Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

אינדוקציה של פגיעה מוחית Axonal בחולדות מבוסס על האצת הסיבוב

Published: May 9, 2020 doi: 10.3791/61198
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1, 1, 4, 4, 5, 1, 1
1Division of Anesthesia and Critical Care, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Anesthesiology, Yale University School of Medicine, 4Recanati School for Community Health Professions, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 5Department of microbiology and immunology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מאמת אמין, קל לבצע ולהציג מכרסם מודל של פגיעה במוח מפוזר סיבי (DAI) הגורמת נזק לבנים נרחבים ללא שברים הגולגולת או חבורות.

Abstract

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא גורם מרכזי למוות ולנכות. לפזר פציעה סיבי (DAI) הוא המנגנון השולט של פציעה באחוז גדול של מטופלים tbi הדורשים אשפוז. דאי כרוך נזק סיבי נרחב מטלטול, סיבוב או פציעה הפיצוץ, המוביל לפגיעה מהירה סיבי מתיחה ושינויים סיבי משניים המשויכים השפעה ארוכת טווח על התאוששות תפקודית. מבחינה היסטורית, מודלים ניסיוניים של DAI ללא פגיעה מוקד היו קשים לעיצוב. כאן אנו מאמתים מודל פשוט, מכרסם ואמין של מכרסמים של DAI הגורמת נזק לבנים נרחבים ללא שברים בגולגולת או חבורות.

Introduction

פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא גורם מרכזי למוות ולנכות בארצות הברית. Tbis תורמים כ -30% ממקרי המוות הקשורים לפציעה1,2. הגורמים המובילים של tbi שונים בין קבוצות הגיל וכוללים נפילות, התנגשויות במהירות גבוהה במהלך הספורט, פגיעה עצמית מכוונת, מנוע הרכב קריסות ותקיפות1,2,3.

המוח פגיעה סיבי (DAI) הוא סוג מסוים של tbi הנגרמת על ידי האצת סיבוב, טלטול או פגיעה הפיצוץ של המוח כתוצאה מתנועת הראש בלתי מוגבל ברגע לאחר פציעה4,5,6,7,8. דאי כרוך נזק סיבי נרחב המוביל לפגיעה נוירולוגית ארוכת טווח המשויך התוצאה הגרועה, עיק בריאות הטיפול עלויות, ו 33-64% שיעור תמותה1,2,4,5,9,10,11. למרות מחקר משמעותי לאחרונה לתוך הפתוגנזה של דאי, לא היה קונצנזוס על אפשרויות הטיפול הטוב ביותר11,12,13,14.

בעשורים האחרונים, מודלים ניסיוניים רבים ניסו לשכפל במדויק היבטים שונים של דאי11,12,15,16. עם זאת, מודלים אלה יש מגבלות בהתחשב התצוגה הייחודית של DAI לעומת פציעות מוקד אחרות. אלה דגמים קודמים לא רק לגרום לפציעה סיבי באזורים החומר הלבן אלא גם לגרום לפציעות מוחין מוקד. מבחינה קלינית, דאי מלווה בדימום מידי מיקרו, העשוי להוות גורם מרכזי לנזק לחומר הלבן.

רק שני דגמי בעלי חיים הוכחו לשכפל את התכונות הקליניות מפתח של DAI. Gennarelli ועמיתיו הפיק את המכשיר הראשון סיבוב הראש לרוחב ב 1982, באמצעות האצת שאינם השפעה הסיבוב הראש כדי לגרום לתרדמת עם DAI במודל פרימטים לא אנושי15. זה מודל הפרימטים מועסק סיבוב יחיד על האצה והאטה כדי לתפוס את הראש באמצעות 60 ° בתוך 10-20 ms. טכניקה זו היתה מסוגלת לחקות את התודעה לקויה ונזק האקאליות נרחב שדמה להשפעות של TBI חמור שנצפו במוח האנושי. עם זאת, מודלים פרימטים יקרים מאוד4,11,16. מבוסס בחלקו על הדגם הקודם, מודל חזיר של האצת סיבוב פגיעה במוח תוכנן ב 1994 (רוס ואח ') עם תוצאות דומות14.

אלה שני מודלים בעלי חיים, למרות שהם יצרו מצגות שונות של פתולוגיה טיפוסית, הוסיפו במידה רבה את המושגים של פתוגנזה DAI. סיבוב ראש מהיר מקובל בדרך כלל כשיטה הטובה ביותר לגרימת לדאי, ומכרסמים לספק מודל יקר פחות עבור לימודי סיבוב ראש מהיר11,16. כאן, אנו מאמתים מודל פשוט, מכרסם ואמין של מכרסמים של DAI הגורמת נזק לבנים נרחבים ללא שברים בגולגולת או חבורות. המודל הנוכחי יאפשר הבנה טובה יותר של הפתופסולוגיה של DAI ופיתוח של טיפולים יעילים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים נערכו בעקבות המלצות ההצהרות של הלסינקי וטוקיו ולהנחיות לשימוש בבעלי חיים ניסיוניים בקהילה האירופית. הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת בן-גוריון בנגב.

1. הכנת חולדות להליך הניסיוני

הערה: בחירת חולדות מבוגרים זכר הג-דאולי במשקל 300-350 g.

  1. קבלת אישור לביצוע ניסויים אלה מתוך ועדת הטיפול המוסדי והשימוש בבעלי חיים.
  2. לשמור חולדות בטמפרטורת החדר של 22 ± 1 ° c, עם 12 שעות אור ו 12 שעות מחזורים כהים. . לספק משקה עכברים ומים ליסיביות
  3. בצע את כל הניסויים בין 6:00 לפנות בוקר לשעה 12:00.
  4. השתמש במערכת ניהול מתמשכת. כדי לגרום להרדמה תוודא שמערכת האידוי. מלאה באיזוofלבנה
    1. לעשות את החולדות. עם 2% בלבד
    2. ודא שהעכברוש מורדם לחלוטין על-ידי התבוננות בחוסר תנועה או רפלקס פדלים בתגובה לגירויים חיצוניים.

2. אינדוקציה של פגיעה אקלית מפוזרת

הערה: המכשיר מורכב מהרכיבים הבאים: 1) גליל פלסטיק שקוף, 2) משקל ברזל (1308 g), 3) מנגנון סיבוב המורכב מצינור גלילי, שני מיסבים שעליהם מסתובבים הצירים וקיבוע ראש (לסיכות אוזניים); 4) פלטפורמה אופקית שבה הם קבועים שני מיסבים.

  1. הנח את המכשיר על שולחן מעבדה כבד ויציב.
  2. צרף את המשקל למחרוזת המוגבהת לגובה של 120 ס מ.
  3. הניחו למשקל הנופל בחופשיות לפגוע בברק והפעלת מנגנון הסיבוב. באמצעות המכשיר הסיבוב לרוחב הראש, ראשו של מכרסם מסתובב במהירות מ 0 עד 90 °.
  4. לאחר האינדוקציה של פציעה מוחית סיבי מפוזר, להעביר את החולדה לחדר התאוששות.

3. מדידת הפרמטרים של הסיבוב הקינמטיקה/ביומכנית.

  1. למדוד את הפרמטרים הרוטציה/ביומכאני להלן:
    Equation 1
    Equation 2
    Equation 3
    כאשרF- force מוחל על ראש החיה (ק ג); M – רגע של כוח; K – אנרגיה קינטית; m – מסה של המשקל נופל; g-האצת כבידה; h – גובה (cm); D – מרחק בין סיכות האוזן (cm).
    הערה: כדי לחשב את הכוח המוחל על ראשו של בעל החיים (Fo), יש לדעת את מסת המשקל היורד, את הגובה שבו המשקל יורד, ואת המרחק בין סיכות האוזן. הפרמטרים האחרים נותרים ללא שינוי.

4. הערכה של הניקוד הנוירולוגי לאחר 48 שעות

הערה: לחסרים נוירולוגים העריכו ומדורגים באמצעות תוצאת חומרה נוירולוגית, כפי שתוארה בעבר17,18,19. שינויים בתפקוד המנוע והתנהגות מוערך על ידי מערכת הנקודה כגון הציון המקסימלי של 24 מייצג תפקוד נוירולוגי חמור. ציון של 0 מציין מצב נוירולוגי ללא שינוי. פונקציות ההתנהגות הבאות מוערך.

  1. העריכו את חוסר היכולת של העכברוש לצאת ממעגל (50 ס מ בקוטר) כאשר נשאר במרכזו. בצע זאת עבור שלוש הפעלות בודדות שנמשך 30 דקות, 60 דקות, ויותר מ 60 דקות.
  2. מבחן עכברוש לאובדן רפלקס הצתה בשלוש הפעלות לאורך 20 דקות, 40 דקות, ומעל 60 דקות.
  3. לבצע את הבדיקה עבור המיפלגיה, חוסר היכולת של החולדה להתנגד שינויים כפויה בעמדה.
  4. הרימו את העכברוש בזנבו כדי לבדוק את גמישות הגפיים האחורי.
  5. מניחים את העכברוש על הרצפה כדי לבדוק את יכולתו ללכת ישר.
  6. מבחן לשלוש רפלקסים נפרדים: רפלקס הפינה, רפלקס המצמוץ, ורפלקס ההבהיל.
  7. דרג את העכברוש עם כיתה קלינית מבוסס על אובדן התנהגות מחפש והפרה.
  8. מבחן רפלקסים האיבר עבור מיקום. בצע את הבדיקה על שמאל וימין, ולאחר מכן את הגפיים השמאליים והימניים.
  9. בצע בדיקה פונקציונלית באמצעות משימת איזון הקרן. קרן צריך למדוד 1.5 ס"מ רחב. הפעל את הבדיקה עבור הפעלות של 20 s, 40 s, ויותר מ 60 s.
  10. לבצע מבחן הליכה קרן על החולדה עם קורות של שלושה רוחבי שונים: 8.5 ס"מ רחב, 5 ס"מ רוחב, 2.5 ס"מ רחב.

5. המוח אוסף לבדיקה היסטולוגית לאחר 48 שעות

  1. ב 48 שעות לאחר הפגיעה, המתת החסד החולדות על ידי החלפת תערובת הגז השראה שלהם עם 20% O2/80% CO2. להבטיח כי CO2 תימסר בקצב מוגדר מראש בהתאם עם הנחיות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשתמש בהנחיות הוועדה.
    1. הקפידו על אישור מוות בהתאם להנחיות וועדות השימוש בבעלי חיים מוסדיים.
  2. מבשם החולדה עם 0.9% heparinized מלוחים בטמפרטורה 4 ° c, ואחריו 500 mL של 4% פאראפורמלדהיד ב 0.1 M פוספט מאגר מלוחים (pH 7.4).
  3. לאחר הפרזיה, בצע עריפת ראש בגיליוטינה.
  4. לבצע איסוף המוח על ידי הסרת calvarias עם מלקחיים חיתוך עצם כדי למנוע פגיעה ברקמות המוח.
  5. הסר את המוח מיד ולתקן 4% הפתרון פורמלדהיד באגירה עבור 48 h ב 4 ° c.
  6. לחסום את המוח לתוך 5 מילימטר סעיפים מתוך הנורה הריח הפנים לקליפת הראייה ואת המוח ביסעי ומוחי נובעת.
  7. בעקבות הטבעה של פרפין, חותכים סעיפים ילתית ו משונן (5 μm) הרחק מתלמוס על ידי שיבוץ מיקרוטומה.

6. מכתים ובדיקה אימונוכימיקלים

  1. מקם בעדינות את הפרוסות על שקופיות זכוכית עם מברשת רכה, פרוסה אחת לכל שקופית.
  2. הפקת כתמים אימונוכימיקלים של βAPP.
    1. לחלק פרוסות עם קסילן (3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד) ו מחדש עם ריכוזי בהדרגה הופחת של אתנול בטמפרטורת החדר: 3 דקות ב 100% אתנול פעמיים, 3 דקות ב 95% אתנול פעמיים, 3 דקות ב 90% אתנול, 3 דקות ב 70% אתנול, ו 3 דקות ב DDW.
    2. התייחס לחלקים ולפרקים המוח מחדש עם 3% H2O2 עבור 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחסום פעילות אנדודוגני peroxidase.
    3. מקטעי דגירה עם 0.01 M נתרן ציטראט (pH 6.0) ב 98 ° צ' עבור 5 דקות עבור אחזור אנטיגן.
    4. שמור את השקופיות במאגר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי להתקרר.
    5. שטוף מקטעים בתמיסה מלוחים באגירה מפוספז (PBS) פעמיים עבור 5 דקות.
    6. לחסום את הסעיפים עם 2.5% סרום רגיל לסוסים עבור 1 h בטמפרטורת החדר ו-דגירה לילה ב 4 ° צ' הארנב הראשי anti-APP (1:4000) מדולל בסרום חוסם.
    7. לאחר הדגירה של הנוגדן הראשוני, לשטוף קטעים ב-PBS בטמפרטורת החדר.
    8. מקטעי דגירה של נוגדן משני מדולל biotinylated עבור 15 דקות ולשטוף עם PBS עבור 3 דקות פעמיים בטמפרטורת החדר.
    9. דגירה ב-streptavidin – peroxidase עבור 15 דקות ולשטוף שוב ב-PBS עבור 3 דקות פעמיים בטמפרטורת החדר.
    10. מקטעים דגירה עם פתרון המצע באגירה (pH 7.5) המכיל חמצן מימן ו 3, 3-diaminobenzidine פתרון כרומוgen ולהגן מפני אור עד הצבע מפותח.
    11. דגירה את השקופיות עם DDW בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות כדי לעצור את התגובה.
    12. מחלקים כנגד המטאוקסילין למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר ולשטוף 5 דקות עם מי ברז זורמים.
    13. מייבשים את השקופיות עם ריכוזים הגוברת בהדרגה של אתנול בטמפרטורת החדר: 2 דקות ב ddw, 2 דקות ב 70% אתנול, 2 דקות ב 90% אתנול, 2 דקות באתנול 95%, 2 דקות ב 100% אתנול, ו 3 דקות ב קסילן שלוש פעמים.
    14. יבש והר עם הרכבה בינונית.
  3. בדוק את הפרוסות תחת הגדלת המיקרוסקופ של 200x עם עדשת המטרה 20 מ מ באמצעות מיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טבלה 1 ממחישה את ציר הזמן של הפרוטוקול. שיעור התמותה במודל זה של דאי היה 0%. מבחן מאן-ויטני הראו כי הגרעון הנוירולוגי היה גדול באופן משמעותי עבור 15 חולדות DAI לעומת 15 חולדות מזויף ב 48 שעות לאחר ההתערבות (Mdn = 1 לעומת 0), U = 22.5, p < 0.001, r = 0.78 (ראה טבלה 2). הנתונים נמדדים בספירות והם מוצגים כחציון וטווח של 25-75 אחוזון.

באיור 1מוצגים המוצגים הפוציגרפים של מקטעי רקמות המוח התלמי. פוטוקטוגרפים חשפה סיבי ונוירוונאליות βAPP בעקבות מבודדים DAI ב חולדות 48 שעות לאחר פגיעה לעומת קבוצת הביקורת (67.46 ± 30 vs. 0 ± 0), U = 0, p < 1.1 e-06, r = 0.92. הנתונים נמדדים כספירות ומוצגים כממוצע ± SD.

קבוצות זמן נהלים
דאי (15 חולדות) 0 שעות השראה מנטרל פציעה Axonal
בעלי (15 עכברושים) 48 h הערכה לציון חומרת הסיכון,
דאי (15 חולדות) כתמים אימונוכימיקלים של בפספ.

טבלה 1: הדגמה של ציר הזמן של הפרוטוקול. קבוצות שונות של חולדות בזמנים שונים מוצגים: DAI = פגיעה במוח האקאליות בתחילת הניסוי; ב 48 שעות, הציון החומרת הנוירולוגית נקבע וכתמים חיסוני של βAPP בוצעה בשתי הקבוצות.

ערכי NSS של הקבוצות השונות ב 48 שעות
קבוצת בעלי חיים N NSS 48 שעות לאחר DAI
שאם 15 0 (0-0)
דאי 15 1 (1-1) *

טבלה 2: תוצאת הסיכון הנוירולוגי. הגירעון הנוירולוגי 48 שעות בעקבות DAI עבור 2 קבוצות לימוד. מבחן מאן-ויטני הראו כי הגרעון הנוירולוגי היה גדול באופן משמעותי עבור 15 חולדות DAI לעומת 15 חולדות מזויף ב 48 שעות לאחר ההתערבות (Mdn = 1 לעומת 0), U = 22.5, p < 0.001, r = 0.78. הנתונים נמדדים בספירות והם מוצגים כחציון וטווח של 25-75 אחוזון.

Figure 1
איור 1: בדיקה חיסונית כימית. הנציג הייצוגי של מקטעים הפתליים של רקמת המוח חשף את הפעילויות החיסונאליות והנוירואליות בעקבות מבודדים בחולדות (ב) 48 שעות לאחר פגיעה בהשוואה לקבוצת הביקורת (א). βAPP immunoreactivity תגלתה באזור העניין של כל 15 חולדות DAI, ולא בכלל באף אחד החולדות המופעלות המזויף. מבחן מאן-ויטני הראה כי מספר אקסונים βAPP-חיוביים היה גדול באופן משמעותי עבור 15 חולדות דאי מאשר בעלי חיים הפגועים ב 48h בעקבות DAI (67.46 ± 30 vs. 0 ± 0), U = 0, p < 1.1 e-06, r = 0.92. התמונות נמצאות בהגדלה המקורית * 200. הנתונים נמדדים כספירות ומוצגים כממוצע ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר מודל מכרסם של DAI. ב-DAI, האצת סיבוב על המוח גורמת אפקט הטיה המפעיל שינויים סיבי וביוכימיים המובילים לאובדן של תפקוד סיבי בתהליך פרוגרסיבי. שינויי סיבי משניים מיוצרים על ידי פציעה מתיחה מהירה סיבי והם משתנים במידה שלהם ואת חומרת4,5,10. בתוך שעות לימים לאחר הפגיעה העיקרית, השינויים הביוכימיים יובילו לאובדן הפונקציה סיבי4,5,10. בעקבות הפציעה, החדירות של הממברנה האקסון משתנה, ומאפשר הזרמת סידן מסיבית. צריכת הסידן גורמת המיטוגרם להתנפח ולשבור, שחרור caspases ומפעילה caspases מתווך המוות תאים מתקדמים4,5,10,11,20. פציעה סיבי משנית יכול להציג בצורה של נורות סיבי בסוף הקרע או בצורה של האריזים לאורך אורך האקסון4,21,22. הפסד של מעבר דחף עצבי מתבטא על ידי צבירה של חלבון β-עמילואיד קודמן (βAPP), חלבון transרפידת בודד נוכח ברוב התאים ורקמות4,23,24,25,26. אימונוהיסטוככימיים ניתוח של הצטברות βAPP היא כיום הטכניקה זהב תקן קליני וניסיוני להערכת של דאי4,9,10,20,27. מחקרים דיווחו βAPP immunoreactivity החל כ 2 שעות לאחר הפציעה, אבל יש ראיות כי שינויים מתמשך להמשיך למשך אחת או יותר שנים לאחר פציעה23,28,29. האזורים הפגיעים ביותר הם גזע המוח, הדבר הלבן הפארא של קליפת המוח, וקורפוס callosum11.

נפוץ בדגמי vivo בעלי חיים של דאי הם מודל הקשה נוזל לרוחב30,31, האצת ההשפעה פציעה32,33 ואת מודל ההשפעה בקליפת הגוף מבוקרת34,35,36. מודלים אלה מספקים כמה תוצאות שימושיות אך עם מגבלות משמעותיות.

מודלים של כלי הקשה לנוזלים במודלים לבעלי חיים לגרום לפגיעה במוח על ידי הזרקת כמויות מגוונות של תמיסת מלח לתוך חלל הגולגולת הסגור ב-midline, במיוחד במודלים של חתול וארנבת, או במודלים מכרסמים30,31. חומרת הפציעה יכולה להיות מגוונת מתון עד חמור על ידי התאמת לחץ נוזלי. למרות שמודל זה אמין ומובחנות, הוא אינו מודל אידיאלי של האדם דאי, כי פגיעה בכלי ההקשה מייצרת חבלה ו/או דימום תת-ממדי וסוג ההשפעה העיקרית נבדל מפציעות החיים האמיתיים37,38. יתרה מזאת, ההשפעות של גאומטריה מוחית ומבנה תוך-גולגולתי על כיוון, הזחה ומהירות מקשים מאוד על ביצוע ניתוח ביומכאני מדויק של הפציעה39.

פגיעה בהאצת ההשפעה דגם32,33 משתמשת במשקולות פליז מקוטע ללא תשלום מגובה שצוין באמצעות צינור מדריך פרספקס על קסדה מתכתי תוקן על ידי אקריליק שיניים לקודקוד הגולגולת של החולדה. מודל זה הוא זול, קל לביצוע, והוא יכול לייצר מדורגים, אבל יש גם אפשרות של חבורות ושברים בגולגולת, להתפשר על השגות של המודל. בנוסף, הפגיעה הנגרמת כרוכה בנפח קטן יותר של המוח מאשר בבני אדם39.

המודל של השפעה מבוקרת בקליפת המוח מעסיקה מכשיר השפעה פניאומטית או אלקטרומגנטית כדי לכונן impactor חקן נוקשה על החשוף, שלמה של הגולגולת דרך הפיום הצדדית, אשר מוביל לעיוות של קליפת המוח הבסיסית16,17. לחץ אוויר אחראי על מהירות ההשפעה, והעומק של דפורמציה קורטיקלית מוסדר על ידי התאמה אנכית של המוט שבו הגליל מחובר. כמו מודל התיפוף הנוזלי, הוא גורם בעיקר לפציעה ממוקד.

לגבי החסרונות האלה, מודל מכרסם חדש שונה פותחה עם פתיחת מאטר דורא על האונה החצי הצלעות כדי לייצר פציעה בלתי נפוצה יותר40. עם זאת, רוב הדגמים הקודמים דורשים פתיחת גולגולת, ואת התוצאות של פתוגנזה הפתולוגית עשוי להיות מושפע החבלה דימום שבדרך כלל מופיעים במודלים הקודמים. יתר על כן, מנגנון הפציעה במודלים אלה שונה מ-DAI האנושית הנגרמת על ידי ההאצה-האטה של תנועות המוח.

קיימים מספר שלבים בפרוטוקול הקריטיים והראויים לשיקול דעת. יש לשקול כי ראשו של החולדה צריך להיות קבוע בחוזקה לסיכות האוזן, או שהעכברוש עלול ליפול מהמכשיר. כאשר הם נופלים, כוחות אחרים עשויים לשחק תפקיד שישפיע על הדיוק של כל החישובים. כמו כן, משקל הברזל חייב להיות המשקל הסגולי וירד בגובה הספציפי שצוין בפרוטוקול זה. מדידות אלה נקבעו במידה מדעית ותנאים הכרחיים לרבייה של המודל. ההתקנה של צילינדר פלסטיק צריך להיות בזווית של 90 ° ביחס למנגנון הסיבוב, כלומר הבריח. זה בגלל שהוא הלהיט של הבורג שמניע את מנגנון הסיבוב. אחרת, החיכוך של משקל ברזל ביחס גליל פלסטיק הוא הציג, אשר יוביל לירידה בכוח להחיל על ראשו של העכברוש.

. יש מספר מגבלות לדגם הזה התפתחות של דאי בבני אדם היא משנית בעיקר להשפעה מאובייקט אחר. במקרה זה, או שהאדם נע לעבר האובייקט, האובייקט נע לעבר האדם, או ששניהם נעים זה לכיוון זה. בהתנגשות כזו, חולה מפתחת פגיעת ראש משולבת, שם לפזר נזק סיבי הוא רק חלק tbi. כאן, האצת הסיבוב המוחלת היא המנגנון העיקרי המוביל לפיתוח של DAI ללא אלמנטים אחרים של פגיעת ראש.

המודל המוצע כאן נראה כדי להקל על הסיבוכים של שברים בגולגולת וחבורות שגרמו נזק לחומר הלבן מבלי פציעה נוספת מוגבלת. בדומה מודלים אחרים מכרסם האחרונות, מודל זה הוא יעיל מספק נמוך (0%) שיעור התמותה. זוהי טכניקה הניתן לפיתוח ובמחיר נוח שיכול לשמש כמשאב יקר להבנת טוב יותר את הפתופסולוגיה של DAI כדי לפתח טיפולים יעילים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים מכירים בהכרת ד ר נתן קלייורין (המחלקה להנדסה מכנית, אוניברסיטת בן-גוריון) על עזרתו במידות ביו-מכניות. כמו כן, אנו מודים לפרופ ' אולינה סוינינסקה, מריאן קונשאבה, מח קריונוסוב, דארנה יאקומנקו ואבגניה גונצ'יק מהמחלקה לפיזיולוגיה, הפקולטה לביולוגיה, אקולוגיה ורפואה, יולס הונchar דניפרו, דניפרו, אוקראינה לתמיכה ותרומות מועילות לדיונים שלנו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M sodium citrate SIGMA - ALDRICH
2.5% normal horse serum SIGMA - ALDRICH H0146 Liquid
4 % buffered formaldehyde solution
Anti-Amyloid Precursor Protein, C - terminal antibodyproduced in rabbit SIGMA - ALDRICH Lot 056M4867V
biotinylated secondary antibody Vector BA-1000-1.5 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin
bone-cutting forceps
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine vector laboratory
embedding cassettes
ethanol 99.9 % ROMICAL Flammable Liquid
guillotine
Hematoxylin SIGMA - ALDRICH H3136-25G
Hydrogen peroxide solution Millipore 88597-100ML-F
Isofluran, USP 100% Piramamal Critical Care, Inc
Olympus BX 40 microscope Olympus
paraffine paraplast plus leica biosystem Tissue embedding medium
phosphate-buffered saline (PBS) SIGMA - ALDRICH P5368-10PAK Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl - 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C.
Streptavidin HRP ABCAM ab64269 Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry.
xylene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Faul, M., Wald, M. M., Xu, L., Coronado, V. G. Traumatic brain injury in the United States; emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. US Government. , (2010).
  2. Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths - United States, 2007 and 2013. MMWR Surveillance Summaries. 66, 1-16 (2017).
  3. Peterson, A. B., Xu, L., Daugherty, J., Breiding, M. J. Surveillance report of traumatic brain injury-related emergency department visits, hospitalizations, and deaths, United States, 2014. US Government. , (2014).
  4. Su, E., Bell, M. Diffuse axonal injury. Translational Research in Traumatic Brain Injury. 57, 41 (2016).
  5. Hammoud, D. A., Wasserman, B. A. Diffuse axonal injuries: pathophysiology and imaging. Neuroimaging Clinics. 12, 205-216 (2002).
  6. Adams, J. H., Graham, D. I., Gennarelli, T. A., Maxwell, W. L. Diffuse axonal injury in non-missile head injury. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 54, 481-483 (1991).
  7. Slazinski, T., Johnson, M. C. Severe diffuse axonal injury in adults and children. Journal of Neuroscience Nursing. 26, 151-154 (1994).
  8. Gentleman, S. M., et al. Axonal injury: a universal consequence of fatal closed head injury. Acta Neuropathologica. 89, 537-543 (1995).
  9. Marehbian, J., Muehlschlegel, S., Edlow, B. L., Hinson, H. E., Hwang, D. Y. Medical Management of the Severe Traumatic Brain Injury Patient. Neurocritical Care. 27, 430-446 (2017).
  10. Adams, J. H., et al. Diffuse axonal injury in head injury: definition, diagnosis and grading. Histopathology. 15, 49-59 (1989).
  11. Xiao-Sheng, H., Sheng-Yu, Y., Xiang, Z., Zhou, F., Jian-ning, Z. Diffuse axonal injury due to lateral head rotation in a rat model. Journal of Neurosurgery. 93, 626-633 (2000).
  12. Ross, D. T., Meaney, D. F., Sabol, M. K., Smith, D. H., Gennarelli, T. A. Distribution of forebrain diffuse axonal injury following inertial closed head injury in miniature swine. Experimental Neurology. 126, 291-299 (1994).
  13. Bullock, R. Opportunities for neuroprotective drugs in clinical management of head injury. Journal of Emergency Medicine. 11, Suppl 1 23-30 (1993).
  14. Gennarelli, T. A. Mechanisms of brain injury. Journal of Emergency Medicine. 11, Suppl 1 5-11 (1993).
  15. Gennarelli, T. A., et al. Diffuse axonal injury and traumatic coma in the primate. Annals of Neurology. 12, 564-574 (1982).
  16. Xiaoshengi, H., Guitao, Y., Xiang, Z., Zhou, F. A morphological study of diffuse axonal injury in a rat model by lateral head rotation trauma. Acta Neurologica Belgica. 110, 49-56 (2010).
  17. Zlotnik, A., et al. beta2 adrenergic-mediated reduction of blood glutamate levels and improved neurological outcome after traumatic brain injury in rats. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 24, 30-38 (2012).
  18. Boyko, M., et al. An Alternative Model of Laser-Induced Stroke in the Motor Cortex of Rats. Biological Procedures Online. 21, 9 (2019).
  19. Boyko, M., et al. The neuro-behavioral profile in rats after subarachnoid hemorrhage. Brain Research. 1491, 109-116 (2013).
  20. Ma, J., Zhang, K., Wang, Z., Chen, G. Progress of Research on Diffuse Axonal Injury after Traumatic Brain Injury. Neural Plasticity. 2016, 9746313 (2016).
  21. Medana, I. M., Esiri, M. M. Axonal damage: a key predictor of outcome in human CNS diseases. Brain. 126, 515-530 (2003).
  22. Tang-Schomer, M. D., Johnson, V. E., Baas, P. W., Stewart, W., Smith, D. H. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury. Experimental Neurology. 233, 364-372 (2012).
  23. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Traumatic brain injury and amyloid-beta pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neuroscience. 11, 361-370 (2010).
  24. Sherriff, F. E., Bridges, L. R., Sivaloganathan, S. Early detection of axonal injury after human head trauma using immunocytochemistry for beta-amyloid precursor protein. Acta Neuropathologica. 87, 55-62 (1994).
  25. Reichard, R. R., White, C. L., Hladik, C. L., Dolinak, D. Beta-amyloid precursor protein staining of nonaccidental central nervous system injury in pediatric autopsies. Journal of Neurotrauma. 20, 347-355 (2003).
  26. Gentleman, S. M., Nash, M. J., Sweeting, C. J., Graham, D. I., Roberts, G. W. Beta-amyloid precursor protein (beta APP) as a marker for axonal injury after head injury. Neuroscience Letters. 160, 139-144 (1993).
  27. Smith, D. H., Hicks, R., Povlishock, J. T. Therapy development for diffuse axonal injury. Journal of Neurotrauma. 30, 307-323 (2013).
  28. McKenzie, K. J., et al. Is beta-APP a marker of axonal damage in short-surviving head injury. Acta Neuropathologica. 92, 608-613 (1996).
  29. Wilkinson, A., Bridges, L., Sivaloganathan, S. Correlation of survival time with size of axonal swellings in diffuse axonal injury. Acta Neuropathologicaogica. 98, 197-202 (1999).
  30. Thompson, H. J., et al. Lateral fluid percussion brain injury: a 15-year review and evaluation. Journal of Neurotrauma. 22, 42-75 (2005).
  31. Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice. Journal of Visualized Experiments. , e3063 (2011).
  32. Povlishock, J., Marmarou, A., McIntosh, T., Trojanowski, J., Moroi, J. Impact acceleration injury in the rat: evidence for focal axolemmal change and related neurofilament sidearm alteration. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56, 347-359 (1997).
  33. Heath, D. L., Vink, R. Impact acceleration-induced severe diffuse axonal injury in rats: characterization of phosphate metabolism and neurologic outcome. Journal of Neurotrauma. 12, 1027-1034 (1995).
  34. Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. Journal of Neurotrauma. 5, 1-15 (1988).
  35. Palmer, A. M., et al. Traumatic brain injury-induced excitotoxicity assessed in a controlled cortical impact model. Journal of Neurochemistry. 61, 2015-2024 (1993).
  36. Hamm, R. J., et al. Cognitive deficits following traumatic brain injury produced by controlled cortical impact. Journal of Neurotrauma. 9, 11-20 (1992).
  37. Nyanzu, M., et al. Improving on Laboratory Traumatic Brain Injury Models to Achieve Better Results. International Journal of Medical Sciences. 14, 494-505 (2017).
  38. Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14, 128-142 (2013).
  39. Lighthall, J. W., Dixon, C. E., Anderson, T. E. Experimental models of brain injury. Journal of Neurotrauma. 6, 83-97 (1989).
  40. Meaney, D. F., et al. Modification of the cortical impact model to produce axonal injury in the rat cerebral cortex. Journal of Neurotrauma. 11, 599-612 (1994).

Tags

מדעי המוח סוגיה 159 מנטרל פציעה סיבי (DAI) פגיעה מוחית טראומטית (tbi) האצת הסיבוב מודל חולדה חומר לבן פגיעה מתיחה
אינדוקציה של פגיעה מוחית Axonal בחולדות מבוסס על האצת הסיבוב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frank, D., Melamed, I., Gruenbaum,… More

Frank, D., Melamed, I., Gruenbaum, B. F., Grinshpun, J., Kuts, R., Shvartsur, R., Azab, A. N., Assadi, M. H., Vinokur, M., Boyko, M. Induction of Diffuse Axonal Brain Injury in Rats Based on Rotational Acceleration. J. Vis. Exp. (159), e61198, doi:10.3791/61198 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter