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Neuroscience

Induktion von diffusen axonalen Hirnverletzungen bei Ratten basierend auf Rotationsbeschleunigung

Published: May 9, 2020 doi: 10.3791/61198
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll validiert ein zuverlässiges, einfach durchzuführendes und reproduzierbares Nagetiermodell der diffusen Axonalverletzung (DAI), das weit verbreitete Schäden an weißer Materie ohne Schädelfrakturen oder Prellungen verursacht.

Abstract

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind eine der Hauptursachen für Tod und Behinderung. Diffuse axonale Verletzungen (DAI) ist der vorherrschende Mechanismus der Verletzung bei einem großen Prozentsatz der TBI-Patienten, die stationär behandelt werden müssen. DAI beinhaltet weit verbreitete axonale Schäden durch Schüttel-, Rotations- oder Explosionsverletzungen, was zu schnellen axonalen Dehnungsverletzungen und sekundären axonalen Veränderungen führt, die mit einem lang anhaltenden Einfluss auf die funktionelle Wiederherstellung verbunden sind. Historisch gesehen waren experimentelle Modelle von DAI ohne Fokalverletzungen schwer zu entwerfen. Hier validieren wir ein einfaches, reproduzierbares und zuverlässiges Nagetiermodell von DAI, das weitverbreitete Schäden an weißer Materie ohne Schädelfrakturen oder Prellungen verursacht.

Introduction

Traumatische Hirnverletzungen (TBI) sind eine der Hauptursachen für Tod und Behinderung in den Vereinigten Staaten. TbIs tragen zu etwa 30% aller verletzungsbedingten Todesfällebei 1,2. Die Hauptursachen von TBI unterscheiden sich zwischen den Altersgruppen und umfassen Stürze, Hochgeschwindigkeitskollisionen beim Sport, vorsätzliche Selbstverletzung, Autounfälle und Übergriffe1,2,3.

Hirndiffuse axonale Verletzung (DAI) ist eine spezifische Art von TBI durch Rotationsbeschleunigung, Schütteln oder Explosion Verletzung des Gehirns infolge einer uneingeschränkten Kopfbewegung im Augenblick nach Derverletzung4,5,6,7,8induziert. DAI beinhaltet weit verbreitete axonale Schäden, die zu lang anhaltenden neurologischen Beeinträchtigungen führen, die mit schlechtem Ergebnis, belastenden Gesundheitskosten und einer 33-64% Sterblichkeitsrate1,2,4,5,9,10,11verbunden sind. Trotz signifikanter neuer erforschungder E-Krankheit von DAI, gab es keinen Konsens über die besten Behandlungsmöglichkeiten11,12,13,14.

In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche experimentelle Modelle versucht, verschiedene Aspekte von DAI11,12,15,16genau zu replizieren. Diese Modelle haben jedoch Einschränkungen angesichts der einzigartigen Darstellung von DAI im Vergleich zu anderen fokalen Verletzungen. Diese früheren Modelle verursachen nicht nur axonale Verletzungen in weißen Materieregionen, sondern führen auch zu fokalen Hirnverletzungen. Klinisch wird DAI von Mikroblutungen begleitet, die eine Hauptursache für Schäden an weißer Materie darstellen können.

Es wurde nur gezeigt, dass zwei Tiermodelle die wichtigsten klinischen Merkmale von DAI replizieren. Gennarelli und Kollegen produzierten 1982 das erste seitliche Kopfrotationsgerät, das die Rotationsbeschleunigung ohne Aufprallkopf benutzte, um mit DAI in einem nichtmenschlichen Primatenmodell15komaieren zu können. Dieses Primatenmodell verwendete eine kontrollierte Einzelrotation zur Beschleunigung und Verzögerung, um den Kopf innerhalb von 10-20 ms um 60° zu verdrängen. Diese Technik war in der Lage, bewusstseinsbeeinträchtigtes Bewusstsein und weit verbreitete axonale Schäden zu emulieren, die den Auswirkungen schwerer TBI ähnelten, die im menschlichen Gehirn beobachtet wurden. Primatenmodelle sind jedoch sehr teuer4,11,16. Basierend auf dem Vorgängermodell wurde 1994 ein Schweinemodell der Rotationsbeschleunigung sbrain injury (Ross et al.) mit ähnlichen Ergebnissen14entwickelt.

Diese beiden Tiermodelle, obwohl sie unterschiedliche Darstellungen typischer Pathologie produzierten, haben die Konzepte der DAI-Pathogenese stark erweitert. Schnelle Kopfrotation wird allgemein als die beste Methode zur Induktion von DAI akzeptiert, und Nagetiere bieten ein kostengünstigeres Modell für die schnellen Kopfrotationsstudien11,16. Hier validieren wir ein einfaches, reproduzierbares und zuverlässiges Nagetiermodell von DAI, das weitverbreitete Schäden an weißer Materie ohne Schädelfrakturen oder Prellungen verursacht. Dieses aktuelle Modell wird ein besseres Verständnis der Pathophysiologie von DAI und die Entwicklung wirksamerer Behandlungen ermöglichen.

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Protocol

Die Versuche wurden im Anschluß an die Empfehlungen der Erklärungen von Helsinki und Tokio sowie der Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Die Experimente wurden vom Animal Care Committee der Ben-Gurion University of the Negev genehmigt.

1. Vorbereitung von Ratten auf das Experimentelle Verfahren

HINWEIS: Wählen Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 300-350 g.

  1. Die Genehmigung für die Durchführung dieser Experimente wird vom Institutional Animal Care and Use Committee einholen.
  2. Halten Sie Ratten bei einer Raumtemperatur von 22 °C bei 1 °C, mit 12 Stunden Licht und 12 Stunden dunklen Zyklen. Geben Sie Ratte Chow und Wasser ad libitum.
  3. Führen Sie alle Experimente zwischen 6:00 Uhr und 12:00 Uhr durch.
  4. Verwenden Sie ein kontinuierliches Isofluran-Verabreichungssystem, um Anästhesie zu induzieren. Stellen Sie sicher, dass das Verdampfersystem mit Isofluran gefüllt ist.
    1. Anästhesisieren Sie die Ratten mit 2% Isofluran.
    2. Bestätigen Sie, dass die Ratte vollständig betäuisiert wird, indem Sie einen Mangel an Bewegung oder Pedalreflex als Reaktion auf äußere Reize beobachten.

2. Induktion von diffusen axonalen Verletzungen

ANMERKUNG: Das Gerät besteht aus folgenden Komponenten: 1) transparenter Kunststoffzylinder, 2) Eisengewicht (1308 g), 3) Rotationsmechanismus bestehend aus einem zylindrischen Rohr, zwei Lagern, an denen sich die Achse dreht, und einer Kopfbefestigung (für Ohrstifte); 4) horizontale Plattform, auf der zwei Lager befestigt sind.

  1. Stellen Sie das Gerät auf einen schweren, stabilen Labortisch.
  2. Befestigen Sie das Gewicht an einer Zeichenfolge, die auf eine Höhe von 120 cm erhöht ist.
  3. Lassen Sie das frei fallende Gewicht die Schraube treffen und aktivieren Sie den Rotationsmechanismus. Mit hilfe der seitlichen Kopfdrehvorrichtung wird der Kopf des Nagers schnell von 0 auf 90° gedreht.
  4. Nach der Induktion einer diffusen axonalen Hirnverletzung, übertragen Sie die Ratte in einen Erholungsraum.

3. Messung der Rotationskinematik/Biomechanische Natik.

  1. Messen Sie die Rotationskinematik/biomechanischen Parameter wie folgt:
    Equation 1
    Equation 2
    Equation 3
    wobei Fo - Kraft auf den Tierkopf angewendet wird (kg); M – Moment der Gewalt; K – kinetische Energie; m – Masse des fallenden Gewichts; g - Gravitationsbeschleunigung; h – Höhe (cm); D – Abstand zwischen den Ohrnadeln (cm).
    ANMERKUNG: Um die Kraft auf den Kopf des Tieres (Fo) zu berechnen, ist es notwendig, die Masse des fallenden Gewichts, die Höhe, in der das Gewicht fällt, und den Abstand zwischen den Ohrnadeln zu kennen. Die anderen Parameter bleiben unverändert.

4. Bewertung des neurologischen Schweregrads nach 48 Stunden

HINWEIS: Neurologische Defizite wurden mit einem neurologischen Schweregrad bewertet und bewertet, wie zuvor beschrieben17,18,19. Veränderungen in motorischer Funktion und Verhalten werden von einem Punktsystem so bewertet, dass eine maximale Punktzahl von 24 eine schwere neurologische Dysfunktion darstellt. Eine Punktzahl von 0 gibt einen intakten neurologischen Status an. Die folgenden Verhaltensfunktionen werden bewertet.

  1. Bewerten Sie die Unfähigkeit der Ratte, aus einem Kreis (50 cm Durchmesser) zu verlassen, wenn sie in der Mitte gelassen wird. Führen Sie dies für drei Einzelsitzungen mit einer Dauer von 30 min, 60 min und mehr als 60 min durch.
  2. Testen Sie die Ratte auf einen Verlust des Rechtenreflexes in drei Sitzungen mit einer Dauer von 20 min, 40 min und über 60 min.
  3. Führen Sie den Test für Hemiplegie, die Unfähigkeit der Ratte, erzwungene Veränderungen in der Position zu widerstehen.
  4. Heben Sie die Ratte um ihren Schwanz, um die Beugung des Hinterteils zu testen.
  5. Legen Sie die Ratte auf den Boden, um ihre Fähigkeit zu testen, gerade zu gehen.
  6. Test auf drei verschiedene Reflexe: den Pinnareflex, den Hornhautreflex und den Entzündungsreflex.
  7. Bewerten Sie die Ratte mit einem klinischen Grad basierend auf Verlust des Suchverhaltens und Prostration.
  8. Testen Sie Gliedmaßenreflexe für die Platzierung. Führen Sie den Test auf der linken und rechten Vorderbeine, und dann die linke und rechte Hinterbeine.
  9. Führen Sie einen Funktionstest über die Strahlausgleichsaufgabe durch. Der Strahl sollte 1,5 cm breit sein. Führen Sie den Test für Sitzungen mit 20 s, 40 s und mehr als 60 s aus.
  10. Führen Sie einen Balken-Walking-Test an der Ratte mit Balken in drei verschiedenen Breiten durch: 8,5 cm breit, 5 cm breit und 2,5 cm breit.

5. Hirnsammlung zur histologischen Untersuchung nach 48 Stunden

  1. Nach 48 Stunden nach der Verletzung die Ratten einschläfern, indem sie ihr inspiriertes Gasgemisch durch 20% O2/80% CO2ersetzen. Stellen Sie sicher, dass CO2 gemäß den Richtlinien des Institutionellen Tierschutz- und Nutzungsausschusses zu einem vorgegebenen Preis geliefert wird.
    1. Stellen Sie die Sterbebestätigung in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee sicher.
  2. Transkardial perfuse die Ratte mit 0,9% heparinisierter Saline bei einer Temperatur von 4 °C, gefolgt von 500 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer-Saline (pH 7,4).
  3. Führen Sie nach der Perfusion die Enthauptung mit einer Guillotine durch.
  4. Führen Sie die Gehirnsammlung durch Entfernen der Calvarien mit Knochenschneiden Zangen, um schädliches Gehirngewebe zu vermeiden.
  5. Entfernen Sie das Gehirn sofort und fixieren Sie in einer 4% gepufferten Formaldehyd-Lösung für 48 h bei 4 °C.
  6. Blockieren Sie Gehirne in 5 mm koronalen Abschnitten von der olfaktorischen Glühbirne Gesicht zum visuellen Kortex und Bisect Kleinhirne und Hirnstämme.
  7. Nach Paraffineinbettung, schneiden Koronaoder und sagittale Abschnitte (5 m) durch Mikrotome-Sektion vom Thalamus weg.

6. Immunchemische Färbung und Untersuchung

  1. Legen Sie die Scheiben vorsichtig auf Glasgweise mit einem weichen Pinsel, 1 Scheibe pro Folie.
  2. Produzieren Sie eine immunchemische Färbung von APP.
    1. Scheiben mit Xylol deparaffinisieren (3 mal für je 5 min) und mit allmählich reduzierten Ethanolkonzentrationen bei Raumtemperatur rehydrieren: 3 min 100% Ethanol zweimal, 3 min 95% Ethanol zweimal, 3 min in 90% Ethanol, 3 min in 70% Ethanol und 3 min in DDW.
    2. Behandeln Sie deparaffinierte und rehydrierte Hirnabschnitte mit 3%H2O2 für 15 min bei Raumtemperatur, um die endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren.
    3. Inkubieren Sie Abschnitte mit 0,01 M Natriumcitrat (pH 6,0) bei 98 °C für 5 min für Antigenrückgewinnung.
    4. Halten Sie die Dias im Puffer für 20 min bei Raumtemperatur abkühlen.
    5. Abschnitte mit phosphatgepufferter Saline-Lösung (PBS) zweimal für 5 min waschen.
    6. Blockieren Sie die Abschnitte mit 2,5% normalem Pferdeserum für 1 h bei Raumtemperatur und inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C in Primärkaninchen Anti-APP (1:4000) im blockierenden Serum verdünnt.
    7. Nach der Inkubation im Primärantikörper die Abschnitte in PBS bei Raumtemperatur waschen.
    8. Inkubieren Sie Abschnitte in entsprechend verdünnten biotinylierten Sekundärantikörpern für 15 min und waschen Sie sie zweimal bei Raumtemperatur mit PBS.
    9. In stronavidin-peroxidase für 15 min inkubieren und zweimal bei Raumtemperatur 3 min in PBS waschen.
    10. Inkubieren Abschnitte mit gepufferter Substratlösung (pH 7.5), die Wasserstoffperoxid und 3,3-Diaminobenzidin-Chromogenlösung enthält und vor Licht schützen, bis die Farbe entwickelt wird.
    11. Inkubieren Sie die Dias mit DDW bei Raumtemperatur für 5 min, um die Reaktion zu stoppen.
    12. Counterstain Abschnitte mit Hämatoxylin für 3 min bei Raumtemperatur und waschen für 5 min mit fließendem Leitungswasser.
    13. Dehydrieren Sie die Dias mit allmählich steigenden Konzentrationen von Ethanol bei Raumtemperatur: 2 min in DDW, 2 min in 70% Ethanol, 2 min in 90% Ethanol, 2 min in Ethanol 95%, 2 min in 100% Ethanol und 3 min in Xylol dreimal.
    14. Trocken und montieren mit Montagemedium.
  3. Untersuchen Sie die Scheiben unter dem Mikroskop Vergrößerung von 200x mit einer 20 mm Objektivlinse mit einem Mikroskop.

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Representative Results

Tabelle 1 veranschaulicht die Protokollzeitachse. Die Sterblichkeitsrate in diesem DAI-Modell betrug 0%. Ein Mann-Whitney-Test zeigte, dass das neurologische Defizit bei den 15 DAI-Ratten signifikant größer war als bei den 15 Scheinratten nach 48 Stunden nach Intervention (Mdn = 1 vs. 0), U = 22,5, p < 0,001, r = 0,78 (siehe Tabelle 2). Die Daten werden in Zahlen gemessen und als Median- und 25-75-Perzentilbereich dargestellt.

Repräsentative Photomikroskope von thalamischen Abschnitten des Hirngewebes sind in Abbildung 1dargestellt. Photomikroskope zeigten axonale und neuronale 'APP-Immunreaktivitäten nach isolierten DAI bei Ratten 48 Stunden nach einer Verletzung im Vergleich zur Kontrollgruppe (67,46 x 30 vs. 0 x 0), U = 0, p < 1.1E-06, r = 0,92. Die Daten werden als Zählungen gemessen und als Mittelwert sD dargestellt.

Gruppen Zeit Verfahren
DAI (15 Ratten) 0 h Induktion Diffuse Axonal Injury
Schein (15 Ratten) 48 h Neurologische Schweregrad-Score-Bewertung,
DAI (15 Ratten) Immunchemische Färbung von BAPP.

Tabelle 1: Demonstration der Protokollzeitachse. Die verschiedenen Gruppen von Ratten zu unterschiedlichen Zeiten werden gezeigt: DAI = Diffuse axonale Hirnverletzung zu Beginn des Experiments; Nach 48 Stunden wurde ein neurologischer Schweregrad-Score ermittelt und in beiden Gruppen eine immunchemische Färbung von APP durchgeführt.

NSS-Werte der verschiedenen Gruppen nach 48 Stunden
Tiergruppe N NSS 48 Stunden nach DAI
Sham 15 0 (0-0)
Dai 15 1 (1-1)*

Tabelle 2: Neurologischer Schweregrad. Neurologisches Defizit 48 Stunden nach DAI für 2 Studiengruppen. Ein Mann-Whitney-Test zeigte, dass das neurologische Defizit bei den 15 DAI-Ratten signifikant größer war als bei den 15 Scheinratten nach 48 Stunden nach Intervention (Mdn = 1 vs. 0), U = 22,5, p < 0,001, r = 0,78. Die Daten werden in Zahlen gemessen und als Median- und 25-75-Perzentilbereich dargestellt.

Figure 1
Abbildung 1: Immunchemische Untersuchung. Repräsentative Photomikroskope von thalamischen Abschnitten des Hirngewebes zeigten axonale und neuronale Immunreaktivität nach isoliertem DAI bei Ratten (B) 48 Stunden nach einer Verletzung im Vergleich zur Kontrollgruppe (A). Die APP-Immunreaktivität wurde in der Region von Interesse bei allen 15 DAI-Ratten nachgewiesen, und überhaupt nicht bei einer der scheinoperierten Ratten. Der Mann-Whitney-Test zeigte, dass die Anzahl der app-positiven Axone bei 15 DAI-Ratten signifikant größer war als bei scheinverletzten Tieren bei 48h nach DAI (67,46 x 30 vs. 0 x 0), U = 0, p < 1,1E-06, r = 0,92. Die Bilder befinden sich in der ursprünglichen Vergrößerung * 200. Die Daten werden als Zählungen gemessen und als Mittelwert sD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt ein Nagetiermodell von DAI. In DAI verursacht die Rotationsbeschleunigung im Gehirn einen Schereffekt, der axonale und biochemische Veränderungen auslöst, die in einem progressiven Prozess zum Verlust der axonalen Funktion führen. Sekundäre axonale Veränderungen werden durch eine schnelle axonale Dehnungsverletzung erzeugt und sind in Ihrem Ausmaß und Schweregradvariabel 4,5,10. Innerhalb von Stunden bis Tagen nach der primären Verletzung führen biochemische Veränderungen zum Verlust der axonalen Funktion4,5,10. Nach der Verletzung ändert sich die Durchlässigkeit der Axonmembran und ermöglicht einen massiven Kalziumzufluss. Die Aufnahme von Kalzium bewirkt, dass die Mitochondrien anschwellen und brechen, Caspasen freisetzen und Caspase vermittelt enden progressiven Zelltod4,5,10,11,20. Sekundäre axonale Verletzungen können in Form der Axonzwiebeln am gebrochenen Ende oder in Form von Varikositäten entlang der Länge des Axons4,21,22vorhanden sein. Der Verlust des Nervenimpulsübergangs wird durch die Aggregation des A-Amyloid-Vorläuferproteins (-APP) ausgedrückt, einem einzelnen Transmembranprotein, das in den meisten Zellen und Geweben4,23,24,25,26vorhanden ist. Die immunhistochemische Analyse der Akkumulation von APP ist derzeit die klinische und experimentelle Goldstandard-Technik zur Beurteilung von DAI4,9,10,20,27. Studien haben berichtet, dass die Immunreaktivität von APP etwa 2 Stunden nach der Verletzung beginnt, aber es gibt Hinweise darauf, dass die laufenden Veränderungen für ein oder mehrere Jahre nach der Verletzunganhalten 23,28,29. Die am stärksten gefährdeten Bereiche sind der Hirnstamm, parasagittale weiße Materie der Großhirnrinde und Corpus callosum11.

Häufige in vivo Tiermodelle von DAI sind das laterale Fluid Percussion Modell30,31, die Schlagbeschleunigungsverletzung32,33 und das kontrollierte kortikale Schlagmodell34,35,36. Diese Modelle liefern einige nützliche Ergebnisse, jedoch mit erheblichen Einschränkungen.

Fluid-Percussion-Modelle in Tiermodellen induzieren Hirnverletzungen, indem sie unterschiedliche Mengen an Saline in die geschlossene Schädelhöhle an der Mittellinie injizieren, insbesondere in Katzen- und Kaninchenmodellen oder seitlich in Nagetiermodellen30,31. Die Schwere der Verletzungen kann durch Einstellen des Flüssigkeitsdrucks von leicht bis schwer variiert werden. Obwohl dieses Modell zuverlässig und reproduzierbar ist, ist es kein ideales Modell der menschlichen DAI, da Perkussionsverletzungen Prellungen und/oder subarachnoidale Blutungen verursachen und die Art der primären Auswirkungen von realen Verletzungen37,38unterschieden wird. Darüber hinaus machen die Auswirkungen der Gehirngeometrie und der intrakraniellen Struktur auf Richtung, Verschiebung und Geschwindigkeit es sehr schwierig, eine präzise biomechanische Analyse der Verletzung39durchzuführen.

Das Aufprallbeschleunigungs-Verletzungsmodell32,33 verwendet segmentierte Messinggewichte, die frei von einer bestimmten Höhe durch ein Plexiglas-Führungsrohr auf einen Metallhelm fallen, der von Dental-Acryl an den Schädelscheitelpunkt der Ratte befestigt ist. Dieses Modell ist kostengünstig, einfach durchzuführen und kann abgestuftes DAI produzieren, aber es besteht auch die Möglichkeit von Prellungen und Schädelfrakturen, wodurch die Reproduzierbarkeit des Modells beeinträchtigt wird. Darüber hinaus beinhaltet die induzierte Verletzung ein überproportional geringeres Volumen des Gehirns als beim Menschen39.

Das Modell der kontrollierten kortikalen Schlagmittel verwendet eine pneumatische oder elektromagnetische Aufprallvorrichtung, um einen starren Stoßkörper auf die exponierte, ganze Dura durch eine einseitige Kraniotomie zu treiben, die zu einer Verformung des darunter liegenden Kortex16,17führt. Der Luftdruck ist für die Aufprallgeschwindigkeit verantwortlich, und die Tiefe der kortikalen Verformung wird durch vertikale Einstellung der Querstange geregelt, an der der Zylinder befestigt ist. Wie das Fluid Percussion-Modell verursacht es hauptsächlich fokale Verletzungen.

In Bezug auf diese Nachteile wurde ein neues modifiziertes Nagetiermodell mit Öffnung des Dura mater über die kontralaterale Hemisphäre entwickelt, um eine weiter verbreitete axonale Verletzung zu erzeugen40. Die meisten früheren Modelle erfordern jedoch eine Kraniotomie, und die Ergebnisse der axonalen Pathogenese können durch Prellungen und Blutungen beeinflusst werden, die normalerweise in früheren Modellen auftreten. Darüber hinaus unterscheidet sich der Mechanismus der Verletzung in diesen Modellen von der menschlichen DAI, die durch die Beschleunigungs-Verzögerungsbewegungen des Gehirns verursacht wird.

Es gibt mehrere Schritte im Protokoll, die kritisch sind und sorgfältig geprüft werden müssen. Man sollte bedenken, dass der Kopf der Ratte fest an den Ohrnadeln befestigt werden sollte, oder die Ratte kann vom Gerät fallen. Beim Fallen können andere Kräfte eine Rolle spielen, die sich auf die Genauigkeit aller Berechnungen auswirkt. Außerdem muss das Eisengewicht das spezifische Gewicht sein und auf die in diesem Protokoll erwähnte spezifische Höhe fallen. Diese Messungen wurden empirisch ermittelt und sind zwingende Voraussetzungen für die Reproduktion des Modells. Der Einbau des Kunststoffzylinders sollte in einem Winkel von 90° relativ zum Rotationsmechanismus, nämlich der Schraube, erfolgen. Dies liegt daran, dass es der Schlag auf die Schraube ist, der den Rotationsmechanismus antreibt. Andernfalls wird die Reibung des Eisengewichts relativ zum Kunststoffzylinder eingeführt, was zu einer Abnahme der auf den Kopf der Ratte ausgeübten Kraft führt.

Es gibt einige Einschränkungen für dieses Modell. Die Entwicklung von DAI beim Menschen ist hauptsächlich zweitrangig für einen Einfluss eines anderen Objekts. In diesem Fall bewegt sich entweder die Person auf das Objekt zu, das Objekt bewegt sich auf die Person zu, oder sie bewegen sich beide aufeinander zu. Bei einem solchen Zusammenstoß entwickelt ein Patient eine kombinierte Kopfverletzung, bei der diffuse Axonschäden nur ein Teil des TBI sind. Hier ist die angewandte Rotationsbeschleunigung der Hauptmechanismus, der zur Entwicklung von DAI ohne andere Elemente von Kopfverletzungen führt.

Das hier vorgeschlagene Modell scheint die Komplikationen von Schädelfrakturen und Prellungen zu lindern, die weitverbreitete Schäden an weißer Materie ohne begrenzte zusätzliche Verletzungen verursachten. Ähnlich wie bei anderen jüngeren Nagetiermodellen ist dieses Modell wirksam und bietet einen niedrigen (0%) Sterblichkeit. Es ist eine reproduzierbare und erschwingliche Technik, die als wertvolle Ressource für ein besseres Verständnis der Pathophysiologie von DAI dienen könnte, um effektivere Behandlungen zu entwickeln.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Nathan Kleeorin (Department of Mechanical Engineering, Ben-Gurion University of the Negev) für seine Unterstützung bei den biomechanischen Messungen. Wir danken auch Professor Olena Severynovska, Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko und Evgenia Goncharyk von der Abteilung für Physiologie, Fakultät für Biologie, Ökologie und Medizin, Oles Honchar Dnipro Universität, Dnipro, Ukraine für ihre Unterstützung und hilfreiche Beiträge zu unseren Diskussionen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M sodium citrate SIGMA - ALDRICH
2.5% normal horse serum SIGMA - ALDRICH H0146 Liquid
4 % buffered formaldehyde solution
Anti-Amyloid Precursor Protein, C - terminal antibodyproduced in rabbit SIGMA - ALDRICH Lot 056M4867V
biotinylated secondary antibody Vector BA-1000-1.5 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin
bone-cutting forceps
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine vector laboratory
embedding cassettes
ethanol 99.9 % ROMICAL Flammable Liquid
guillotine
Hematoxylin SIGMA - ALDRICH H3136-25G
Hydrogen peroxide solution Millipore 88597-100ML-F
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc
Olympus BX 40 microscope Olympus
paraffine paraplast plus leica biosystem Tissue embedding medium
phosphate-buffered saline (PBS) SIGMA - ALDRICH P5368-10PAK Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl - 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C.
Streptavidin HRP ABCAM ab64269 Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry.
xylene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faul, M., Wald, M. M., Xu, L., Coronado, V. G. Traumatic brain injury in the United States; emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. US Government. , (2010).
  2. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. MMWR Surveillance Summaries. 66, 1-16 (2017).
  3. Peterson, A. B., Xu, L., Daugherty, J., Breiding, M. J. Surveillance report of traumatic brain injury-related emergency department visits, hospitalizations, and deaths, United States, 2014. US Government. , (2014).
  4. Su, E., Bell, M. Diffuse axonal injury. Translational Research in Traumatic Brain Injury. 57, 41 (2016).
  5. Hammoud, D. A., Wasserman, B. A. Diffuse axonal injuries: pathophysiology and imaging. Neuroimaging Clinics. 12, 205-216 (2002).
  6. Adams, J. H., Graham, D. I., Gennarelli, T. A., Maxwell, W. L. Diffuse axonal injury in non-missile head injury. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 54, 481-483 (1991).
  7. Slazinski, T., Johnson, M. C. Severe diffuse axonal injury in adults and children. Journal of Neuroscience Nursing. 26, 151-154 (1994).
  8. Gentleman, S. M., et al. Axonal injury: a universal consequence of fatal closed head injury. Acta Neuropathologica. 89, 537-543 (1995).
  9. Marehbian, J., Muehlschlegel, S., Edlow, B. L., Hinson, H. E., Hwang, D. Y. Medical Management of the Severe Traumatic Brain Injury Patient. Neurocritical Care. 27, 430-446 (2017).
  10. Adams, J. H., et al. Diffuse axonal injury in head injury: definition, diagnosis and grading. Histopathology. 15, 49-59 (1989).
  11. Xiao-Sheng, H., Sheng-Yu, Y., Xiang, Z., Zhou, F., Jian-ning, Z. Diffuse axonal injury due to lateral head rotation in a rat model. Journal of Neurosurgery. 93, 626-633 (2000).
  12. Ross, D. T., Meaney, D. F., Sabol, M. K., Smith, D. H., Gennarelli, T. A. Distribution of forebrain diffuse axonal injury following inertial closed head injury in miniature swine. Experimental Neurology. 126, 291-299 (1994).
  13. Bullock, R. Opportunities for neuroprotective drugs in clinical management of head injury. Journal of Emergency Medicine. 11, Suppl 1 23-30 (1993).
  14. Gennarelli, T. A. Mechanisms of brain injury. Journal of Emergency Medicine. 11, Suppl 1 5-11 (1993).
  15. Gennarelli, T. A., et al. Diffuse axonal injury and traumatic coma in the primate. Annals of Neurology. 12, 564-574 (1982).
  16. Xiaoshengi, H., Guitao, Y., Xiang, Z., Zhou, F. A morphological study of diffuse axonal injury in a rat model by lateral head rotation trauma. Acta Neurologica Belgica. 110, 49-56 (2010).
  17. Zlotnik, A., et al. beta2 adrenergic-mediated reduction of blood glutamate levels and improved neurological outcome after traumatic brain injury in rats. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 24, 30-38 (2012).
  18. Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedures Online. 21, 9 (2019).
  19. Boyko, M., et al. The neuro-behavioral profile in rats after subarachnoid hemorrhage. Brain Research. 1491, 109-116 (2013).
  20. Ma, J., Zhang, K., Wang, Z., Chen, G. Progress of Research on Diffuse Axonal Injury after Traumatic Brain Injury. Neural Plasticity. 2016, 9746313 (2016).
  21. Medana, I. M., Esiri, M. M. Axonal damage: a key predictor of outcome in human CNS diseases. Brain. 126, 515-530 (2003).
  22. Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Experimental Neurology. 233, 364-372 (2012).
  23. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Traumatic brain injury and amyloid-beta pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neuroscience. 11, 361-370 (2010).
  24. Sherriff, F. E., Bridges, L. R., Sivaloganathan, S. Early detection of axonal injury after human head trauma using immunocytochemistry for beta-amyloid precursor protein. Acta Neuropathologica. 87, 55-62 (1994).
  25. Reichard, R. R., White, C. L., Hladik, C. L., Dolinak, D. Beta-amyloid precursor protein staining of nonaccidental central nervous system injury in pediatric autopsies. Journal of Neurotrauma. 20, 347-355 (2003).
  26. Gentleman, S. M., Nash, M. J., Sweeting, C. J., Graham, D. I., Roberts, G. W. Beta-amyloid precursor protein (beta APP) as a marker for axonal injury after head injury. Neuroscience Letters. 160, 139-144 (1993).
  27. Smith, D. H., Hicks, R., Povlishock, J. T. Therapy development for diffuse axonal injury. Journal of Neurotrauma. 30, 307-323 (2013).
  28. McKenzie, K. J., et al. Is beta-APP a marker of axonal damage in short-surviving head injury. Acta Neuropathologica. 92, 608-613 (1996).
  29. Wilkinson, A., Bridges, L., Sivaloganathan, S. Correlation of survival time with size of axonal swellings in diffuse axonal injury. Acta Neuropathologicaogica. 98, 197-202 (1999).
  30. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  31. Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , e3063 (2011).
  32. Povlishock, J., Marmarou, A., McIntosh, T., Trojanowski, J., Moroi, J. Impact acceleration injury in the rat: evidence for focal axolemmal change and related neurofilament sidearm alteration. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56, 347-359 (1997).
  33. Heath, D. L., Vink, R. Impact acceleration-induced severe diffuse axonal injury in rats: characterization of phosphate metabolism and neurologic outcome. Journal of Neurotrauma. 12, 1027-1034 (1995).
  34. Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. Journal of Neurotrauma. 5, 1-15 (1988).
  35. Palmer, A. M., et al. Traumatic brain injury-induced excitotoxicity assessed in a controlled cortical impact model. Journal of Neurochemistry. 61, 2015-2024 (1993).
  36. Hamm, R. J., et al. Cognitive deficits following traumatic brain injury produced by controlled cortical impact. Journal of Neurotrauma. 9, 11-20 (1992).
  37. Nyanzu, M., et al. Improving on Laboratory Traumatic Brain Injury Models to Achieve Better Results. International Journal of Medical Sciences. 14, 494-505 (2017).
  38. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
  39. Lighthall, J. W., Dixon, C. E., Anderson, T. E. Experimental models of brain injury. Journal of Neurotrauma. 6, 83-97 (1989).
  40. Meaney, D. F., et al. Modification of the cortical impact model to produce axonal injury in the rat cerebral cortex. Journal of Neurotrauma. 11, 599-612 (1994).

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Neurowissenschaften Ausgabe 159 Diffuse axonale Verletzung (DAI) traumatische Hirnverletzung (TBI) Rotationsbeschleunigung Rattenmodell weiße Materie Dehnungsverletzung
Induktion von diffusen axonalen Hirnverletzungen bei Ratten basierend auf Rotationsbeschleunigung
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Frank, D., Melamed, I., Gruenbaum,More

Frank, D., Melamed, I., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Kuts, R., Shvartsur, R., Azab, A. N., Assadi, M. H., Vinokur, M., Boyko, M. Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration. J. Vis. Exp. (159), e61198, doi:10.3791/61198 (2020).

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