Summary
여기에 제시된 단백질 헌팅틴의 분해를 광변환형 형광소 덴드라2에 융합한 분해를 모니터링하는 프로토콜이 있다.
Abstract
단백질은 항상성을 유지하기 위해 세포 내에서 지속적으로 합성되고 저하됩니다. 관심 있는 단백질의 저하를 모니터링할 수 있다는 것은 수명 주기뿐만 아니라 프로테오스타증 네트워크의 불균형을 발견하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 이 방법은 질병을 유발하는 단백질 헌팅틴의 분해를 추적하는 방법을 보여줍니다. 덴드라2에 융합된 헌팅틴의 두 가지 버전은 C. elegans 신경계에 표현됩니다: 생리적 버전 또는 글루타민의 확장되고 병원성 스트레칭이 있는 것. 덴드라2는 광변환형광단백질; 짧은 자외선(UV) 조사 펄스에 따라 Dendra2는 초록색에서 빨간색으로 여기/방출 스펙트럼을 전환합니다. 펄스-체이스 실험과 유사하게, 새로 합성된 그린 덴드라2의 간섭에 관계없이 변환된 적색-덴드라2의 회전율을 모니터링하고 정량화할 수 있다. 공초점 기반 현미경 검사법을 사용하고 C. elegans의광학 적 투명성으로 인해 살아있는 노화 유기체에서 헌팅틴 덴드라2의 분해를 모니터링하고 정량화 할 수 있습니다. 뉴런 헌팅틴-덴드라2는 변환 직후 부분적으로 저하되고 시간이 지남에 따라 더 지워집니다. 돌연변이 헌팅틴의 존재가 부족하고 노화가 더욱 손상됩니다. 같은 신경계 내의 신경 아류형은 헌팅틴-덴드라2에 대해 서로 다른 회전율을 나타낸다. 전반적으로 Dendra2에 융합된 관심 있는 단백질을 모니터링하면 그 성능 저하및 프로테오스타증 네트워크의 플레이어뿐만 아니라 위치, 인신 매매 및 운송에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있습니다.
Introduction
살아있는 유기체의 프로테아메는 끊임없이 자신을 갱신하고 있습니다. 단백질은 세포의 생리적 요구에 따라 지속적으로 분해되고 합성됩니다. 몇몇 단백질은 빨리 제거됩니다, 그 외는 더 오래 살아있는 반면. 단백질 역학을 모니터링하는 것은 유전자 인코딩형 형광 단백질(FPs)을 사용할 때 더 간단하고 정확하며 덜 침습적인 작업입니다. FPs는 자가촉매를 형성하고 관심있는 단백질 (POI)에 융합 될 수 있지만 산소1을위해 보조 인자를 구하거나 필요로하는 효소를 필요로하지 않습니다. 새로운 세대의 FP는 최근에 결정된 파장의 가벼운 펄스로 조사 시 색상을 전환하도록 설계되었습니다. 이러한 포토액티브ApP(PAFP)는 POI, 또는 그들이 거주하는 세포기관 또는 세포의 라벨링 및 추적을 허용하고, 그들의 정량적 및/또는 질적 파라미터2를검사한다. FP는 POI의 움직임, 방향성, 운동 속도, 확산 계수, 모바일 대 움직이지 않는 분수, 한 셀룰러 컴파트먼트에 거주하는 시간, 회전율을 추적할 수 있게 합니다. 특정 소기관, 운동 및 수송, 또는 핵분열 및 융합 이벤트를 결정할 수 있다. 특정 셀 타입의 경우 셀의 위치, 분할 속도, 부피 및 형상을 확립할 수 있습니다. 결정적으로, PAFP를 사용하면 연속 시각화 없이 새로 합성된 프로브의 간섭 없이 추적할 수 있습니다. 세포와 전체 유기체 에서 모두 연구 결과는 성공적으로 암과 전이의 발달, 세포 골격의 조립 또는 분해, 및 RNA-DNA/단백질 상호 작용3과같은 생체 내생물학적 질문을 해결하기 위하여 PAFPs를 채택했습니다. 이 원고에서, 가벼운 현미경 검사법과 PAFPs는 신경 퇴행성 질병의 C. elegans 모형에 있는 생체내에서 응집되기 쉬운 단백질 헌팅틴 (HTT)의 회전율을 밝히기 위하여 이용됩니다.
여기서 설명된 프로토콜은 융합 단백질 헌팅틴-덴드라2(HTT-D2)의 안정성과 분해를 정량화한다. Dendra2는 UV 또는 가시광선에 대한 응답으로 방출/여기 스펙트럼을 녹색에서 빨간색으로 돌이킬 수 없이 전환하는 2세대 단황 PAFP4로, 최대 4,000배5,,6의강도가 증가한다. 헌팅틴은 치명적인 유전성 신경 퇴행성 질환인 헌팅턴병(헌팅턴병)을 유발하는 단백질이다. 헌팅틴 엑슨-1에는 글루타민(CAG, Q)이 들어 있습니다. 단백질이 39Q 이상으로 표현되면 돌연변이, 독성 및 병원성 단백질로 잘못 접습니다. 돌연변이 HTT는 응집되기 쉽고 짧은 올리고머 종또는 더 큰 고도로 구조화 된 아밀로이드7로뉴런 세포 죽음과 변성으로 이어집니다.
선충은 조작의 용이성, 동종 성질, 짧은 수명 및 광학 투명성8덕분에노화와 신경 변성을 연구하기 위한 모델 시스템입니다. 생체 내에서 HTT의 안정성을 연구하기 위해, 융합 구조는 C. elegans의신경계에서 발현되었다. 25Qs(HTTQ25-D2)의 생리적 스트레치 또는 97Q(HTTQ97-D2)의 병리학적 스트레칭을 포함하는 HTT-D2 트랜스진은 선충의 일생동안팬뉴런으로 과발현된다. 라이브 C. elegans를 짧고 집중적인 빛의 지점에 복종시킴으로써 단일 뉴런이 포토전환되고 변환된 HTT-D2는 시간이 지남에 따라 추적됩니다. HTT-D2의 양을 분해하기 위해, 갓 변환된 HTT-D2의 적색 신호 의 차이는 결정된 기간 후에 HTT-D2의 나머지 적신호와 비교된다. 따라서, 헌팅틴이 생리적 형태에 비해 확장되고 독성이 있는 형태로 발견될 때 헌팅틴이 어떻게 저하되는지 조사할 수 있게 된다. 전방 또는 후방 뉴런이 Q97 대 Q25의 존재에 다르게 반응하는 방법, 특히 장기간에 걸쳐; 노화 중 프로테오스타증 네트워크(PN)의 붕괴가 저하율의 차이에 어떻게 기여하는가. 이러한 결과는 HTT-D2의 회전율에 대한 작은 관찰 집합에대해서만 설명합니다. 그러나, 단백질 응집 및 proteostasis의 필드에 관련있는 더 많은 생물학 질문은 생체 응용에서 이것으로 해결될 수 있습니다.
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Protocol
1. 뉴런 헌팅틴-덴드라2 융합 단백질을 표현하는 C. 엘레간 세대
- 기존의 제한 효소다이제스트(10),깁슨 어셈블리(11) 또는 임의의 선택 방법에 의해 선충발발11벡터(즉, pPD95_75, addgene #1494)에서 POI를 코딩하는 유전자를 복제한다. 프로모터를 삽입하여 원하는 조직 또는 원하는 발달 단계에서 발현을 유도합니다. DENdra2 플루오로포어를 POI와 함께 프레임에 N-또는 C-말단을 삽입합니다.
- 융합 구조를 발현하는 형질전환 C. 엘레간을 생성한다(예를 들어, 미세 주입을 통해)12.
참고: 트랜스진을 운반하는 플라스미드는 초염색체 배열로 유지됩니다. 구문 통합은 필요하지 않지만 원하는 경우 수행할 수있습니다(13). 본 프로토콜에서, C. elegans는 범뉴신경 프로모터 Prgef-1의통제 하에 융합 구조물 헌팅틴 엑슨 1-Dendra2 (HTT-D2)를 운반하는 플라스미드로 마이크로인주사하였다. C. elegans 발현 백본은 크리스 외14로부터얻어졌으며, 헌팅틴 엑슨 1은 Q25 또는 Q97을 통해 주네만 외15로부터얻어졌고, 덴드라2는 해머 외16로부터입수되었다.
2. C. 예인자의 연령 일치 및 유지 보수
- 나이는 알칼리성 하이포염소염 용액처리(17)와 동기화하거나 20°C에서 4시간 동안 누워있는 계란을 통해 모든 선충과 일치합니다. 계란 누워의 경우, 갓 씨를 뿌린 선충 성장 매체(NGM) 접시에 10명의 중력 성인을 놓고 제거하기 전에 4시간 동안 둡니다. 이 기간에 놓인 계란은 동기화 된 선충을 낳을 것입니다.
- 선충 성장 매체(NGM) 플레이트에 실험C. 예레간을 보관하여 세균식품원천 E. 대장균 OP50과 함께 시종하고, 표준 선충축축(18)에 따라 한다.18
- 원하는 단계로 20 °C에서 선충을 성장. 이 프로토콜의 경우 필요한 연령은 4일과 10일입니다.
참고: 4일째의 청년 성인은 곤나드에 계란이 있고 이동성이 높은 것으로 식별할 수 있습니다. 숙성일 10선충은 비옥후이며, 조직 악화 및 기관차 감소19. - 10일째선에는 선충이 비옥한 3일째L4 단계 이후 매일 통로를 통과하여 혼혈을 피한다.
3. 이미징용 현미경 슬라이드 준비
- 이미징 당일 현미경 슬라이드를 준비합니다. 전자레인지에서 일반급 아가로즈를 3%(w/v)의 농도로 ddH2O.로 녹여 약간 식힙니다.
- 1mL 파이펫 팁의 끝을 자르고 약 400 μL의 녹은 아가로즈를 흡인합니다. 깨끗한 유리 슬라이드에 아가로즈 몇 방울을 부드럽게 놓고 즉시 다른 슬라이드를 위에 놓아 두 사이에 아가로즈의 얇은 패드가 생성되도록합니다. 부드럽게 미끄러지거나 상단 슬라이드를 들어 올리기 전에 말리십시오.
- 아가로즈 패드 슬라이드를 가습 용기에 넣고 건조하지 않도록 하십시오. 이들은 2-3 시간 안에 사용할 수 있습니다.
참고 : 선충이 안에 갇혀 있을 수 있기 때문에 아가로즈에 작은 거품이 형성되지 않도록하십시오.
4. 공초점 현미경 매개 변수의 정의
참고: 선충 및 데이터 수집을 장착하기 전에 공초점 획득 소프트웨어의 모든 설정을 정의합니다. 설정은 선택한 이미징 하드웨어 및 소프트웨어에 맞게 조정할 수 있습니다.
- 공초점 소프트웨어를 열고 레이저 이미징 설정을 정의합니다. 486-553 nm에서 녹색 Dendra2에 대한 흥분 / 방출을위한 광 경로를 설정하고 빨간색 Dendra2의 경우 580-740 nm에서 설정합니다. 플루오로포어의 강도에 따라 두 채널/레이저의 힘과 게인을 조정합니다. 디지털 게인 또는 오프셋을 변경하지 말고 핀홀을 완전히 열것으로 설정하지 마십시오.
- 획득 설정 정의: 순차채널 모드를 선택하고 모든 프레임을 추적합니다. 스캔 모드를 프레임으로 설정하고 프레임 크기를 1,024 x 1,024로 설정하고 라인 스텝은 1로 설정합니다. 평균을 2로 설정하고, 단방향 선의 평균 방법과 모드로 평균을 설정합니다. 비트 깊이를 8비트로 설정합니다.
- Dendra2 변환을 위한 다차원 획득 설정을 정의합니다. 변환 및 표백을 위해 60%의 에너지 출력으로 설정된 405 nm 다이오드 레이저를 사용하십시오. 사용 가능한 경우 안전한 표백 GaAsP를 활성화하여 검출기를 보호합니다.
- 0.0ms 간격과 일반 시작 및 중지가 있는 두 사이클의 시간 시리즈를 선택합니다. 2 중 1을 스캔한 후 표백을 시작하고 30회 반복을 반복합니다. 강도가 50 %로 떨어지면 표백을 중지합니다.
- 스냅 이미지를 캡처하기 위한 획득/픽셀 의 속도(예: 최대 =12)와 중간 속도(예: 중간 =5)를 정의합니다.
참고: 여기에 정의된 표백 매개 변수는 지침입니다. 다른 Dendra2 태그 POI의 경우 레이저 전원 설정 및 표백 반복 및 값을 경험적으로 확립해야 합니다.
5. 현미경 슬라이드에 C. 예레건의 장착
참고: 가능하면, 공초점 현미경 설정에 가까운 장착 스테레오 현미경을 배치하고 이미징 직전에 선충을 장착하십시오.
- 아가로즈 패드 의 반대편에있는 유리 커버 슬라이드에 영구 마커가있는 4 개의 사각형이있는 창을 그리고 번호가 매겨지십시오.
- 아가로즈 패드 의 중간에 레파미솔의 파이펫 15 μL. 레바미솔의 농도는 선충의 나이에 따라 달라집니다: 이미징 일 4 선충이 2 mM 레바미솔을 사용하는 경우; 화상 진찰일 10일 선충이 0.5 mM 레바미솔을 사용하는 경우.
- 와이어 픽을 사용하여 4개의 선충을 액체로 옮기습니다. 속눈썹 피크의 도움으로 각 개별 선충을 창 사각형으로 부드럽게 이동합니다. 대장균 OP50의 흔적이 희석되고 형광 배경이 신호 수집을 방해하지 않도록 속눈썹을 회전시하십시오.
- 선충이 거의 움직이지 않을 때까지 기다렸다가 액체 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓아 아가로즈 패드와 커버 슬립 사이의 레바미솔 층의 선충을 고정하십시오.
- 반전된 슬라이드를 공초점 단계에 배치하여 선충을 이미지화합니다.
6. 녹색 Dendra2의 변환: 시간 제로에서 데이터 수집
참고: 펄스-체이스 실험은 덴드라2 융합 단백질을 녹색 방출 형광에서 빨간색 단백질로 돌이킬 수 없이 변환하는 것으로 시작합니다.
- 현미경의 안구를 사용하여 녹색 형광하에서 20 배 의 목표를 가진 첫 번째 선충을 찾습니다. 머리 또는 꼬리에 초점을 맞추고 공초점 모드로 전환합니다.
- EGFP 그린 채널(예/em = 486-553 nm)에서 녹색 덴드라2를 시각화하려면 488nm 블루 레이저로 라이브 레이저 스캐닝을 시작합니다. 단일 뉴런을 선택하고 초점을 맞춥니다. 3배 확대하여 레이저 빔4의대상을 늘립니다.
참고: 선충당 하나의 뉴런을 선택합니다. 각 뉴런은 하나의 샘플 또는 데이터 요소를 구성합니다. - 최대 프로젝션 평면을 찾아, 플루오로포어의 밝기에 따라, 색상 범위 표시기에 의해 식별되는 포화되었지만 과노출된 이미지를 얻기 위해 게인 또는 레이저 전력을 증가 또는 감소시킵니다. 이 작업이 정의된 후에는 스캔을 중지합니다.
참고: 눈에 보이는 파란색 488 nm 빛과 함께 자궁어창이 덴드라2를 변환할 수 있으므로 너무 오래 또는 너무 많은 힘으로 샘플을 조사하지마십시오. - 소프트웨어에서 탭을 열어 관심 영역(ROI)을 선택하고 선택한 뉴런 주위에 첫 번째 ROI를 그립니다. 선충의 머리를 포괄하고 첫 번째 ROI를 포함하는 더 큰 두 번째 관심 영역을 정의합니다.
- 표백 설정에서, 획득, 표백 및 분석될 첫 번째 ROI를 선택한다. 두 번째 ROI를 획득하고 분석하지만 표백하지 않도록 선택합니다.
- 스캔 속도를 최대(즉, 빠른 픽셀 거주)로 설정하고 선택한 Dendra2 뉴런을 변환하는 실험을 시작합니다.
참고: 실험이 완료되면 획득한 그림의 두 이미지가 생성됩니다: 변환 후 1개. 녹색 채널의 경우 첫 번째 이미지는 녹색 Dendra2의 변환으로 인해 두 번째 이미지에서 감소하는 녹색 신호가 높아야 합니다. 빨간색 채널의 경우 첫 번째 이미지는 음수여야 하며 변환 후 이미지에 빨간색 신호가 나타나는 신호가 표시되지 않아야 합니다. 녹색 신호가 감소하지 않으면 변환이 발생하지 않았으며 405 레이저 전원 또는 반복 횟수와 같은 설정을 수정해야 합니다. 첫 번째 이미지에 빨간색 신호가 있는 경우 사용된 488 nm 레이저 전력이 너무 높았고 녹색 Dendra2의 일부가 이미 빨간색으로 변환되었습니다. 이 경우 새로운 뉴런/선충을 선택해야 합니다. - 변환 직후 녹색 561 nm 레이저로 라이브 스캐닝을 시작하여 빨간색 채널에서 Dendra2를 시각화합니다(예/em = 580-740 nm). 과다 노출을 피하기 위해 범위 색상 표시기를 사용하여 변환 된 뉴런의 초점과 각각의 최대 투영을 찾습니다.
- 스캔 속도를 낮은 픽셀 거주 속도(예: 5x)로 빠르게 설정하고 더 높은 해상도로 두 채널의 스냅샷 이미지를 획득합니다. 이 이미지는 변환 후 시간점 0(T0)으로 정의됩니다.
참고: 변환된 이미지에 대한 획득 속도는 다양할 수 있습니다. 그러나 일단 선택되면 이 속도는 데이터 수집 전반에 걸쳐 일정하게 유지되어야 합니다. - 식별 가능한 이름 및/또는 번호로 스캔을 저장한 다음 시간 제로 레이블(T0)이 뒤따릅니다.
참고: 변환 실험(단계 6.6)의 이미지를 저장하여 변환 전에 적신호가 부족하고 그 이후에 나타나는 것을 설명하는 것이 좋습니다.
7. 선택한 두 번째 시점에서 데이터 수집을 위해 변환된 빨간색 Dendra2 이미징
- 시간이 지남에 따라 Dendra2 저하를 추적하려면 두 번째 시간점을 정의하여 동일한 선충/뉴런을 다시 이미지화합니다. 두 번째 시간점을 실험적으로 선택하여 관련 생물학적 문제를 해결합니다. 여기서 설명된 프로토콜의 경우 Dendra2는 2h(T2) 및 24h(T24) 포스트 변환에서 모두 이미지화됩니다.
- 선택한 시점에서, 접안과 적색 형광을 사용하여 동일한 선충 / 뉴런을 찾습니다.
- 각 선충/뉴런의 T0 이미지를 열고 이미지 설정을 다시 로드/재사용합니다. T0, T2 및 T24 h 이미지를 획득할 때 스냅숏의 획득 설정이 정확히 동일한지 확인합니다.
- 빨간색 채널에서 라이브 스캔을 하고 변환된 빨간색 뉴런을 초점으로 가져옵니다. 빨간색 Dendra2가 시간이 지남에 따라 저하되므로 범위 표시기는 덜 강렬한 최대 투영을 표시합니다. 획득 매개 변수를 변경하지 말고 첫 번째 이미지와 동일한 속도(예: 5x)로 스냅샷을 가져오지 마십시오.
- 4시간 이상 후에 Dendra2의 분해를 추적하려면 변환 후 선충을 구출하십시오.
- 4개의 선충을 변환하고 화상 진찰한 후에 즉시 현미경에서 슬라이드를 제거합니다. 커버슬립을 부드럽게 제거하고 와이어 픽을 사용하여 아가로즈 패드에서 각 선충을 들어 올립니다.
- 각 선충을 적절히 표시하고 식별 가능한 NGM 플레이트에 개별적으로 배치합니다.
- 두 번째 시간 지점에 대해 선충을 신선한 아가로즈 패드에 다시 장착하고 6절의 지침에 따라 변환된 빨간색 Dendra2의 이미징을 진행한다.
8. 변환 된 덴드라2의 이미지 분석
참고 : 덴드라2의 저하의 분석은 피지 / ImageJ 소프트웨어20으로수행됩니다.
- 피지를 열고 드래그 피지 바에 .lsm 파일을 드롭. 변환 직후 촬영한 T0 이미지와 변환 후 선택한 시점에서 촬영한 동일한 선충의 이미지를 엽니다(T2 또는 T24 h).
참고: Dendra2에 융합된 관심 있는 단백질의 분해를 추적하려면 적색 채널만 분석할 필요가 있다. - 메뉴에서 측정 매개 변수 설정: 분석 | 측정값을 설정합니다. 영역 및 통합 밀도 함수를 선택합니다.
- 빨간색 채널에서 얻은 이미지를 선택합니다. 피지 바에서 다각형 선택 도구를 선택합니다.
- T0 이미지에서 변환된 뉴런을 식별하고 선택 도구를 사용하여 ROI를 그립니다.
- 뉴런의 윤곽을 제대로 식별하려면 막대 이미지에서 선택하여 강도 임계값을 강조 표시 | 조정 | 임계값. 막대 커서를 드래그하여 임계값을 표시하고 다각형 도구를 사용하여 이 영역을 추적합니다. 정확한 ROI를 생성하기 위해, 녹색 채널에서 선택한 뉴런의 윤곽을 사용할 수도 있다.
- 빨간색 채널 창에서 선택된 후 분석 | 측정합니다. 결과라는 팝업 창이 나타나고 영역,IntDen 및 RawIntDen에대한 ROI 값이 포함됩니다. IntDen
- 두 번째 시간 점(T2 또는 T24 h)의 이미지에 대해 동일한 선택 및 측정 프로세스를 수행합니다.
- 얻은 값을 스프레드시트 소프트웨어에 복사하여 변환 후 T0및 변환 후 T2 또는 T24 h에서 값을 적절하게 기록합니다.
9. 덴드라2 분해비율 계산
- 분해 비율을 계산하려면 먼저 값을 1(또는 100%)으로 할당합니다. 시간 까지 시간 지점 0에서 저하 (즉, 변환 직후, 모든 빨간색 Dendra2 변환이 여전히 존재하는 경우). 이는 T0의 IntRawDen 값을 그 자체로 나눈 결과입니다.
- 시간에 따른 적색 덴드라2 강도 신호의 감소를 계산하고, 열화, 두 번째 시간 점(예: T2 또는 T24 h)의 RawIntDen값을 T0의 RawIntDen값으로 나눕니다. 결과 수는 1보다 적어야 합니다. 이러한 값은 T0을 100%로 정의하는 백분율로 표현할 수도 있습니다.
- 변환된 각 선충에 대해 7절을 반복합니다. Dendra2의 저하를 그래픽으로 표현하기 위해 y 축에서 얻은 형광 감소의 백분율 또는 비율 값을 가진 분산 플롯 또는 막대 그래프를 차트로 표시합니다. 원하는 통계 분석을 적용하고 그래프에 설명합니다.
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Representative Results
광변환 단백질 Dendra2와 함께 프레임에서 헌팅틴 엑슨-1 단백질 단편을 발현하는 두 개의 선충균은 미세 주입을 통해 수득되었고 플라스미드는 엑스트라크로모솜 배열로 유지되었다. 융합 구조는 노화를 통해 개발에서 전체 C. elegans 신경계에서 표현되었다. 여기서, HTT-D2는 생리학적 25폴리글루타민 스트레치(HTTQ25-D2, 도 1A)또는 97글루타민(HTTQ97-D2, 도 1B)을함유한 완전 관통및 병원성 반복을 포함하였다. 처음에 융합 단백질은 UV 조사에 그것의 녹색 스펙트럼에서 그것의 적색 스펙트럼으로 변경되었는지 확인하기 위하여 시험되었습니다. HTT-D2는 조명된 영역 내에서만 녹색에서 빨간색으로 성공적으로 전환되었습니다. UV 펄스의 전력 및 반복에 따라 선충의 표피를 통해 레이저 빔의 z-평면 및 침투에 따라 HTT-D2의 정의된 부분이 변환되었지만 전부는 아닙니다. 광변환 된 뉴런 내에서 빨간색 신호가 나타났으며 녹색 비변환 된 HTT-D2(도 1C, D)와공존합니다. 레이저 스캐닝 광자 빔의 정확도로 인해 단일 뉴런에 대응하는 정확한 ROI를 변환할 수 있었다. 변환하기 전에 샘플이 빨간색채널(그림 2A)에서흥분했을 때 빨간색 신호가 표시되지 않았습니다. UV 조사에 따라 HTT-D2가 변환되고 빨간색 신호가 마지막으로 나타났을 때 녹색 신호가 감소했습니다(그림2B). HTT-D2는 시간이 지남에 따라 저하되어 적색 HTT-D2(도Figure 22C)의수치가 감소하고 더 많은 융합 단백질이 새로 합성됨에 따라 녹색 HTT-D2 신호의 증가가능성을 초래하였다. 전환 후 2h에서 이미 현저한 감소가 두드러졌기 때문에 HTT-D2의 분해를 감지하고 정량화하기 위한 간격이 유지되었습니다. 성능 저하가 HTT-D2를 변환한 후에 발생할 수 있는 유일한 프로세스는 아닙니다. 변환된 HTT-D2는 축축을 따라 인신 매매및 수송될 수 있으며, 그 결과 클리어런스로 인한 것이 아닌 빨간색 신호가 감소할 수 있습니다. 그러나, 여기에 2 h의 짧은 시간 동안 사용 된 설정으로, 붉은 신호의 확산이 관찰되지 않았다, 아마도 작은 HTT-D2가 축산으로 소마에서 이동했다는 사실로 인해. 더욱이, 단일 전체 뉴런 소마를 변환하고 이미징하는 것은 모든 세포 구획이 동시에 분석되고 있었기 때문에 동일한 뉴런 내에서 HTT-D2 확산의 효과를 배제하는 데 도움이되었습니다. 확산 또는 운송/인신매매를 모두 연구하려면 빠르고 높은 배율 이미지를 얻고 관심 있는 단백질의 더 작고 아마도 더 많은 분획을 추적하는 것이 좋습니다. 또한 실험 세트 내에서 각 동물이 하나의 생물학적 반복을 나타냈다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 선충당 한 개의 뉴런만 이미지화되었고, 각 동물은 세션당 한 번 이미지화되었으며, 세 번의 세션에서 이미징이 발생하여 기술적 반복을 구성했습니다. 세 번의 세션은 각 실험 전 4일또는 10일째에 동물을 신선한 접시에 동기화하여 선충에 어떤 환경 가변성이 부과되도록 해야 했습니다. 세 세션은 또한 이미징 설정에서 발생하는 모든 가변성을 설명합니다(예: 실험 간의 온도가 다르기 때문에 레이저 전력이 다양합니다). 3개의 세션(최소 20마리의 동물)에서 얻은 모든 생물학적 복제는 개별 적인 견본으로 간주되고 통계적 유의를 확립하기 위하여 이용되었다.
두 C. elegans HTT-D2 균주가 효과적이고 최적의 변환 매개 변수를 확립한 후, 질병을 유발하는 HTT-D2 단백질(즉, HTTQ97-D2)의 회전율(즉, HTTQ97-D2)의 이체가 생리학적으로 관련된 대조군(HTTQ25-D2)에 비해 조사되었다. 첫째, 다른 뉴런에서 HTT-D2의 분해가관찰되었다(도 3). 선충의 신경계 내의 뉴런의 특수형은 대사 활동과 형태21에서다양하며, 아마도 프로테아메의 분해및 재조정에 차이를 만드는 것으로 알려져 있습니다. 꼬리 영역의 뉴런은 머리의 신경과 비교되었고 훨씬 더 활동적인 것으로 나타났습니다(도 3A). 이 발견은 HTTQ25-D2에 대해서만 유효하며 병원성 HTTQ97-D2에 대해서만 유효하며, PN이 신경계 전체에 걸쳐 더 긴 글루타민을 함유한 HTT-D2를 제거할 수 없음을 시사합니다(그림3B).
모델 시스템이 예상대로 행동함을 더욱 확인하기 위해, 변환 실험은 장기간 에 걸쳐 수행되어 세포의 분해 경로가 거의 완전히 관심있는 단백질을 제거할 수 있게하였다(도 4). 실제로, 헤드 뉴런에서 2h 후보다 변환 후 제어 HTTQ25-D2 24 h의 훨씬 더 저하가 있었고, 꼬리 뉴런(도4A)에서광범위하게 더 많이 하였다. 다시, 후방 꼬리 뉴런 더 적극적으로 레드 HTT-D2를 제거, 심지어 증가 된 기간 동안. 24h 이상 적색 HTT-D2 신호의 매우 약간의 감소와 함께 질병을 일으키는 HTTQ97-D2에 대해 유사한 경향이 검출되었습니다. 그러나 HTTQ97-D2는 HTTQ25-D2만큼 쉽게 제거되지 않았으며, 특히 24시간 이후에는 제거되지 않았습니다. 수용성 HTTQ97-D2 분획만 효율적으로 저하되어 빨간색 신호의 초기 감소와 시간이 지남에 따라 더욱 가벼운 감소를 고려할 수 있습니다. 중요 하게도, 24 시간 후에 뉴런의 두 개의 인구가 있었다: 더 높은 저하율을 가진 하나 및 적색 HTT-D2 신호가 전혀 저하되지 않은 하나, 또는 잠재적으로 증가(그림 4B). 증가되고 안정된 신호는 아마도 그들의 단단히 포장된 아밀로이드 자연 때문에 세포에서 지우기 실질적으로 더 어려웠던 이미 집계되거나 지속적으로 응집되는 종을 나타냅니다. 글루타민 이40반복 임계값을 초과하고, 현미경으로 포시로 나타난 이러한 포함물은쉽게제거할 수 없는 퇴적물(22)으로 축적되기 위해 가설이 되었다. 또한 적색 형광 신호의 증가는 기술적 문제(예: 잘못된 획득 파라미터 사용, 현미경 설정의 하위 파 성능 또는 잘못된 복구/마운팅 프로세스)로 인한 아티팩트일 수도 있습니다. 장기간 이미지를 획득할 때 이러한 변수를 고려해야 합니다.
마지막으로, 성인 생활에서 HD와 같은 신경 퇴행성 질환이 나타나기 때문에 HTT-D2 저하속도에 대한 노화의 효과가 관찰되었다. 변환 실험은 HTT-D2 균주(도5)에서이전(10일) 선충제 대 젊은(4일)의 머리와 꼬리 부위에서 수행하였다. 헤드 뉴런의 경우 HTTQ25-D2 및 HTTQ97-D2의 수명 내에 노화로 인한 저하 속도에 큰 변화가 없었으며, 아마도 HTT-D2가 각 선충의 수명 동안 동등하게 제거되었기 때문일 수 있습니다. 그러나, 병리학 적 또는 생리 글루타민 스트레칭을 포함하는 오래된 선충을 비교할 때 매우 중요한 변화가 기록되었다. HTTQ97-D2는 HTTQ25-D2만큼 효율적으로 저하되지 않았으며, 구선충에서 포팅및 독성 종을 제거하지 못하는 PN의무능력(그림 5A)을강조했다. 다시 말하지만, 꼬리 뉴런에서 더 활동적이고 중요한 회전율을 관찰했다. 헤드 뉴런에서와 마찬가지로, HTTQ25-D2의 더 강력한 회전율은 이전 코호트에 비해 젊은 선충의 꼬리 뉴런에서 관찰되지 않았으며, 분해는 4일째와 10일째에 동일했다. 반대로, 대조군과 병원성 HTT-D2 균주 사이의 저하율에 있는 중요한 변경은 10일에 더욱 중요해지고, 젊은 날 4 선충에서 나타났습니다. 중요한 것은, 꼬리 뉴런은 젊은 선충에서 독성 HTTQ97-D2에 대처할 수 있었고, 다양한 수반되는 PN 메커니즘이 HTT-D2(그림5B)를제거하기 위해 작업할 수 있음을 알 수 있었다. 전반적인, PN 활동 시간이 지남에 따라 감소, 아마도 노화와 집계의 존재에 의해 발생 하는 해로운 효과.
그림 1: C. 엘레간스는 신경계에서 덴드라2에 융합된 헌팅틴 엑슨-1을 표현했다. (A)젊은, 4일제염은 25개의 글루타민을 함유한 헌팅틴 엑슨-1을 신경질적으로 표현하며, 변환되지 않은 녹색 여기/방출 상태에서 덴드라2에 융합되었다. 스케일 바 = 100 μm. 인셋은 헤드(위)와 꼬리(아래) 뉴런의 확대된 이미지를 보여줍니다. 인셋 스케일 바 = 10 μm.(B)영, 4C. 엘레간은 97글루타민을 함유한 헌팅틴 엑슨-1을 발현하고, 변환되지 않은 녹색 여기/방출 상태에서 덴드라2에 융합되었다. 스케일 바 = 100 μm. Inset은 꼬리(위)와 헤드(아래) 뉴런, 그리고 하루 7선충(맨 오른쪽)의 머리를 확대한 이미지를 보여준다. 인셋 스케일 바 = 10 μm. 화이트 애로우헤드는 헌팅틴 골재를 묘사하여 HTTQ97-D2 포시를 가리킵니다. (C)헤드 리전의 변환과 HTTQ25-D2의 채널 병합 이미지. 상자는 UV 조사 된 전체 C. 느릅 함의 일부를 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. 인셋은 488 nm (상단, 녹색)와 561 nm (아래, 빨간색)에서 Dendra2 방출을 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm.(D)헤드 영역의 변환과 HTTQ97-D2의 채널 병합 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 상자는 UV조사된 전체 C. 예르간의 일부를 나타냅니다. 인셋은 488 nm (상단, 녹색)와 561 nm (아래, 빨간색)에서 Dendra2 방출을 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 변환 된 빨간색 HTT-D2 단일 뉴런에서 시간이 지남에 따라 감소. HTTQ25-D2의 꼬리 뉴런. 두 개의 뉴런이 동시에 독립적으로 광변환된 것으로 표시됩니다. 이미지는 순차적으로 세 가지 시간 지점을 묘사 :(A)조사 전 (이전),(B)조사 (변환) 직후,(C)2 조사 후 (후). 상단 패널(녹색 채널)은 486-553 nm 여기/방출에서 수집된 HTT-D2 신호를 나타냅니다. 관심의 백색 지역은 조사된 신경세포를 묘사합니다. 중간 패널(빨간색 채널)은 580-740 nm 여기/방출에서 수집된 변환된 HTT-D2 신호를 나타낸다. 하단 패널은 두 채널의 병합입니다. 모든 이미지의 배율 막대 = 5 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 머리와 꼬리 뉴런은 다른 저하율을 나타냈다. 열 막대 그래프는 변환 시점의 초기 값(예: 100%)에 비해 적색 강도의 백분율을 표시합니다. HTT-D2가 C. elegans의뉴런 내에서 저하됨에 따라 변환된 빨간색 Dendra2 신호는 2h 간격동안 전체적으로 감소하였다. 선충의 신경계 신경 부유형 내에서 다른 저하 율을 나타냈다, 더 적극적인 회전율을 보여주는 꼬리 뉴런, 하지만 비 병원성 폴리 글루타민 스트레칭을 들고 선충에서만. (A)HTTQ25-D2 헤드대 꼬리 뉴런의 분해를 정량화한다. 평균 ± SD, 짝이 없는 두 꼬리 학생의 t-테스트. N = 23-28 리전당 이미지된 23-28개의 샘플/선충, *P< 0.05. (B)HTTQ97-D2 헤드 대 꼬리 뉴런의 분해를 정량화한다. 평균 ± SD, 짝이 없는 두 꼬리 학생의 t-테스트. N = 23-28 개의 샘플 / 선충은 지역당 이미지, ns = 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: HTTQ97-D2는 24시간 이후에 크게 지워지지 않았다. 열 막대 그래프는 변환 시점의 초기 값(예: 100%)에 비해 적색 강도의 백분율을 표시합니다. HTT-D2가 C. 엘레건의뉴런 내에서 저하됨에 따라 변환된 빨간색 Dendra2 신호가 감소하였다. HTT-D2는 다른 저하율을 나타냈다. 전환 후 오랜 기간 동안에도 병원성 HTT-D2는 건강한 대조군과 비교하여 제거할 수 없었습니다. (A)머리와 꼬리 뉴런 모두에서 전환 후 두 시간 지점에서 HTTQ25-D2의 분해 속도를 정량화한다. 평균 ± SD, 분산의 단방향 분석 (ANOVA). N = 시간/지역당 이미지된 21-28샘플/선충, *P< 0.05, ****P< 0.0001. (B)머리와 꼬리 뉴런 모두에서 전환 후 두 시간 지점에서 HTTQ97-D2의 분해 속도(2h 및 24h)의 정량화. 평균 ± SD, 분산 (ANOVA)의 단방향 분석 다음 Tukey의 다중 비교 포스트 hoc 테스트. N = 시간/지역당 이미지된 21-28개의 샘플/선충, ns = 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 병원성 HTT-D2를 표현하는 노인과 젊은 선충은 이를 효율적으로 저하시키지 않았다. 열 막대 그래프는 변환 시점의 초기 값(예: 100%)에 비해 적색 강도의 백분율을 표시합니다. HTT-D2가 뉴런 내에서 저하됨에 따라 변환된 빨간색 Dendra2 신호가 감소하였다. 선충이 노화됨에 따라 병원성 HTT-D2를 저하시키는 능력은 신경계 전반에 걸쳐 추가로 손상되었습니다. (A)노화와 일치하는 HTTQ97-D2 선충에 비해 젊은(4일) 및 구(10일) HTTQ25-D2 선충의 헤드 뉴런에서의 분해 율의 정량화. 평균 ± SD, 분산의 단방향 분석 (ANOVA). N = 23-28 샘플/선충체는 변형/일당 이미지, ****P & 0.0001. (B)노화와 일치하는 HTTQ97-D2 선충에 비해 젊은(4일) 및 구(10일) HTTQ25-D2 선충제에서 전환후 2h의 분해율. 평균 ± SD, 분산 (ANOVA)의 단방향 분석 다음 Tukey의 다중 비교 포스트 hoc 테스트. N = 23-28 샘플/선충체는 변형/ 일당 이미지, *P & 0.05, ***P & 0.001, ****P & 0.0001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
단백질의 기능을 이해하려면 합성, 위치 및 저하를 이해하는 것이 중요합니다. 소설, 안정적이고 밝은 FP의 개발로 POI를 시각화하고 모니터링하는 것이 더 쉽고 효율적입니다. Dendra2와 같은 유전적으로 발현된 융합 PAFP는 POI의 안정성을 연구하기 위해 독특하게 배치됩니다. 보라색-청색 광에 노출되면 Dendra2는 보존된 아미노산의 삼합체 내에서 정확한 위치에서 휴식을 취합니다. 불소는 작은 구조적 변화를 겪으며, 그 결과 스펙트럼이 녹색에서 빨간색23으로완전히 바뀝니다. 이 시프트를 통해 Dendra2에 연결된 POI를 감지하고 모니터링할 수 있습니다. 실제로, 이러한 융합 구조는 먼저 생체16에서유비퀴틴 프로테솜 시스템을 연구하기 위해 C. elegans 기자 변형을 만드는 데 사용되었다. Dendra2는 또한 선택적 뉴런 아류형의 취약성과 확장된 폴리글루타민단백질(24)을다루는 능력, 또는 운동 신경질환(25)의모델에서 자가식 유도를 모니터링하는 능력을 이해하기 위해 사용되었다.
프로토콜은 비침습적 방식으로 질병 관련 응집 경향이 단백질인 헌팅틴의 저하를 생체 내에서 모니터링하기 위해 여기에 제시된다. 성공적으로 헌팅턴병의 뉴런 C. 엘레간 모델을 생성한 후, HTT-D2 를 팬뉴런으로 표현한 후, 생리적 대응에 비해 확장및 병원성 HTT의 분해율을 정량화시켰다. 눈에 띄는 차이는 뉴런 아류형, 젊고 숙성된 선충 사이, 그리고 시간이 지남에 따라 독성 글루타민 부하를 처리하기 위해 PN의 용량 사이에서 관찰되었다. 이 기술은 또한 PN에 대한 혼란이 도입 될 때 헌팅틴의 위치와 움직임뿐만 아니라 운명을 따라 적용 할 수 있습니다. 주요 보호자의 siRNA 넉다운 또는 프로테좀 활성을 억제하는 화합물의 투여는 응집되기 쉬운 단백질에서 이러한 성분의 기능과 중요성을 발견할 수 있습니다: 예를 들어, PN이 결핍을 보상하기 위해 특정 노드를 활성화하는지여부(26). 그것은 또한 정상적인 노화의 그들에 비해 질병에 의해 발생 하는 해로운 효과 설명할 수 있습니다.
이 기술을 사용하여 많은 다른 질문을 해결할 수 있지만 원하는 모델이 생성되면 신뢰할 수 있는 데이터를 얻으려면 올바른 변환 및 검색 매개 변수를 설정해야 합니다. 또한 중요한 것은 광표백이나 광독성 없이 원치 않는 변환 없이 활성화된 단백질의 충분한 수율을 허용하는 변환 설정을 결정하는 것입니다. 더욱이, 특정 모델 시스템 내에서 연구된 모든 단백질에 대해, 전생체 또는 생체 내에서, 분해율의 정확한 정량화를 허용하기에 충분한 기간의 기간을 실험적으로 확립할 필요가 있다.
Dendra2는 다른 PAFP에 비해 일련의 장점을 제공합니다: 1) 단명하고 매우 밝습니다; 2) 높은 대비 광변환 및 안정적인 광변환 신호를 가지고; 3) 그것은 대부분의 공초점 하드웨어 설정의 일부인 파란색 488 nm 레이저에 의해 낮은 광독성으로 활성화 될 수있다; 4) 포유류 세포에 적용을 위해 37°C에서 효율적으로 성숙; 5) 그것은 시간의 연장 된 기간 동안 표현 될 때 독성 부작용이 없습니다23,,27; 및 6) 시스템은 변환 전후의 Dendra2 신호의 비만이 정량화되기 때문에 유기체 또는 세포 사이의 또는 세포 내의 발현 레벨의 변화에 의해 영향을 받지 않는다. 나열된 모든 특성은 Dendra2를 실시간으로 단백질 역학을 추적하고 세포 운명을 모니터링하기에 이상적인 형광소입니다.
불행히도 Dendra2 융합 단백질은 형광 단백질 라벨링의 몇 가지 일반적인 한계를 겪습니다. 이 구조는 유전체 공학을 통해 내인성 발현이 확립될 수 있지만 생물학적 시스템에서 종종 실험적으로 과발현되는 키메라 종입니다. Dendra2 자체의 분해율은 잠재적으로 표적 단백질의 저하에 영향을 미치지만, 매우 안정적이고 수명이 긴단백질(27)으로설명되었다. 또한 Dendra2는 적절한 성숙을 위한 시간이 없을 수 있으므로 매우 빠른 회전율을 가진 단백질을 추적하는 데 적합하지 않습니다. 마지막으로, 405 nm 레이저, 드문, 효율적인 포토 스위칭에 대 한 선호, 비록 그들은 샘플에 더 독성. 실제로, 덜 광독성 청색광은 녹색 Dendra2를 시각화하고 레이저 전력이 고강도일 때 변환하는 데 사용할 수 있습니다. 이 특별한 기능은 장기간 노출되면 원치 않는 변환과 잠재적으로 잘못된 측정을 생성하므로 항상 염두에 두어야 합니다. 마지막으로, 녹색 또는 빨간색 형광과 함께 Dendra2를 사용하는 것이 문제가 될 수 있습니다. 그러나, 많은 다른 PAFP는 동시에 몇몇 단백질의 역학을 조사하기 위하여 유효합니다.
Dendra2 및 기타 PAFP를 이용한 실험은 광표백(FRAP) 및 방사성 펄스-추적 라벨링 기술 후 형광 회복에 연결되었습니다. FRAP 설정에서는 새로 형성된 형광 단백질로부터 ROI에 재진입하는 단백질을 구별하는 것이 불가능하며, 시료의 지속적인 모니터링 및 시각화가 필요하다. Dendra2를 사용하면 시간이 지남에 따라 독립적으로 관찰할 수 있는 두 개의 명확하게 구별가능한 인구가 생성되므로 녹색 Dendra2의 교체 및16새로 합성된 "비활성" 형태인 그린 덴드라2(16)를 추적하고 정량화할 수 있다. 또한 Dendra2는 총 내부 반사 형광 현미경 검사법(TIRF) (TIRF)(TIRF) (28) 및 광활성화 국소화 현미경 검사법(PALM)(29)와같은 초해상도 현미경 검사법에서 유용한 프로브이다. 가까운 장래에 이러한 발전은 더 나은 현지화 및 임의의 POI의 잠재적으로 단일 분자 추적을 허용할 것이며, 시료 안팎에서 더 미묘한 차이를 발견하고 궁극적으로 생물학적 시스템 내의 POI의 삶과 운명에 대한 새로운 정보를 얻을 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 자금 조달을 위해 DFG (KI-1988/5-1 에서 JK, MLP에 대한 우수성의 NeuroCure 클러스터에 의해 NeuroCure 박사 펠로우십)을 인정합니다. 우리는 또한 이미징 세트를 제공하기위한 분자 약리학 베를린 (FMP)에 대한 라이프 니즈 연구소의 이미징 핵심 시설을 인정합니다. 또한, 우리는 실험실에서 Dendra2 시스템을 구축하고 지침을 제공 디오고 펠레치아노 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
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