Summary
Presenteras här är ett protokoll för att övervaka nedbrytningen av protein huntingtin smält till fotokonverterbara fluorofore Dendra2.
Abstract
Proteiner syntetiseras och bryts ned ständigt i en cell för att upprätthålla homeostas. Att kunna övervaka nedbrytningen av ett protein av intresse är nyckeln till att förstå inte bara dess livscykel, men också att upptäcka obalanser i proteostasnätverket. Denna metod visar hur man spårar nedbrytningen av det sjukdomsframkallande protein huntingtin. Två versioner av huntingtin smält till Dendra2 uttrycks i C. elegans nervsystemet: en fysiologisk version eller en med en utökad och patogen sträcka av glutaminer. Dendra2 är ett fotokonvertibelt fluorescerande protein; på en kort ultraviolett (UV) bestrålning puls, Dendra2 växlar sin excitation / utsläpp spektra från grönt till rött. I likhet med en puls-chase experiment, omsättningen av den konverterade röd-Dendra2 kan övervakas och kvantifieras, oavsett störningar från nyligen syntetiserade grön-Dendra2. Med hjälp av konfokalbaserad mikroskopi och på grund av den optiska transparensen i C. elegansär det möjligt att övervaka och kvantifiera nedbrytningen av huntingtin-Dendra2 i en levande, åldrande organism. Neuronal huntingtin-Dendra2 är delvis försämras strax efter omvandling och rensas ytterligare över tiden. De system som styr nedbrytningen är bristfälliga i närvaro av mutant huntingtin och är ytterligare nedsatt med åldrande. Neuronala subtyper inom samma nervsystem uppvisar olika omsättning kapacitet för huntingtin-Dendra2. Övergripande, övervakning av protein av intresse smält till Dendra2 kan ge viktig information inte bara om dess nedbrytning och aktörerna i proteostas nätverk inblandade, men också om dess läge, människohandel och transport.
Introduction
Proteomen av en bosatt organism förnyar sig ständigt. Proteiner bryts kontinuerligt ned och syntetiseras enligt en cells fysiologiska efterfrågan. Vissa proteiner elimineras snabbt, medan andra är längre levde. Övervakning av proteindynamiken är en enklare, mer exakt och mindre invasiv uppgift när du använder genetiskt kodade fluorescerande proteiner (FPs). FPs bildar autokatalytiskt och kan smälts till något protein av intresse (POI), men kräver inte enzymer att vika eller behöver kofaktorer spara för syre1. En nyare generation av FPs har nyligen konstruerats för att byta färg vid bestrålning med en ljuspuls av bestämd våglängd. Dessa fotoaktiva FPs (PAFPs) möjliggör märkning och spårning av långlivade organiska organisationer, eller organeller eller celler som de bor i, och att undersöka deras kvantitativa och/eller kvalitativa parametrar2. FPs gör det möjligt att spåra alla SEI: s rörelse, riktning, graden av förflyttning, koefficient för diffusion, mobil kontra orörlig fraktioner, den tid den finns i ett cellulärt fack, liksom dess omsättning. För specifika organeller kan förflyttning och transport, eller fission och fusion händelser bestämmas. För en viss celltyp kan en cells position, delningshastighet, volym och form fastställas. Avgörande, användningen av PAFPs tillåter spårning utan kontinuerlig visualisering och utan störningar från någon nyligen syntetiserade sond. Studier både i celler och i hela organismer har framgångsrikt använt PAFPs för att ta itu med biologiska frågor in vivo, såsom utveckling av cancer och metastasering, montering eller demontering av cytoskelettet, och RNA-DNA/protein interaktioner3. I detta manuskript används ljusmikroskopi och PAP:er för att avslöja omsättningshastigheten för aggregeringsbenägna protein huntingtin (HTT) in vivo i en C. elegans-modell av neurodegenerativa sjukdomar.
Protokollet beskrivs här kvantifierar stabilitet och nedbrytning av fusion protein huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 är en andra generationens monomeriska PAFP4 som oåterkalleligen växlar dess utsläpp / excitation spektra från grönt till rött som svar på antingen UV eller synligt blått ljus, med en ökning av dess intensitet på upp till 4.000-faldig5,6. Huntingtin är det protein som orsakar Huntingtons sjukdom (HS), en dödlig ärftlig neurodegenerativ sjukdom. Huntingtin exon-1 innehåller en sträcka av glutaminer (CAG, Q). När proteinet uttrycks med över 39Q, det misfolds i en mutant, giftiga och patogena protein. Mutant HTT är benägen att aggregering och leder till neuronal cell död och degeneration, antingen som korta oligomeric arter eller som större mycket strukturerade amyloids7.
Nematoden är ett modellsystem för att studera åldrande och neurodegeneration tack vare sin enkla manipulation, isogen natur, kort livslängd och dess optiska transparens8. För att studera stabiliteten hos HTT in vivo uttrycktes en fusionskonstruktion i nervsystemet hos C. elegans. En HTT-D2 transgen som innehåller antingen en fysiologisk sträcka på 25Qs (HTTQ25-D2) eller en patologisk sträcka på 97Qs (HTTQ97-D2) är överuttryckt pan-neuronally under hela nematodens livstid9. Genom att utsätta live C. elegans till en kort och fokuserad ljuspunkt, är en enda neuron fotostwitched och den konverterade HTT-D2 spåras med tiden. För att fastställa mängden HTT-D2 försämrad jämförs skillnaden mellan den röda signalen från den nyligen konverterade HTT-D2 med den återstående röda signalen från HTT-D2 efter en bestämd tidsperiod. Därför blir det möjligt att undersöka hur huntingtin bryts ned när den finns i dess utökade och giftiga form jämfört med dess fysiologiska form; hur främre eller bakre nervceller reagerar annorlunda på förekomsten av Q97 jämfört med Q25, särskilt under längre tidsperioder; och hur kollapsen av proteostasnätverket (PN) under åldrandet bidrar till skillnaderna i nedbrytningshastigheter. Dessa resultat beskriver endast en liten uppsättning observationer av HTT-D2:s omsättning. Många fler biologiska frågor som är relevanta för både området proteinaggregering och proteostas kan dock behandlas med denna in vivo-applikation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av C. elegans som uttrycker neuronal Huntingtin-Dendra2 fusionsprotein
- Klona genen kodning poi i en nematod uttryck vektor (dvs. pPD95_75, Addgene #1494), genom traditionell begränsning enzym smälta10, Gibson församling11, eller någon metod för val. Sätt in en promotor för att driva uttryck i önskad vävnad eller i ett önskat utvecklingsstadium. Sätt in Dendra2 fluorofore antingen N- eller C-terminalt i ramen med poi.
- Generera transgen C. elegans som uttrycker fusionskonstruktionen (t.ex. via mikroinjektion)12.
OBS: Plasmid bär transgenen kommer att förbli som en extrachromosomal array. Integrering av konstruktionen är inte nödvändigt men kan utföras om så önskas13. I detta protokoll, C. elegans var microinjected med en plasmid bär fusion konstruktion huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) under kontroll av pan-neuronal promotorn Prgef-1. C. elegans uttryck ryggrad erhölls från Kreis et al.14, huntingtin exon 1 med antingen Q25 eller Q97 erhölls från Juenemann et al.15, och Dendra2 erhölls från Hamer et al.16.
2. Åldersmatchning och underhåll av C. elegans
- Ålder matchar alla nematoder genom att synkronisera antingen med alkalisk hypokloritlösningsbehandling17 eller via äggläggning för 4 h vid 20 °C. För äggläggning, placera 10 gravida vuxna på en nysådd nematod tillväxt media (NGM) tallrik och låt stå i 4 h innan du tar bort. Äggen som läggs i denna tidsspann kommer att ge upphov till synkroniserade nematoder.
- Håll experimentell C. elegans på nematod tillväxt media (NGM) plattor sådd med bakteriell näringskälla E. coli OP50, efter standard nematod djurhållning18.
- Odla nematoder vid 20 °C till önskat stadium. För detta protokoll är de önskade åldrarna dagar 4 och 10.
OBS: Unga vuxna dag 4 kan identifieras genom närvaron av ägg i sina gonads och deras höga rörlighet. Åldern dag 10 nematoder är post-fertila, och genomgår vävnad försämring och lokomotiv nedgång19. - För dag 10 nematoder, passage dagligen efter L4-stadiet på dag 3, när nematoder är fertila, för att undvika en blandad population.
3. Beredning av mikroskopi diabilder för bildbehandling
- Förbered mikroskopibilderna på bilddagen. I en mikrovågsugn, smälta allmän kvalitet agatros vid en koncentration av 3% (w / v) i DdH2O. Låt svalna något.
- Skär spetsen på en 1 ml pipettspets och aspirera ungefär 400 μL smält agaros. Placera försiktigt några droppar agaros på en ren glasskiva och placera omedelbart en annan bild ovanpå, se till att en tunn pad av agaros skapas mellan de två. Låt torka innan du försiktigt glider eller lyfter av den övre bilden.
- Placera agaroskudden i en fuktad behållare för att förhindra att de torkar ut. Dessa kan användas inom 2-3 h.
OBS: Undvik bildandet av små bubblor i agatros, eftersom nematoderna kan fångas inuti.
4. Definition av konfokalmikroskopparametrar
OBS: Innan du monterar nematoder och datainsamling, definiera alla inställningar på confocal förvärv programvara. Inställningarna kan anpassas till den bildbehandling hårdvara och mjukvara val.
- Öppna konfigurationsprogrammet och definiera inställningarna för laseravbildning. Ställ in ljusvägen för excitation/emission för grön Dendra2 på 486-553 nm och för röd Dendra2 vid 580-740 nm. Justera effekten och förstärkningen av båda kanalerna/lasrarna efter fluorofores intensitet. Ändra inte den digitala förstärkningen eller förskjutningen och ställ inte in hålet som helt öppet.
- Definiera anskaffningsinställningarna: välj ett sekventiellt kanalläge och växla spår varje bildruta. Ställ in skanningsläget som ram och bildrutestorleken som 1 024 x 1 024 med ett linjesteg på 1. Ange medelvärdet till 2 och medelvärdet med medelvärdesmetod och läge för enkelriktad linje. Ställ in bitdjupet på 8 bitar.
- Definiera inställningarna för flerdimensionella förvärv för konverteringen av Dendra2. För konvertering och blekning använd 405 nm diodlaser inställd på 60% energieffekt. Om möjligt, aktivera den säkra blekning GaAsP för att skydda detektorerna.
- Välj en tidsserie med två cykler, med ett intervall på 0,0 ms mellan och normal start och stopp. Börja blekning efter skanning 1 av 2 och upprepa för 30 iterationer. Sluta bleka när intensiteten sjunker till 50%.
- Definiera hastigheten på förvärv/pixel bor lika snabbt (t.ex. maximalt = 12) för konvertering och medelhastighet (t.ex. medium = 5) för att fånga en fästbild.
OBS: De blekningsparametrar som definieras här är riktlinjer. För andra Dendra2 taggade SEVÄRDHETER laser effektinställningar och blekning iterationer och värden måste fastställas empiriskt.
5. Montering av C. elegans på mikroskopiglas
OBS: Placera om möjligt ett monteringstereomikroroskop nära konfigurationen av konfokalmikroskopet och montera nematoderna strax före avbildning.
- På glaslocket bilden på motsatt sida av agarose pad, rita ett fönster med fyra rutor med en permanent markör och numrera dem.
- Pipettera 15 μL levamisole mitt i agarosdynan. Koncentrationen av levamisole varierar beroende på nematodens ålder: När bildbehandling dag 4 nematoder använder 2 mM levamisole; när bildbehandling dag 10 nematoder använder 0,5 mM levamisole.
- Överför fyra nematoder i vätskan med hjälp av en trådplockning. Med hjälp av en ögonfranshacka, flytta försiktigt varje enskild nematod till en fönsterruta. Vrid ögonfransen så att alla spår av E. coli OP50 späds ut och dess fluorescerande bakgrund inte stör signalförvärvet.
- Vänta tills nematoderna nästan slutar röra sig och placera försiktigt en täckslip ovanpå vätskan för att immobilisera nematoderna i levamisole-lagret mellan agarose pad och täcket slip.
- Placera den inverterade bilden på konfikastadiet för att avbilda nematoderna.
6. Konvertering av grön Dendra2: Datainsamling vid tid noll
OBS: Pulsjakt-experimenten börjar med att oåterkalleligen omvandla fusionsproteinet Dendra2 från en grön fluorofor till en röd.
- Använd mikroskopets okular och lokalisera den första nematoden med ett 20x-mål under grön fluorescens. Fokusera på huvudet eller svansen och växla till konfokalt läge.
- Börja live laserscanning med 488 nm blå laser för att visualisera den gröna Dendra2 i EGFP grön kanal (ex / em = 486-553 nm). Välj en enda neuron och sätta den i fokus. Zooma in 3x och öka målet för laserstrålen4.
OBS: Välj en neuron per nematod. Varje neuron kommer att utgöra ett prov eller datapunkt. - Hitta den maximala projektionen planet och, enligt ljusstyrkan på fluorofore, öka eller minska förstärkning eller laser makt för att få en mättad men inte överexponerad bild som kan identifieras av färgintervallindikatorn. När detta har definierats stoppar du skanningen.
OBS: Bestråla inte provet för länge eller med för mycket ström, eftersom excitation med synligt blått 488 nm ljus kan också konvertera Dendra2, om än långsamt och mindre effektivt4. - Öppna fliken i programvaran för att välja intressanta regioner (ROIs) och rita en första avkastning runt den valda neuronen. Definiera en större andra region av intresse som omfattar nematodens huvud och inklusive den första avkastningen.
- I blekningsinställningarna väljer du att den första avkastningen ska förvärvas, blekas och analyseras. Välj för den andra avkastningen som ska förvärvas och analyseras men inte blekas.
- Ställ in hastigheten på skanningen till maximal (dvs. snabb pixel bo) och starta experimentet för att konvertera den valda Dendra2 nervceller.
När experimentet är gjort kommer den förvärvade bilden att resultera i två bilder: en före och en efter konvertering. För den gröna kanalen bör den första bilden ha en högre grön signal som minskar i den andra bilden på grund av omvandlingen av den gröna Dendra2. För den röda kanalen ska den första bilden vara negativ och inte visa någon signal, med en röd signal som visas i bilden efter konverteringen. Om den gröna signalen inte minskar, konverteringen inte inträffade, och inställningarna, såsom 405 laser makt eller antalet iterationer, bör ändras. Om det finns en röd signal i den första bilden, då 488 nm lasereffekt som används var för hög och en del av den gröna Dendra2 redan omvandlades till rött. I detta fall bör en ny neuron/nematod väljas. - Omedelbart efter konvertering, börja live skanning med den gröna 561 nm laser för att visualisera Dendra2 i den röda kanalen (ex / em = 580-740 nm). Hitta fokus och respektive maximal projektion av den konverterade neuron med hjälp av intervallet färgindikatorn för att undvika överexponering.
- Ställ snabbt in avsökningshastigheten på en lägre pixelborthastighet (t.ex. 5x) och hämta en ögonblicksbildbild av båda kanalerna med en högre upplösning. Den här bilden definieras som tidspunkt noll (T0) efter konvertering.
OBS: Anskaffningshastigheten för den konverterade bilden kan varieras. Men när du väl har valt måste den här hastigheten vara konstant under datainsamlingen. - Spara skanningen med ett identifierbart namn och/eller nummer, följt av etiketten time zero (T0).
OBS: Det är lämpligt att också spara bilden av konverteringsexperimentet (steg 6.6) för att illustrera bristen på röd signal före konvertering och dess utseende efteråt.
7. Bildtagning av konverterad röd Dendra2 för datainsamling vid en vald andra tidpunkt
- För att spåra Dendra2 nedbrytning över tiden, definiera en andra tidpunkt för att återimage samma nematod/neuron. Välj den andra tidpunkten experimentellt för att ta itu med alla relevanta biologiska frågor. För protokollet som beskrivs här avbildas Dendra2 både vid 2 h (T2) och 24 h (T24) efter konvertering.
- Vid den valda tidpunkten, hitta samma nematod/neuron med hjälp av okular och röd fluorescens.
- Öppna T0-bilden av respektive nematod/neuron och ladda om/återanvända bildinställningarna. Se till att anskaffningsinställningarna för ögonblicksbilden är exakt desamma när du hämtar T0-, T2- och T24 h-bilderna.
- Scanning live i den röda kanalen, sätta den konverterade röda neuron i fokus. Eftersom den röda Dendra2 försämras med tiden visar intervallindikatorn en mindre intensiv maximal projektion. Ändra inte några förvärvsparametrar och hämta en ögonblicksbild med samma hastighet (t.ex. 5x) som den första bilden.
- För att spåra nedbrytningen av Dendra2 efter 4 h eller längre, rädda nematoderna efter konvertering.
- Ta bort bilden från mikroskopet omedelbart efter konvertering och bildbehandling de fyra nematoderna. Ta försiktigt bort täcket och med hjälp av en trådplockning, lyft varje nematod från agarosdvaden.
- Placera varje nematod individuellt på en lämpligt märkt och identifierbar NGM-platta.
- För den andra punkten, montera nematoden igen på en ny agaros pad och fortsätt med bildbehandling av den konverterade röda Dendra2 enligt instruktionerna i avsnitt 6.
8. Bildanalys av konverterade Dendra2
OBS: Analys av nedbrytningen av Dendra2 utförs med Fiji / ImageJ programvara20.
- Öppna Fiji och dra och släpp LSM-filen i Fiji-baren. Öppna T0 bilden tas strax efter konvertering och bilden av samma nematod tas vid den valda tidpunkten efter konvertering (T2 eller T24 h).
OBS: För att spåra nedbrytningen av det protein av intresse som smälts till Dendra2 behöver endast den röda kanalen analyseras. - Upprätta mätparametrarna från menyn: Analysera | Ställ in mått. Välj funktionerna Område och integrerad densitet.
- Välj den bild som erhålls med den röda kanalen. Välj markeringsverktyget för polygoner i Fiji-fältet.
- Identifiera den konverterade neuronen på T0-bilden och rita en roi runt den med markeringsverktyget.
- Om du vill identifiera neuronens konturer korrekt markerar du intensitetströsklarna genom att välja från stapelbilden | Justera | Tröskelvärdet. Dra stapelmarkören för att avgränsa tröskelvärdet och spåra runt det här området med polygonverktyget. För att generera en korrekt AVKASTNING är det också möjligt att använda konturen av den valda neuronen från den gröna kanalen.
- När markeringen har gjorts i det röda kanalfönstret trycker du på Analysera | Mät. Ett popup-fönster med namnet Resultat visas och roi-värdena för Område, IntDenoch RawIntDen.
- Utför samma urvals- och mätprocess för bilden av den andra punkten (T2 eller T24 h).
- Kopiera de erhållna värdena till ett kalkylprogram, var noga med att på lämpligt sätt registrera värdena vid T0 efter konverteringen och vid T2 eller T24 h efter konverteringen.
9. Beräkning av förhållandet mellan Dendra2 nedbrytning
- För att beräkna nedbrytningsförhållandet tilldelar du först ett värde på 1 (eller 100 %) för att tid nedbrytningen från tidspunkt noll (dvs. strax efter konvertering, när alla röda Dendra2 konverteras är fortfarande närvarande). Detta resulterar från att dela värdera av IntRawDen av T0 vid honom.
- För att beräkna minskningen av den röda dendra2-intensitetssignalen över tiden och nedbrytningen delar du upp RawIntDens värde för den andra tiden (t.ex. T2 eller T24 h) med värdet av RawIntDen av T0. Det resulterande numret bör vara mindre än 1. Dessa värden kan också uttryckas i procent och definiera T0 som 100 %.
- Upprepa avsnitt 7 för varje nematod som konverteras. För en grafisk representation av nedbrytningen av Dendra2, kartlägga ett punktdiagram eller stapeldiagram med procent- eller kvotvärdena för fluorescensminskning som erhålls i y-axeln. Tillämpa önskad statistisk analys och illustrera den i diagrammet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Två nematod stammar uttrycker huntingtin exon-1 protein fragment i ram med fotokonvertibla protein Dendra2 erhölls via microinjection och plasmids hölls som en extrachromosomal array. Fusionskonstruktionen uttrycktes i hela C. elegans nervsystemet från utveckling under hela åldrandet. Här innehöll HTT-D2 antingen den fysiologiska sträckan 25 polyglutamin (HTTQ25-D2, figur 1A) eller en helt penetrerande och patogen upprepning med 97 glutaminer (HTTQ97-D2, figur 1B). Ursprungligen fusionsproteinet testades för att se till att det förändrats från sitt gröna spektrum till dess röda spektrum vid UV-bestrålning. HTT-D2 har framgångsrikt växlat från grönt till rött uteslutande inom det upplysta området. Enligt kraften och iterationerna av UV-pulsen, och beroende på z-planet och penelettens av laserstrålen genom nematodens nagelband, konverterades en definierad del av HTT-D2, men inte alla. En röd signal dök upp i fotokonverterade nervceller, colocalizing med den gröna nonconverted HTT-D2 (Figur 1C, D). På grund av noggrannheten i laserscanning foton strålar var det möjligt att konvertera en exakt AVKASTNING som motsvarar en enda neuron. Före konverteringen var ingen röd signal synlig när provet var upphetsad i den röda kanalen (figur 2A). Vid UV-bestrålning minskade den gröna signalen när HTT-D2 konverterades och en röd signal slutligen dök upp (figur 2B). HTT-D2 degraderades sedan med tiden, vilket resulterade i en minskning av nivåerna av röd HTT-D2 (figur 2C) och en möjlig ökning av den gröna HTT-D2-signalen, eftersom mer fusionsprotein nyligen syntetiserades. Eftersom en betydande minskning redan var framträdande vid 2 h efter konvertering, detta intervall för att upptäcka och kvantifiera nedbrytningen av HTT-D2 bibehölls. Det är viktigt att notera att nedbrytning inte är den enda process som kan ske efter konvertering av HTT-D2. Konverterade HTT-D2 kan smugglas och transporteras längs axoner, vilket resulterar i en minskning av den röda signalen inte på grund av clearance. Men med de inställningar som används här och under den korta tidsperioden på 2 h, observerades ingen spridning av den röda signalen, möjligen på grund av det faktum att lilla HTT-D2 flyttades från soma till axon. Dessutom, konvertera och imaging en enda hel neuronal soma hjälpte utesluta effekterna av HTT-D2 diffusion inom samma neuron, eftersom alla cellulära fack analyseras samtidigt. För att studera både diffusion eller transport/handel är det lämpligt att få snabba och högre förstoringsbilder och spåra en mindre och möjligen mer rörliga del av det protein som är av intresse. Det är också viktigt att notera att inom en uppsättning experiment representerade varje djur en biologisk upprepning. Endast en neuron per nematod avbildades, varje djur avbildades en gång per session, och bildbehandling inträffade under tre sessioner, som utgjorde tekniska repetitioner. De tre sessioner som krävs för att djuren synkroniseras på färska plattor före varje experiment antingen på dag 4 eller dag 10, vilket möjliggör oavsett miljövariationer åläggs nematoderna. Tre sessioner står också för eventuella variationer som uppstår från bildbehandlingsuppsättningen (t.ex. lasereffekten som varierar beroende på en annan temperatur mellan experimenten). Alla biologiska replikat som erhållits under de tre sessionerna (minst 20 djur) ansågs vara enskilda prover och användes för att fastställa statistisk signifikans.
Efter att ha bekräftat att båda C. elegans HTT-D2-stammarna var effektiva och fastställde de optimala konverteringsparametrarna undersöktes skillnaderna mellan omsättningen för ett sjukdomsframkallande HTT-D2-protein (dvs. HTTQ97-D2) jämfört med dess fysiologiskt relevanta kontroll (HTTQ25-D2). Först observerades nedbrytningen av HTT-D2 hos olika nervceller (figur 3). Det är känt att subtyper av nervceller inom nematodens nervsystem varierar i deras metabolisk aktivitet och morfologi21, eventuellt göra en skillnad i nedbrytning och ombalansering av proteom. Nervcellerna i svansregionen jämfördes med huvudets och befanns vara betydligt mer aktiva (figur 3A). Detta fynd gällde endast för HTTQ25-D2 och inte för patogena HTTQ97-D2, vilket tyder på att PN inte kunde ta bort HTT-D2 som innehåller längre glutamin sträckor i hela nervsystemet (figur 3B).
För att ytterligare bekräfta att modellsystemet uppförde sig som förväntat utfördes konverteringsexperiment under en längre period, vilket gjorde det möjligt för cellernas nedbrytningsvägar att eliminera det protein som är av intresse nästan helt (figur 4). Faktum är att det fanns betydligt mer nedbrytning av kontroll HTTQ25-D2 24 h efter konvertering än efter 2 h i huvudet nervceller, och i stor utsträckning mer i svansen nervceller (Figur 4A). Återigen, den bakre svansen nervceller mer aktivt bort röda HTT-D2, även under en ökad tidsperiod. En liknande trend upptäcktes för sjukdomsframkallande HTTQ97-D2, med en mycket liten minskning av den röda HTT-D2 signalen över 24 h. HTTQ97-D2 togs dock inte bort lika lätt som HTTQ25-D2, särskilt efter 24 timmar. Det kan vara så att endast den lösliga HTTQ97-D2-fraktionen bryts ned effektivt, vilket står för den första minskningen av den röda signalen och dess ytterligare milda minskning över tiden. Viktigt, det fanns två populationer av nervceller efter 24 h: en med en högre nedbrytningshastighet och en där den röda HTT-D2 signalen inte försämrades alls, eller potentiellt till och med ökat (Figur 4B). Ökad och stabil signal representerar möjligen redan aggregerade eller kontinuerligt aggregerande arter som var betydligt svårare att rensa från cellerna på grund av deras tätt packade amyloid natur. Dessa inneslutningar, närvarande uteslutande när glutamin sträcker sig överskred 40 upprepa tröskeln, och som verkade mikroskopiskt som högborgar, har hypoteser om att ackumuleras som insättningar som inte lätt kan tas bort22. Det är också möjligt att en ökning av den röda fluorescerande signalen var en artefakt till följd av tekniska problem (t.ex. användning av felaktiga förvärvsparametrar, sub-par prestanda av mikroskopi setup, eller en felaktig återhämtning / monteringsprocess). Vid inlösen av bilder under längre tidsperioder måste dessa variabler beaktas.
Slutligen, eftersom neurodegenerativa störningar såsom HS manifesteras i vuxen livet, observerades effekten av åldrande på graden av HTT-D2 nedbrytning. Konverteringsexperiment utfördes i huvudet och svansregionerna för unga (dag 4) jämfört med gamla (dag 10) nematoder i båda HTT-D2-stammarna (figur 5). För huvudet nervceller, Det fanns ingen signifikant förändring i graden av nedbrytning på grund av åldrande under livslängden för både HTTQ25-D2 och HTTQ97-D2, möjligen eftersom HTT-D2 togs bort lika under hela livet för varje nematod. En mycket betydande förändring noterades dock när man jämförde gamla nematoder som innehåller antingen en patologisk eller en fysiologisk glutamin sträcka. HTTQ97-D2 försämrades inte lika effektivt som HTTQ25-D2, vilket belyser PN: s oförmåga att ta bort aggregerade och eventuellt giftiga arter av huntingtin i äldre nematoder (figur 5A). Återigen observerades en mer aktiv och betydande omsättning i svansen nervceller. Som i huvudet nervceller, en mer robust omsättning av HTTQ25-D2 observerades inte i svansen nervceller av unga nematoder jämfört med den äldre kohorten, och nedbrytning var lika på dag 4 och dag 10. Omvänt, betydande förändringar i nedbrytning priser mellan kontroll och patogena HTT-D2 stammar uppträdde i unga dag 4 nematoder, blir ännu mer betydande på dag 10. Viktigt, svans nervceller kunde klara av giftiga HTTQ97-D2 i unga nematoder, vilket visar att olika samtidiga PN mekanismer kan vara på jobbet för att ta bort HTT-D2 (Figur. 5B). Totalt sett minskade PN-aktiviteten med tiden, möjligen på grund av skadliga effekter orsakade av både åldrande och förekomsten av aggregat.
Figur 1: C. elegans uttryckt huntingtin exon-1 smält till Dendra2 i nervsystemet. (A) Young, dag 4 C. elegans pan-neuronally uttrycker huntingtin exon-1 innehåller 25 glutaminer, smält till Dendra2 i dess okonverterade gröna excitering / utsläpp tillstånd. Skala bar = 100 μm. Insets visar en förstorad bild av huvudet (överst) och svansen (botten) nervceller. Infälld skala bar = 10 μm.(B) Ung, dag 4 C. elegans pan-neuronally uttrycker huntingtin exon-1 innehåller 97 glutaminer, smält till Dendra2 i dess okonverterade gröna excitation / utsläpp tillstånd. Skala bar = 100 μm. Insets visar en förstorad bild av svansen (överst) och huvudet (botten) nervceller, och huvudet på en dag 7 nematod (längst till höger). Infällda skala bar = 10 μm. Vita pilspetsar pekar på HTTQ97-D2 foci, som visar huntingtin aggregat. (C)Kanal sammanslagna bild av HTTQ25-D2 med omvandling av huvudregionen. Box representerar den del av hela C. elegans som har UV bestrålats. Skalstång = 100 μm. Infälld visar Dendra2-utsläppet vid 488 nm (topp, grön) och på 561 nm (botten, röd). Skalbar = 10 μm.(D)Kanalsammanslagningsbild av HTTQ97-D2 med konvertering av huvudregionen. Skalstång = 100 μm. Box representerar den del av hela C. elegans som har UV-bestrålats. Infälld visar Dendra2 utsläpp på 488 nm (topp, grön) och på 561 nm (botten, röd). Skalbar = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Konverterad röd HTT-D2 minskade med tiden i enstaka nervceller. Svans nervceller av HTTQ25-D2. Två nervceller visas samtidigt och självständigt fotokonverterad. Bilder i sekventiellt visar tre tidpunkter: (A) Före bestrålning (före), (B) omedelbart efter bestrålning (konvertering) och (C) 2 h efter bestrålning (efter). Övre panel (grön kanal) representerar HTT-D2 signal som samlats in vid 486-553 nm excitation/utsläpp. Den vita regionen av intresse beskriver nervceller som har bestrålats. Den mellersta panelen (röd kanal) visar den konverterade HTT-D2 signal som samlats in vid 580-740 nm excitation /emission. Den nedre panelen är en sammanslagning av de två kanalerna. Skalbar = 5 μm för alla bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Huvud och svans nervceller uppvisade olika nedbrytningshastigheter. Stapeldiagram visar procentandelen röd intensitet i förhållande till det ursprungliga värdet vid tidpunkten för konverteringen (dvs. 100 %). Konverterad röd Dendra2 signal minskade totalt över 2 h intervallet som HTT-D2 försämrades inom nervceller i C. elegans. Inom nematodens nervsystem neuronala subtyper uppvisade olika nedbrytning priser, med svans nervceller visar en mer aktiv omsättning, men endast i nematoder som bär en nonpathogenic polyglutamin stretch. (A) Kvantifiering av nedbrytning i HTTQ25-D2 huvud kontra svans nervceller. Medelvärde ± SD, oparad tvåstjärtad Students t-test. N = 23-28 prover/nematoder avbildade per region, *P < 0,05. (B) Kvantifiering av nedbrytning i HTTQ97-D2 huvud kontra svans nervceller. Medelvärde ± SD, oparad tvåstjärtad Students t-test. N = 23-28 prover/nematoder avbildade per region, ns = icke-signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: HTTQ97-D2 godkändes inte signifikant efter 24 timmar. Stapeldiagram visar procentandelen röd intensitet i förhållande till det ursprungliga värdet vid tidpunkten för konverteringen (dvs. 100 %). Konverterad röd Dendra2 signal minskade som HTT-D2 försämrades inom nervceller i C. elegans. HTT-D2 uppvisade olika nedbrytningshastigheter. Även under längre tidsperioder efter konverteringen kunde patogena HTT-D2 inte tas bort jämfört med dess friska kontroll. (A) Kvantifiering av nedbrytningshastigheten i HTTQ25-D2 vid två tidpunkter efter konvertering (2 h och 24 h) i både huvud- och svansneuron. Medelvärde ± SD, enkelriktad variansanalys (ANOVA). N = 21-28 prover/nematoder avbildade per tid/region, *P < 0,05, ****P & 0,0001. (B)Kvantifiering av nedbrytningshastigheten i HTTQ97-D2 vid två tidpunkter efter konvertering (2 h och 24 h) i både huvud- och svansneuron. Medelvärde ± SD, enkelriktad variansanalys (ANOVA) följt av Tukeys post hoc-test med flera jämförelser. N = 21-28 prover/nematoder avbildade per tid/region, ns = icke-signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Gamla och unga nematoder som uttrycker den patogena HTT-D2 försämrade den inte effektivt. Stapeldiagram visar procentandelen röd intensitet i förhållande till det ursprungliga värdet vid tidpunkten för konverteringen (dvs. 100 %). Konverterade röda Dendra2 signal minskade som HTT-D2 försämrades inom nervceller. Som nematoden åldern, dess förmåga att bryta ner patogena HTT-D2 var dessutom nedsatt i hela nervsystemet. (A) Kvantifiering av nedbrytningshastigheten hos huvudet nervceller hos unga (dag 4) och gamla (dag 10) HTTQ25-D2 nematoder jämfört med åldersmatchade HTTQ97-D2 nematoder. Medelvärde ± SD, enkelriktad variansanalys (ANOVA). N = 23-28 prover/nematoder avbildade per stam/dag, ****P < 0,0001. (B)Nedbrytningshastighet 2 h efter konvertering i svansen nervceller hos unga (dag 4) och gamla (dag 10) HTTQ25-D2 nematoder, jämfört med åldersmatchade HTTQ97-D2 nematoder. Medelvärde ± SD, enkelriktad variansanalys (ANOVA) följt av Tukeys post hoc-test med flera jämförelser. N = 23-28 prover/nematoder avbildade per stam/dag, *P < 0,05, ***P & 0,001, ****P < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att förstå ett proteins funktion är det viktigt att förstå dess syntes, plats och nedbrytning. Med utvecklingen av nya, stabila och ljusa FPs, visualisera och övervaka SEVÄRDHETER har blivit enklare och effektivare. Genetiskt uttryckt fusion PAFPs såsom Dendra2 är unikt placerade för att studera stabiliteten hos en sevärdhet. Vid exponering för lila-blått ljus, Dendra2 bryter på en exakt plats inom en triad av bevarade aminosyror. Fluorofore genomgår en liten strukturell förändring, vilket resulterar i en fullständig förskjutning av spektra från grönt till rött23. Denna förändring möjliggör upptäckt och övervakning av alla sevärdheter som är kopplade till Dendra2. Faktum är att dessa fusion konstruktioner användes först för att skapa en C. elegans reporter stam för att studera ubiquitin-proteasome systemet in vivo16. Dendra2 var också anställd för att förstå sårbarheten hos selektiva neuronala subtyper och deras förmåga att hantera utökade polyglutaminproteiner24, eller övervaka induktion av autofagi i modeller av motor neuron sjukdom25.
Ett protokoll presenteras här för att övervaka in vivo nedbrytningen av huntingtin, en sjukdomsrelaterad aggregering-benägen protein på ett noninvasive sätt. Efter att framgångsrikt generera en neuronal C. elegans modell av HD, uttrycker HTT-D2 pan-neuronally, var andelen nedbrytning av expanderade och patogena HTT jämfört med dess fysiologiska motsvarighet kvantifieras. Slående skillnader observerades mellan neuronal subtyper, mellan unga och äldre nematoder och mellan kapaciteten hos PN att hantera giftiga glutamin belastningar över tiden. Denna teknik kan också tillämpas för att följa platsen och förflyttning av huntingtin samt dess öde när störningar till PN införs. siRNA knockdown av viktiga förkläde eller administrering av föreningar som hämmar proteasomaktivitet kan avslöja funktionen och betydelsen av dessa komponenter i aggregering-benägen proteiner: till exempel om PN aktiverar specifika noder för att kompensera för brister26. Det kan också förklara de skadliga effekterna av en sjukdom jämfört med de av normalt åldrande.
Även om många olika frågor kan lösas med hjälp av denna teknik, när en önskad modell har genererats, måste korrekta konverterings- och identifieringsparametrar fastställas för att få tillförlitliga data. Också avgörande är att bestämma konverteringsinställningar som möjliggör tillräcklig avkastning av aktiverat protein utan fotobleg eller fototoxicitet och utan oönskad konvertering. För varje utstuderat protein inom ett specifikt modellsystem, antingen ex vivo eller in vivo, är det dessutom nödvändigt att experimentellt fastställa en tidsperiod som är tillräckligt stor för att möjliggöra en exakt kvantifiering av nedbrytningshastigheten.
Dendra2 erbjuder en rad fördelar jämfört med andra PAFPs: 1) det är monomeriskt och mycket ljus; 2) den har en hög kontrast fotokonvertering och en stabil fotokonverterad signal; 3) det kan aktiveras med låg fototoxicitet av en blå 488 nm laser, som är en del av de flesta confocal hårdvara inställningar; 4) den mognar effektivt vid 37 °C för applicering i däggdjursceller. 5) den har inga toxiska biverkningar uttryckt under längre tidsperioder23,,27; och 6) systemet inte påverkas av variationer i uttrycksnivåer mellan eller inom en organism eller cell, eftersom endast förhållandet mellan Dendra2-signalen före och efter omvandlingen kvantifieras. Alla listade egenskaper gör Dendra2 till en idealisk fluorofor för att spåra proteindynamik i realtid och övervaka cellödet.
Tyvärr lider Dendra2 fusionsproteiner av vissa vanliga begränsningar av fluorescerande proteinmärkning. Konstruktionen är en chimär art ofta experimentellt överuttryckt i biologiska system, även om endogena uttryck kan fastställas via genomisk teknik. Nedbrytningshastigheten av Dendra2 själv påverkar potentiellt nedbrytningen av målproteinet, även om det har beskrivits som ett mycket stabilt, långlivade protein27. Dessutom är Dendra2 inte lämplig att spåra proteiner med mycket snabb omsättning eftersom det kanske inte har tid för sin egen ordentlig mognad. Slutligen, 405 nm lasrar, som är ovanliga, är att föredra för effektiv fotosmäring, även om de är mer giftiga för provet. Faktum är att mindre fototoxiskt blått ljus kan användas för att både visualisera gröna Dendra2 och konvertera den när lasereffekten är hög intensitet. Denna särskilda funktion bör alltid hållas i åtanke, eftersom långvarig exponering kommer att producera oönskad konvertering och potentiellt felaktiga mätningar. Slutligen kan det vara problematiskt att använda Dendra2 i kombination med gröna eller röda fluorofores. Men många olika PAFPs finns tillgängliga för att undersöka dynamiken i flera proteiner samtidigt.
Experiment som använder Dendra2 och andra PAFPs har kopplats till fluorescensåtervinning efter fotobleaching (FRAP) och radioaktiv pulsjakt märkningstekniker. I en FRAP-miljö är det omöjligt att skilja proteiner åter in i en avkastning på en avkastning på en avkastning från nybildade fluorescerande protein, och konstant övervakning och visualisering av provet är nödvändigt. Med Dendra2 genereras två tydligt urskiljbara populationer som kan observeras oberoende av tiden så att den ersatta och nyligen syntetiserade "inaktiva" formen av grön Dendra2 kan spåras och kvantifieras16. Dendra2 är också en användbar sond i superupplösningsmikroskopi såsom total intern reflektion fluorescerande mikroskopi (TIRF)28 och fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM)29. Inom en snar framtid kommer sådana framsteg att möjliggöra bättre lokalisering och potentiellt enda molekyl spårning av någon SE, gör det möjligt att avslöja mer subtila skillnader inom och mellan prover och i slutändan ger ny information om liv och öde någon SEi inom ett biologiskt system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi bekräftar DFG (KI-1988/5-1 till JK, NeuroCure PhD stipendium av NeuroCure Cluster of Excellence till MLP) för finansiering. Vi erkänner också Imaging Core Facility vid Leibniz Research Institute for Molecular Pharmacology Berlin (FMP) för att tillhandahålla bildbehandling inrättas. Dessutom vill vi tacka Diogo Feleciano som etablerade Dendra2-systemet i labbet och gav instruktioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
- Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
- Addgene. Plasmids 101: A Desktop Resource. , 3rd Edition, https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition 45-50 (2020).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
- Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
- Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
- Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
- Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
- Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
- Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).
