Summary
Ce protocole valide un modèle de rongeur fiable, facile à exécuter et reproductible de lésions axonales diffuses cérébrales (DAI) qui induit des dommages à la matière blanche généralisée sans fractures du crâne ou contusions.
Abstract
Les lésions cérébrales traumatiques (TBI) sont une cause majeure de décès et d’invalidité. Les dommages axonaux diffus (DAI) sont le mécanisme prédominant de blessure dans un grand pourcentage de patients TBI nécessitant une hospitalisation. DAI implique des dommages axonaux répandus de secousses, de rotation ou de dommages de souffle, menant à des dommages rapides d’étirement axonal et aux changements axonaux secondaires qui sont associés à un impact durable sur la récupération fonctionnelle. Historiquement, les modèles expérimentaux de DAI sans blessure focale ont été difficiles à concevoir. Ici, nous validons un modèle de rongeur simple, reproductible et fiable de DAI qui cause des dommages répandus de matière blanche sans ruptures de crâne ou contusions.
Introduction
Les lésions cérébrales traumatiques (TBI) sont une cause majeure de décès et d’invalidité aux États-Unis. Les TBI contribuent à environ 30 % de tous les décès liés aux blessures1,2. Les principales causes de l’IDT diffèrent d’un groupe d’âge à l’autre et comprennent les chutes, les collisions à grande vitesse pendant les sports, l’automutilation intentionnelle, les accidents de la route et les agressions1,2,3.
Brain diffuse axonal injury (DAI) is a specific type of TBI induced by rotational acceleration, shaking or blast injury of the brain resulting from unrestricted head movement in the instant after injury4,5,6,7,8. DAI implique des dommages axonaux répandus menant à une déficience neurologique de longue durée qui est associée à de mauvais résultats, les coûts de soins de santé lourds, et un taux de mortalité de 33-64%1,2,4,5,9,10,11. Malgré des recherches récentes importantes sur la pathogénie de DAI, il n’y a pas eu de consensus sur les meilleures options de traitement11,12,13,14.
Au cours des dernières décennies, de nombreux modèles expérimentaux ont tenté de reproduire avec précision différents aspects de DAI11,12,15,16. Cependant, ces modèles ont des limites étant donné la présentation unique de DAI par rapport à d’autres blessures focales. Ces modèles antérieurs causent non seulement des dommages axonaux dans les régions de matière blanche mais entraînent également des lésions cérébrales focales. Cliniquement, DAI est accompagnée de micro-hémorragies, qui peuvent constituer une cause majeure de dommages à la matière blanche.
Il est démontré que seulement deux modèles animaux reproduisent les principales caractéristiques cliniques de l’IDD. Gennarelli et ses collègues ont produit le premier dispositif latéral de rotation de la tête en 1982, en utilisant l’accélération rotationnelle de la tête non-modifiée pour induire le coma avec DAI dans un modèle de primate non humain15. Ce modèle de primate a employé la rotation simple commandée pour l’accélération et la décélération pour déplacer la tête par 60 'dans 10-20 ms. Cette technique a été capable d’imiter la conscience altérée et les dommages axonaux répandus qui ressemblaient aux effets du TBI grave observé dans les cerveaux humains. Cependant, les modèles de primates sont très chers4,11,16. Basé en partie sur le modèle précédent, un modèle porcin de l’accélération par rotation des lésions cérébrales a été conçu en 1994 (Ross et al.) avec des résultats similaires14.
Ces deux modèles animaux, bien qu’ils aient produit différentes présentations de pathologie typique, ont ajouté considérablement aux concepts de pathogénie DAI. La rotation rapide de la tête est généralement acceptée comme la meilleure méthode pour induire DAI, et les rongeurs fournissent un modèle moins coûteux pour les études rapides de rotation de la tête11,16. Ici, nous validons un modèle simple, reproductible et fiable de rongeur de DAI qui cause des dommages répandus de matière blanche sans ruptures de crâne ou contusions. Ce modèle actuel permettra une meilleure compréhension de la pathophysiologie de dAI et le développement de traitements plus efficaces.
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Protocol
Les expériences ont été réalisées à la suite des recommandations des Déclarations d’Helsinki et de Tokyo et des Lignes directrices pour l’utilisation des animaux expérimentaux de la Communauté européenne. Les expériences ont été approuvées par le Comité de soins aux animaux de l’Université Ben-Gourion du Néguev.
1. Préparation des rats à la procédure expérimentale
REMARQUE : Sélectionnez des rats Sprague-Dawley mâles adultes pesant 300-350 g.
- Obtenir l’approbation pour l’exécution de ces expériences auprès du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
- Maintenir les rats à une température ambiante de 22 à 1 oC, avec 12 heures de lumière et 12 heures de cycles sombres. Fournir du chow de rat et de l’eau ad libitum.
- Effectuer toutes les expériences entre 6 h et 12 h.
- Utilisez un système continu d’administration d’isoflurane pour induire l’anesthésie. Assurez-vous que le système de vaporisateur est rempli d’isoflurane.
- Anesthésiez les rats avec 2% d’isoflurane.
- Confirmez que le rat est entièrement anesthésié en observant un manque de mouvement ou de réflexe de pédale en réponse à un stimulus externe.
2. Induction de lésions axonales diffuses
REMARQUE : L’appareil se compose des composants suivants : 1) cylindre en plastique transparent, 2) poids de fer (1308 g), 3) mécanisme de rotation composé d’un tube cylindrique, de deux roulements sur lesquels l’axe tourne et d’une fixation de tête (pour les épingles d’oreille); 4) plate-forme horizontale sur laquelle sont fixés deux roulements.
- Placez l’appareil sur une table de laboratoire lourde et stable.
- Attachez le poids à une ficelle élevée à une hauteur de 120 cm.
- Laissez le poids qui tombe librement frapper le boulon, en activant le mécanisme de rotation. À l’aide du dispositif de rotation latérale de la tête, la tête du rongeur est rapidement retournée de 0 à 90 degrés.
- Après l’induction des lésions cérébrales axonales diffuses, transférez le rat dans une salle de réveil.
3. Mesure des paramètres rotatifs Kinematics/Biomécanical.
- Mesurer la cinématique rotationnelle/paramètres biomécaniques comme suit :
où Fo - force appliquée à la tête animale (kg); M - moment de force; K - énergie cinétique; m - masse de la chute du poids; g - accélération gravitationnelle; h - hauteur (cm); D - distance entre les broches d’oreille (cm).
REMARQUE: Pour calculer la force appliquée sur la tête de l’animal (Fo), il est nécessaire de connaître la masse de la chute du poids, la hauteur à laquelle le poids tombe, et la distance entre les broches d’oreille. Les autres paramètres restent inchangés.
4. Évaluation du score de gravité neurologique après 48 heures
REMARQUE : Les déficits neurologiques ont été évalués et classés à l’aide d’un score de gravité neurologique, tel que décrit précédemment17,18,19. Les modifications de la fonction et du comportement du moteur sont évaluées par un système de points de sorte qu’un score maximum de 24 représente un dysfonctionnement neurologique grave. Un score de 0 indique l’état neurologique intact. Les fonctions comportementales suivantes sont évaluées.
- Évaluer l’incapacité du rat à sortir d’un cercle (50 cm de diamètre) lorsqu’il est laissé en son centre. Effectuez ceci pendant trois sessions individuelles d’une durée de 30 min, 60 min, et plus de 60 min.
- Testez le rat pour une perte de réflexe de redressement en trois séances d’une durée de 20 min, 40 min et plus de 60 min.
- Effectuez le test d’hémiplégie, l’incapacité du rat à résister aux changements forcés de position.
- Levez le rat par sa queue pour tester la flexion de l’arrière-pays.
- Placez le rat sur le sol pour tester sa capacité à marcher tout droit.
- Testez trois réflexes distincts : le réflexe pinna, le réflexe cornéen et le réflexe de sursaut.
- Évaluez le rat avec une note clinique basée sur la perte de la recherche de comportement et de prostration.
- Testez les réflexes des membres pour le placement. Effectuez le test sur les membres antérieurs gauche et droit, puis les arrières gauche et droit.
- Effectuez un test fonctionnel via la tâche d’équilibrage du faisceau. Le faisceau doit mesurer 1,5 cm de large. Exécutez le test pour des sessions de 20 s, 40 s, et plus de 60 s.
- Effectuez l’essai de marche de faisceau sur le rat avec des faisceaux de trois largeurs différentes : 8.5 cm de large, 5 cm de large, et 2.5 cm de large.
5. Collecte de cerveau pour l’examen histologique après 48 heures
- À 48 heures après une blessure, euthanasiez les rats en remplaçant leur mélange de gaz inspiré par 20% O2/80% DE CO2. Veiller à ce que le CO2 soit livré à un taux prédéterminé conformément aux lignes directrices du Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels.
- Assurer la confirmation du décès conformément aux lignes directrices du Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels.
- Transcardiacally perfuser le rat avec 0,9% saline héparinisée à la température 4 oC, suivie de 500 mL de paraformaldéhyde de 0,1 M en tampon de phosphate (pH 7,4).
- Après la perfusion, effectuer la décapitation avec une guillotine.
- Effectuez la collecte du cerveau en enlevant les calvarias avec des forceps de coupe osseuse pour éviter d’endommager le tissu cérébral.
- Retirer immédiatement le cerveau et fixer dans une solution de formaldéhyde tampon de 4 % pour 48 h à 4 oC.
- Bloquer les cerveaux en sections coronales de 5 mm du visage olfactif de l’ampoule au cortex visuel et aux cervelets et aux tiges cérébrales de deux fois.
- Après l’embâmage par la paraffine, couper les sections coronales et sagittales (5 m) du thalamus par sectionnement microtome.
6. Coloration et examen immunochimiques
- Placer délicatement les tranches sur des toboggans en verre avec une brosse molle, 1 tranche par lame.
- Produire la coloration immunochimique de l’APP.
- Déparaffiniser les tranches de xylène (3 fois pour 5 min chacune) et réhydrailler avec des concentrations graduellement réduites d’éthanol à température ambiante : 3 min en 100% d’éthanol deux fois, 3 min en 95% d’éthanol deux fois, 3 min dans 90% d’éthanol, 3 min dans 70% d’éthanol et 3 min en DDW.
- Traiter les sections cérébrales déparaffinisées et réhydratées avec 3 % H2O2 pendant 15 min à température ambiante pour bloquer l’activité endogène de peroxidase.
- Sections incubés avec 0,01 M de citrate de sodium (pH 6,0) à 98 oC pendant 5 minutes pour la récupération d’antigène.
- Garder les lames dans le tampon pendant 20 minutes à température ambiante pour refroidir.
- Laver les sections avec la solution saline tamponnée par le phosphate (PBS) deux fois pendant 5 min.
- Bloquez les sections avec un sérum normal de cheval de 2,5 % pendant 1 h à température ambiante et incuber toute la nuit à 4 oC dans l’anti-APP primaire de lapin (1:4000) dilué dans le sérum bloquant.
- Après l’incubation dans l’anticorps primaire, laver les sections dans PBS à température ambiante.
- Incuber les sections dans un anticorps secondaire biotinylé dilué de façon appropriée pendant 15 min et laver avec PBS pendant 3 minutes deux fois à température ambiante.
- Incuber en streptavidine-peroxidase pendant 15 min et laver à nouveau dans PBS pendant 3 minutes deux fois à température ambiante.
- Sections incubées avec solution de substrat tampon (pH 7.5) contenant du peroxyde d’hydrogène et 3,3-diaminobenzidine chromogen solution et protéger de la lumière jusqu’à ce que la couleur est développée.
- Incuber les diapositives avec DDW à température ambiante pendant 5 minutes afin d’arrêter la réaction.
- Sections de contre-vente avec hématoxyline pendant 3 min à température ambiante et laver pendant 5 min avec l’eau du robinet qui coule.
- Déshydrater les diapositives avec des concentrations d’éthanol progressivement croissantes à température ambiante : 2 min en DDW, 2 min en 70 % d’éthanol, 2 min en 90 % d’éthanol, 2 min en éthanol 95 %, 2 min en 100 % d’éthanol et 3 min en xylène trois fois.
- Sécher et monter avec le milieu de montage.
- Examinez les tranches sous le grossissement de microscope de 200x avec une lentille objective de 20 mm à l’aide d’un microscope.
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Representative Results
Le tableau 1 illustre le calendrier du protocole. Le taux de mortalité dans ce modèle de DAI était de 0%. Un test Mann-Whitney a indiqué que le déficit neurologique était significativement plus grand pour les 15 rats DAI par rapport aux 15 rats simulés à 48 heures après l’intervention (Mdn - 1 vs 0), U - 22,5, p 'lt; 0.001, r - 0.78 (voir tableau 2). Les données sont mesurées en nombres et sont présentées comme médianes et 25 à 75 percentiles.
Des photomicrographes représentatifs de sections thalamiques de tissus cérébraux sont indiqués à la figure 1. Les photomicrobographes ont révélé des immunoréactivités axonales et neuronales de l’AEC à la suite de DAI isolés chez les rats 48 heures après des blessures par rapport au groupe témoin (67,46 à 30 contre 0 et 0), U - 0, p 'lt; 1.1E-06, r ' 0.92. Les données sont mesurées sous forme de dénombrements et présentées comme moyennes et DD.
| Groupes | Temps | Procédures |
| DAI (15 rats) | 0 h | Induction Diffuse Axonal Injury |
| Sham (15 rats) | 48 h | Évaluation du score de gravité neurologique, |
| DAI (15 rats) | Coloration immunochimique de BAPP. |
Tableau 1 : Démonstration du calendrier du protocole. Les différents groupes de rats à différents moments sont montrés: DAI - Diffuse lésions cérébrales axonales au début de l’expérience; À 48 heures, un score de gravité neurologique a été déterminé et la coloration immunochimique de l’AAPP a été exécutée dans les deux groupes.
| Valeurs NSS des différents groupes à 48 heures | ||
| Groupe animal | ¡n | NSS 48 heures après DAI |
| Sham | 15 | 0 (0-0) |
| Dai | 15 | 1 (1-1)* |
Tableau 2: Score de gravité neurologique. Déficit neurologique 48 heures suivant DAI pour 2 groupes d’étude. Un test Mann-Whitney a indiqué que le déficit neurologique était significativement plus grand pour les 15 rats DAI par rapport aux 15 rats simulés à 48 heures après l’intervention (Mdn ' 1 vs 0), U - 22.5, p 'lt; 0.001, r ' 0.78. Les données sont mesurées en nombres et sont présentées comme médianes et 25 à 75 percentiles.
Figure 1: Examen immunochimique. Les photomicrographes représentatifs des sections thalamiques du tissu cérébral ont indiqué des immunoréactivités axonales et neuronales suivant le DAI isolé chez les rats (B) 48 heures après des dommages comparés au groupe témoin (A). L’immunoréactivité d’IAI a été détectée dans la région d’intérêt pour tous les 15 rats DAI, et pas du tout chez l’un des rats faux-opérés. Le test Mann-Whitney a indiqué que le nombre d’axones positifs d’IAI était significativement plus grand chez 15 rats DAI que pour les animaux blessés par des faux-similés à 48h après DAI (67,46 à 30 contre 0 et 0), U et 0, p’lt; 1,1E-06, r - 0,92. Les images sont au grossissement original de 200. Les données sont mesurées en nombre et présentées comme moyennes et SD. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole décrit un modèle de rongeur de DAI. Dans DAI, l’accélération rotationnelle sur le cerveau provoque un effet de cisaillement qui déclenche des changements axonaux et biochimiques qui conduisent à la perte de la fonction axonale dans un processus progressif. Les changements axonaux secondaires sont produits par une blessure rapide d’étirement axonal et sont variables dans leur étendue et la sévérité4,5,10. Dans les heures à quelques jours après la blessure primaire, les changements biochimiques entraîneront la perte de la fonction axonale4,5,10. Après la blessure, la perméabilité de la membrane axone change, permettant un afflux massif de calcium. La prise de calcium provoque les mitochondries à gonfler et à casser, libérant des caspases et déclenchant caspase médiation de la mort cellulaire progressive4,5,10,11,20. Les dommages axonaux secondaires peuvent se présenter sous la forme des ampoules axonales à l’extrémité rompue ou sous forme de varices le long de la longueur de l’axone4,21,22. La perte de la transition d’impulsion nerveuse est exprimée par l’agrégation de la protéine précurseur amyloïde (APP), une protéine transmémmbrène unique présente dans la plupart des cellules et des tissus4,23,24,25,26. L’analyse immunohistochimique de l’accumulation d’IAPP est actuellement la technique clinique et expérimentale d’étalon-or pour l’évaluation de DAI4,9,10,20,27. Des études ont rapporté l’immunoréactivité d’APP commençant approximativement 2 heures après la blessure, mais il y a des preuves que les changements continus se poursuivent pendant une ou plusieurs années après la blessure23,28,29. Les zones les plus vulnérables sont le tronc cérébral, la matière blanche parasagittale du cortex cérébral, et le corpus callosum11.
Les modèles animaux in vivo communs de DAI sont le modèle latéral de percussion fluide30,31, la blessure d’accélération d’impact32,33 et le modèle d’impact cortical contrôlé34,35,36. Ces modèles donnent des résultats utiles, mais avec des limites importantes.
Les modèles de percussion fluides dans les modèles animaux induisent des lésions cérébrales en injectant des volumes variables de saline dans la cavité crânienne fermée à la ligne médiane, en particulier dans les modèles de chat et de lapin, ou latéralement dans les modèles de rongeurs30,31. La gravité des blessures peut varier de légère à sévère en ajustant la pression du liquide. Bien que ce modèle soit fiable et reproductible, il n’est pas un modèle idéal de DAI humain, parce que la blessure aux percussions produit la contusion et/ou l’hémorragie sous-arachnoïdienne et le type d’impact primaire est distinct des blessures de la vie réelle37,38. En outre, les effets de la géométrie du cerveau et de la structure intracrânienne sur la direction, le déplacement et la vitesse font qu’il est très difficile d’effectuer une analyse biomécanique précise de la blessure39.
Le modèle de blessure d’accélérationd’impact 32,33 utilise des poids en laiton segmentés en chute libre d’une hauteur spécifiée à travers un tube guide de Plexiglas sur un casque métallique fixé par l’acrylique dentaire au vertx du crâne du rat. Ce modèle est peu coûteux, facile à exécuter, et peut produire DAI classé, mais il ya aussi une possibilité de contusions et fractures du crâne, compromettant la reproductibilité du modèle. En outre, la blessure induite implique un volume disproportionné plus faible du cerveau que chez les humains39.
Le modèle d’impact cortical contrôlé utilise un dispositif d’impact pneumatique ou électromagnétique pour conduire un impacteur rigide sur le dura exposé et entier par une craniotomie unilatérale, ce qui conduit à la déformation du cortex sous-jacent16,17. La pression de l’air est responsable de la vitesse d’impact, et la profondeur de la déformation corticale est réglementée par ajustement vertical de la barre transversale où le cylindre est attaché. Comme le modèle de percussion fluide, il provoque principalement des blessures focales.
En ce qui concerne ces inconvénients, un nouveau modèle de rongeur modifié a été développé avec l’ouverture du dura mater sur l’hémisphère contralatéral pour produire des dommages axonaux plus répandus40. Cependant, la plupart des modèles précédents nécessitent la craniotomie, et les résultats de la pathogénie axonale peuvent être affectés par la contusion et l’hémorragie qui apparaissent habituellement dans les modèles précédents. En outre, le mécanisme des dommages dans ces modèles est différent de l’ID humain causé par les mouvements d’accélération-décélération du cerveau.
Il y a plusieurs étapes dans le protocole qui sont critiques et méritent un examen minutieux. Il faut considérer que la tête du rat doit être fermement fixée aux broches d’oreille, ou le rat peut tomber de l’appareil. Lors de la chute, d’autres forces peuvent jouer un rôle qui aura une incidence sur l’exactitude de tout calcul. En outre, le poids du fer doit être le poids spécifique et a chuté à la hauteur spécifique mentionnée dans ce protocole. Ces mesures ont été déterminées empiriquement et sont des conditions obligatoires pour la reproduction du modèle. L’installation du cylindre en plastique doit se faire à un angle de 90 degrés par rapport au mécanisme de rotation, à savoir le boulon. C’est parce que c’est le coup au boulon qui conduit le mécanisme de rotation. Dans le cas contraire, le frottement du poids de fer par rapport au cylindre en plastique est introduit, ce qui conduira à une diminution de la force appliquée à la tête du rat.
Ce modèle présente certaines limites. Le développement du DAI chez l’homme est principalement secondaire à un impact d’un autre objet. Dans ce cas, soit la personne se déplace vers l’objet, l’objet se déplace vers la personne, ou ils se déplacent tous les deux vers l’autre. Dans une telle collision, un patient développe un traumatisme crânien combiné, où les dommages axonaux diffus ne sont qu’une partie de l’IBP. Ici, l’accélération rotationnelle appliquée est le principal mécanisme qui conduit au développement de DAI sans autres éléments de traumatisme crânien.
Le modèle proposé ici semble soulager les complications des fractures du crâne et des contusions qui ont causé des dommages à la matière blanche généralisée sans dommages supplémentaires limités. Semblable à d’autres modèles récents de rongeurs, ce modèle est efficace et fournit un faible (0%) taux de mortalité. Il s’agit d’une technique reproductible et abordable qui pourrait servir de ressource précieuse pour mieux comprendre la pathophysiologie de DAI pour développer des traitements plus efficaces.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le Dr Nathan Kleeorin (Département de génie mécanique de l’Université Ben-Gourion du Néguev) pour son aide aux mesures biomécaniques. En outre, nous remercions le professeur Olena Severynovska, Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko et Evgenia Goncharyk du Département de physiologie, faculté de biologie, d’écologie et de médecine, Oles Honchar Dnipro University, Dnipro, Ukraine pour son soutien et ses contributions utiles à nos discussions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M sodium citrate | SIGMA - ALDRICH | ||
| 2.5% normal horse serum | SIGMA - ALDRICH | H0146 | Liquid |
| 4 % buffered formaldehyde solution | |||
| Anti-Amyloid Precursor Protein, C - terminal antibodyproduced in rabbit | SIGMA - ALDRICH | Lot 056M4867V | |
| biotinylated secondary antibody | Vector | BA-1000-1.5 | 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin |
| bone-cutting forceps | |||
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine | vector laboratory | ||
| embedding cassettes | |||
| ethanol 99.9 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
| guillotine | |||
| Hematoxylin | SIGMA - ALDRICH | H3136-25G | |
| Hydrogen peroxide solution | Millipore | 88597-100ML-F | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| paraffine | paraplast plus leica biosystem | Tissue embedding medium | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | SIGMA - ALDRICH | P5368-10PAK | Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl - 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C. |
| Streptavidin HRP | ABCAM | ab64269 | Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry. |
| xylene |
References
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