הזכות הרחוקה). סרגל בקנה מידה שיבוץ = 10 μm. ראשי חץ לבנים מצביעים על HTTQ97-D2 foci, המתארת אגרגטים. (ג) ערוץ מיזוג תמונה של HTTQ25-D2 עם המרה של אזור הראש. הקופסה מייצגת את החלק. של כל ה -סי. אלאנים שהיו בקרינה סרגל קנה מידה = 100 μm. הזחה מציגה את הפליטה Dendra2 ב 488 nm (למעלה, ירוק) ו ב 561 ננומטר (למטה, אדום). סרגל בקנה מידה = 10 μm. (D) ערוץ מיזוג תמונה של HTTQ97-D2 עם המרה של אזור הראש. סרגל בקנה מידה = 100 μm. Box מייצגת את החלק של כל ה -C. אלאנים שעברו הקרינה מקרני UV. שיבוץ מראה את הפליטה Dendra2 ב 488 nm (למעלה, ירוק) ו ב 561 ננומטר (למטה, אדום). סרגל בקנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: המרה HTT אדום-D2 ירד לאורך זמן בנוירונים בודדים. הזנב הנוירונים של HTTQ25-D2. שני נוירונים מוצגים בו זמנית ובאופן עצמאי פוטומומרת. התמונות מתארות ברצף שלוש נקודות זמן: (א) לפני הקרנה (לפני) (ב) מיד לאחר הקרנה (המרה) ו-(ג) 2 h לאחר הקרנה (אחרי). הפאנל העליון (ערוץ ירוק) מייצג את האות HTT-D2 שנאסף ב 486-553 ננומטר/פליטה nm. האזור הלבן המעניין מדגיש את הנוירונים שעברו הקרינה. הלוח האמצעי (ערוץ אדום) מציג את האות HTT-D2 שהומרה ב580-740 בעירור/פליטה ננומטר. הפאנל התחתון הוא מיזוג של שני הערוצים. סרגל קנה מידה = 5 יקרומטר עבור כל התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: נוירונים בראש וזנב הציגו שיעורי השפלה שונים. תרשימי עמודות מציגים את אחוז העוצמה האדומה ביחס לערך ההתחלתי בזמן ההמרה (כלומר, 100%). סימן אדום Dendra2 המרה ירד הכולל מעל 2 מרווח h כמו HTT-D2 היה מושפל בתוך הנוירונים של C. אלגיה. בתוך מערכת העצבים של המערכת מיני עצבי הציג שיעורי השפלה שונים, עם נוירונים הזנב מראה מחזור פעיל יותר, אבל רק ב nematode נושאת מתיחה polyglutamine שאינה פתוגניים. (א) קוונפיקציה של השפלה ב HTTQ25-D2 הראש נגד נוירונים הזנב. ממוצע ± SD, מבחן t דו-זנבי של סטודנט, לא מזווג. N = 23-28 דגימות/מטודות בתמונה לכל אזור, * P < 0.05. (ב) קוונפיקציה של השפלה ב HTTQ97-D2 הראש נגד נוירונים הזנב. ממוצע ± SD, מבחן t דו-זנבי של סטודנט, לא מזווג. N = 23-28 דגימות/nematodes בתמונה לכל אזור, ns = לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: HTTQ97-D2 לא נוקה באופן משמעותי לאחר 24 שעות. תרשימי עמודות מציגים את אחוז העוצמה האדומה ביחס לערך ההתחלתי בזמן ההמרה (כלומר, 100%). אות אדום המרה Dendra2 ירד כמו HTT-D2 היה מושפל בתוך הנוירונים של ג. אלגיה. HTT-D2 הציגה שיעורי השפלה שונים. אפילו על פרקי זמן ארוכים יותר לאחר ההמרה, לא ניתן להסיר את הפתוגניים HTT-D2 לעומת שליטה בריאה שלה. (א) קוונפיקציה של שיעור השפלה ב HTTQ25-D2 בשתי נקודות זמן לאחר ההמרה (2 h ו 24 h) בשני נוירונים בראש וזנב. ממוצע ± SD, ניתוח בכיוון אחד של סטיה (ANOVA). N = 21-28 דגימות/nematodes התמונה בזמן/אזור, * P < 0.05, * * * * P < 0.0001. (ב) קוונפיקציה של שיעור השפלה ב HTTQ97-D2 בשתי נקודות זמן לאחר ההמרה (2 h ו 24 h) בשני נוירונים בראש וזנב. ממוצע ± SD, ניתוח חד כיוון של שונות (ANOVA) ואחריו בדיקה מרובה השוואה של Tukey.  N = 21-28 דגימות/nematodes בתמונה בזמן/אזור, ns = לא משמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: נמטודות צעירים וותיקים המבטאת htt פתוגניים לא לבזות אותו ביעילות. תרשימי עמודות מציגים את אחוז העוצמה האדומה ביחס לערך ההתחלתי בזמן ההמרה (כלומר, 100%). מומר אדום Dendra2 אות ירד כמו HTT-D2 היה מושפל בתוך הנוירונים. כאשר בגיל נמטודות, יכולתה לבזות את הפתוגניים htt-D2 היה לקוי בנוסף במהלך מערכת העצבים שלה. (א) הקוונפיקציה של שיעור השפלה של הנוירונים בראש של צעיר (יום 4) וישן (יום 10) HTTQ25-d2 נמטודות לעומת גיל התאמה HTTQ97-d2 נמטודות. ממוצע ± SD, ניתוח בכיוון אחד של סטיה (ANOVA). N = 23-28 דגימות/nematodes התמונה לפני מאמץ/יום, * * * * P < 0.0001. (ב) שיעור של השפלה 2 h לאחר ההמרה הנוירונים הזנב של צעירים (יום 4) והישן (יום 10) HTTQ25-d2 nematodes, לעומת גיל מתאימים HTTQ97-d2 nematodes. ממוצע ± SD, ניתוח חד כיוון של שונות (ANOVA) ואחריו בדיקה מרובה השוואה של Tukey. N = 23-28 דגימות/nematodes התמונה לפני מאמץ/יום, * P < 0.05, * * * P < 0.001, * * * * P < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כדי להבין את תפקודי החלבון חשוב להבין את הסינתזה, המיקום וההשפלה שלו. עם פיתוח של רומן, יציב, FPs בהיר, המחשה וניטור POIs הפך קל יותר ויעיל יותר. מבחינה גנטית הביע פפס היתוך כגון Dendra2 ממוקמים באופן ייחודי כדי ללמוד את יציבותו של פוי. עם החשיפה לאור סגול-כחול, Dendra2 מתפרק במיקום מדויק בתוך משולש של חומצות אמינו ששומרו. Fluorophore עובר שינוי מבניים קטן, וכתוצאה מכך משמרת מלאה של ספקטרום מירוק לאדום23. משמרת זו מאפשרת איתור וניטור של כל נקודת מקושר ל-Dendra2. אכן, מבנים אלה היתוך השתמשו לראשונה כדי ליצור מאמץ של כתבת C. אלגיה לחקור את מערכת אוביקוויב-פרוטאסאין בvivo16. Dendra2 היה גם מועסק כדי להבין את הפגיעות של תת נוירואליות סלקטיבית היכולת שלהם להתמודד עם חלבונים polyglutamine מורחבת24, או לפקח על אינדוקציה של התצוגה האוטומטית של מודלים של מחלת העצב המוטורי25.

פרוטוקול מוצג כאן כדי לפקח ב vivo השפלה של huntingtin, הקשורות למחלה-חלבון מועדת לצבירה בצורה לא פולשנית. לאחר שייצר בהצלחה את המודל העצבי של HD, ביטוי Htt-D2 פאן-neuronally, שיעורי הירידה של htt מורחבת ו פתוגניים לעומת המקבילה הפיזיולוגית שלה היו כונו. הבדלים מרשימים נצפו בין תת-מין עצבי, בין מניודות צעירים ובגילאי, ובין היכולת של PN להתמודד עם עומסים של גלוטמין רעילים לאורך זמן. טכניקה זו יכולה גם להיות מיושם על פי המיקום ואת התנועה של huntingtin, כמו גם את גורלה כאשר רטבאליות ל-PN מוצגים. siRNA מנוק של מלווים מרכזיים או הממשל של תרכובות המעכבות פעילות פרוטאסדום יכול לחשוף את הפונקציה ואת החשיבות של רכיבים אלה בחלבונים המתכלים לצבירה: לדוגמה, אם PN מפעיל צמתים ספציפיים כדי לפצות על ליקויים26. זה יכול גם להסביר את ההשפעות מזיקות שנגרמו על ידי מחלה לעומת אלה של הזדקנות נורמלית.

למרות ששאלות שונות רבות ניתן לטפל באמצעות טכניקה זו, פעם אחת המודל הרצוי נוצר, ההמרה הנכונה פרמטרים הזיהוי חייב להיות מבוסס כדי לקבל נתונים אמינים. גם מכריע הוא לקבוע הגדרות המרה המאפשרות תשואה מספקת של חלבון מופעל ללא הלבנת או רעילות וללא המרה בלתי רצויה. יתר על כן, עבור כל חלבון למד בתוך מערכת מודל ספציפית, או לשעבר vivo או בvivo, יש צורך בניסויים להקים תקופת זמן גדולה מספיק כדי לאפשר כימות מדויקת של שיעור הירידה.

Dendra2 מציעה שורה של יתרונות על פני פפס אחרים: 1) הוא monomeric ובהיר מאוד; 2) יש לו המרת תמונה בחדות גבוהה ואות מומרת לתמונות יציבה; 3) זה יכול להיות מופעל עם רעילות נמוכה על ידי כחול 488 ננומטר לייזר, שהוא חלק מרוב הגדרות חומרה קונפוקלית וקד; 4) הוא מתבגר ביעילות ב-37 ° c ליישום בתאי מיונקים; 5) אין לו תופעות לוואי רעילות כאשר הוא מתבטא לפרקי זמן ארוכים של23,27; ו-6) המערכת אינה מושפעת מווריאציות ברמות ביטויים בין או בתוך האורגניזם או התאים, כמו רק את היחס של אות Dendra2 לפני ואחרי ההמרה מכמת. כל המאפיינים המפורטים להפוך Dendra2 fluorophore אידיאלי עבור מעקב אחר הדינמיקה חלבון בזמן אמת ניטור תא הגורל.

למרבה הצער, חלבונים היתוך Dendra2 סובלים כמה מגבלות נפוצות של תוויות חלבון פלורסנט. המבנה הוא מינים של צ'יאריק לעתים קרובות מתבטא מוגזם במערכות ביולוגיות, למרות ביטוי אנדוגניים ניתן להקים באמצעות הנדסה גנומית. שיעור השפלה של Dendra2 עצמו עלול להשפיע על השפלה של חלבון היעד, למרות שהוא התואר כמו חלבון יציב מאוד, ארוך החיים27. יתר על כן, Dendra2 אינו מתאים לעקוב אחר חלבונים עם תהפוכות מהר מאוד כפי שהוא לא יכול להיות זמן להבשלה הנכון שלה. לבסוף, 405 לייזרים nm, אשר נדיר, הם העדיפו מיתוג פוטויעיל, למרות שהם רעילים יותר למדגם. אכן, האור הכחול פוטוטוקסי יכול להיות מנוצל הן להמחיש ירוק Dendra2 ולהמיר אותו כאשר כוח לייזר הוא בעוצמה גבוהה. תכונה זו מסוימת צריך תמיד לזכור, כמו חשיפה ממושכת יפיק המרה לא רצויה ומדידות שגויות פוטנציאלי. לבסוף, זה יכול להיות בעייתי להשתמש Dendra2 בשילוב עם fluorophores ירוק או אדום. עם זאת, פפס רבים שונים זמינים לחקור את הדינמיקה של מספר חלבונים בו זמנית.

ניסויים ניצול Dendra2 ו פפס אחרים קושרו להתאוששות הזריחה לאחר הלבנת (FRAP) ו רדיואקטיבי מרדף שיטות התוויות הדופק. בהגדרת FRAP אי אפשר להבחין חלבונים מחדש הזנת התשואה של חלבון פלורסנט שנוצר לאחרונה, ניטור קבוע והדמיה של המדגם הוא הכרחי. עם Dendra2, שתי אוכלוסיות ברורות להבדיל נוצרות כי ניתן להבחין באופן עצמאי לאורך זמן, כך החליפו ומחליפים בצורה "לא פעילה" של Dendra2 ירוק יכול להיות מעקב וכימות16. Dendra2 הוא גם שימושי בדיקה במיקרוסקופיה ברזולוציה סופר כגון השתקפות פנימית הכולל מיקרוסקופ פלורסנט (TIRF)28 ו-הפעלת פוטומיקרוסקופיה לוקליזציה (PALM)29. בעתיד הקרוב התקדמויות כאלה יאפשר לוקליזציה טובה יותר ופוטנציאלי מעקב יחיד של כל פוי, המאפשר לחשוף הבדלים עדינים יותר בתוך ובין דגימות ובסופו של דבר מניב מידע חדש על החיים והגורל של כל פוי בתוך מערכת ביולוגית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו מכירים את DFG (KI-1988/5-1 לייק, מלגת נוירוקיור PhD על ידי מקבץ המצוינות של נוירוקיור כדי MLP) למימון. אנו מכירים גם את מתקן ליבת ההדמיה של המכון לחקר לייבניץ לפרמקולוגיה מולקולרית ברלין (FMP) לאספקת ההדמיה להגדיר. בנוסף, אנו רוצים להודות לדיוגו פללאנו שהקים את מערכת Dendra2 במעבדה וסיפק הוראות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH + Co. KG 5210.2 NGM component
Agarose, Universal Grade Bio & Sell GmbH BS20.46.500 Mounting slide component
BD Bacto Peptone BD-Bionsciences 211677 NGM component
Deckgläser-18x18mm Carl Roth GmbH + Co. KG 0657.2 Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 Carl Zeiss AG Objective
Fiji/ImageJ 1.52p NIH Analysis Software
Levamisole Hydrochloride AppliChem GmbH A4341 Anesthetic
LSM710-ConfoCor3 Carl Zeiss AG Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope Leica Camera AG Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2 this paper C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2 this paper C. elegans strain
OP50 Escherichia coli CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OP50 Nematode food source
Sodium Chloride Carl Roth GmbH + Co. KG 3957.2 NGM component
Standard-Objektträger Carl Roth GmbH + Co. KG 0656.1 Glass slides
ZEN2010 B SP1 Carl Zeiss AG Confocal acquisition software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, (1), 509-544 (1998).
  2. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85, (08), 45-61 (2008).
  3. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, (11), 885-890 (2005).
  4. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, (8), 2024-2032 (2007).
  5. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24, (4), 461-465 (2006).
  6. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42, (5), 553-565 (2007).
  7. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1, (1), 15005 (2015).
  8. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7, (1), 31-39 (2014).
  9. Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70, (1), 51-65 (2011).
  10. Addgene. Plasmids 101: A Desktop Resource. 3rd Edition, https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition 45-50 (2020).
  11. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  12. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10, (12), 3959-3970 (1991).
  13. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
  14. Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10, (1), 1-13 (2019).
  15. Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
  16. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7, (6), 473-478 (2010).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
  19. Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1-21 (2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  21. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. 1-19 (2005).
  22. Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, (11), 891-898 (2005).
  23. Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48, (22), 4905-4915 (2009).
  24. Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9, (9), 586-594 (2013).
  25. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, (8), 677-685 (2014).
  26. Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
  27. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42, (4), 446-450 (2007).
  28. Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5, (4), 105 (2018).
  29. Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101, (6), 1522-1528 (2011).
ב Vivo פיקציה של מחזור החלבון בהזדקנות <em>C. אלגיה</em> באמצעות Photoconvertible המרה Dendra2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).More

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter