Summary
Este protocolo valida um modelo de roedor confiável, fácil de executar e reprodutível da lesão axonal difusa cerebral (DAI) que induz danos generalizados de matéria branca sem fraturas no crânio ou contusões.
Abstract
Lesão cerebral traumática (TCE) é uma das principais causas de morte e incapacidade. A lesão axonal difusa (DAI) é o mecanismo predominante de lesão em uma grande porcentagem de pacientes com TCE que necessitam de internação. Dai envolve danos axonais generalizados por tremor, rotação ou lesão de explosão, levando a lesões rápidas de estiramento axonal e alterações axonais secundárias que estão associadas a um impacto duradouro na recuperação funcional. Historicamente, modelos experimentais de DAI sem lesão focal têm sido difíceis de projetar. Aqui validamos um modelo de roedor simples, reprodutível e confiável do DAI que causa danos generalizados de matéria branca sem fraturas no crânio ou contusões.
Introduction
A lesão cerebral traumática (TCE) é uma das principais causas de morte e incapacidade nos Estados Unidos. Os TBIs contribuem para cerca de 30% de todas as mortes relacionadas a lesões1,2. As principais causas de TCE diferem entre as faixas etárias e incluem quedas, colisões em alta velocidade durante esportes, automutilação intencional, acidentes de veículos automotores e assaltos1,2,3.
A lesão axonal difusa cerebral (DAI) é um tipo específico de TCE induzido pela aceleração rotacional, tremor ou lesão de explosão do cérebro resultante do movimento irrestrito da cabeça no instante após a lesão4,5,6,7,8. O DAI envolve danos axonais generalizados que levam a um comprometimento neurológico de longa duração que está associado a um desfecho ruim, custos de saúde pesados e uma taxa de mortalidadede33-64% 1,2,4,5,9,10,11. Apesar de pesquisas recentes significativas sobre a patogênese do DAI, não houve consenso sobre as melhores opções de tratamento11,12,13,14.
Ao longo das últimas décadas, inúmeros modelos experimentais tentaram replicar com precisão diferentes aspectos do DAI11,,12,,15,,16. No entanto, esses modelos têm limitações dada a apresentação única do DAI em comparação com outras lesões focais. Esses modelos anteriores não só causam lesões axonais em regiões de matéria branca, mas também resultam em lesões cerebrais focais. Clinicamente, o DAI é acompanhado por micro hemorragias, que podem constituir uma grande causa de danos à matéria branca.
Apenas dois modelos animais foram mostrados para replicar as principais características clínicas do DAI. Gennarelli e colegas produziram o primeiro dispositivo de rotação de cabeça lateral em 1982, usando aceleração rotacional de cabeça sem impacto para induzir o coma com dai em um primata não humano modelo15. Este modelo primata utilizou rotação única controlada para aceleração e desaceleração para deslocar a cabeça através de 60° dentro de 10-20 ms. Esta técnica foi capaz de emular consciência prejudicada e dano axonal generalizado que se assemelhava aos efeitos do Tce grave observado em cérebros humanos. No entanto, os4modelos primatas são muito caros4,11,,16. Baseado em parte no modelo anterior, um modelo suíno de lesão cerebral de aceleração rotacional foi projetado em 1994 (Ross et al.) com resultados semelhantes14.
Esses dois modelos animais, embora tenham produzido diferentes apresentações de patologia típica, têm adicionado muito aos conceitos de patogênese da DAI. A rotação rápida da cabeça é geralmente aceita como o melhor método para induzir o DAI, e os roedores fornecem um modelo mais barato para os estudos rápidos de rotação da cabeça11,16. Aqui, validamos um modelo de roedor simples, reprodutível e confiável do DAI que causa danos generalizados de matéria branca sem fraturas no crânio ou contusões. Este modelo atual permitirá uma melhor compreensão da fisiopatologia do DAI e desenvolvimento de tratamentos mais eficazes.
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Protocol
Os experimentos foram realizados seguindo as recomendações das Declarações de Helsinque e Tóquio e das Diretrizes para o Uso de Animais Experimentais da Comunidade Europeia. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade Ben-Gurion do Negev.
1. Preparar ratos para o procedimento experimental
NOTA: Selecione ratos machos adultos sprague-dawley pesando 300-350 g.
- Obter aprovação para a realização desses experimentos no Comitê de Cuidado e Uso institucional de Animais.
- Mantenha os ratos a uma temperatura ambiente de 22 ± 1 °C, com ciclos de luz de 12 horas e 12 horas de escuridão. Forneça comida de rato e água ad libitum.
- Realize todos os experimentos entre 6:00 e 12:00.
- Use um sistema de administração isoflurano contínuo para induzir anestesia. Certifique-se de que o sistema de vaporizador está cheio de isoflurano.
- Anestesiar os ratos com 2% de isoflurano.
- Confirme que o rato está totalmente anestesiado observando a falta de movimento ou reflexo do pedal em resposta a um estímulo externo.
2. Indução de lesão axonal difusa
NOTA: O dispositivo é constituído pelos seguintes componentes: 1) cilindro plástico transparente, 2) peso de ferro (1308 g), 3) mecanismo de rotação composto por um tubo cilíndrico, dois rolamentos sobre os quais o eixo gira e uma fixação da cabeça (para pinos de ouvido); 4) plataforma horizontal na qual são fixados dois rolamentos.
- Coloque o dispositivo em uma mesa de laboratório pesada e estável.
- Fixar o peso a uma corda que é elevada a uma altura de 120 cm.
- Deixe o peso em queda livre para acertar o parafuso, ativando o mecanismo de rotação. Usando o dispositivo de rotação lateral da cabeça, a cabeça do roedor é virada rapidamente de 0 a 90°.
- Após a indução de lesão cerebral axonal difusa, transfira o rato para uma sala de recuperação.
3. Medição de parâmetros de Cinemática rotacional/Biomecânica.
- Medir os parâmetros cinéticos/biomecânicos de medida da seguinte forma:
onde Fo - força aplicada à cabeça animal (kg); M – momento de força; K – energia cinética; m – massa do peso em queda; g - aceleração gravitacional; h – altura (cm); D – distância entre os pinos auricados (cm).
NOTA: Para calcular a força aplicada na cabeça do animal (Fo), é necessário conhecer a massa do peso em queda, a altura em que o peso cai e a distância entre os pinos de ouvido. Os outros parâmetros permanecem inalterados.
4. Avaliação do Escore de Gravidade Neurológica após 48 horas
NOTA: Os déficits neurológicos foram avaliados e classificados por meio de um Escore de Gravidade Neurológica, conforme descrito anteriormente17,18,19. Alterações na função motora e comportamento são avaliadas por um sistema de pontos de tal forma que uma pontuação máxima de 24 representa disfunção neurológica grave. Uma pontuação de 0 indica estado neurológico intacto. As seguintes funções comportamentais são avaliadas.
- Avalie a incapacidade do rato de sair de um círculo (50 cm de diâmetro) quando deixado no centro. Realize isso para três sessões individuais com duração de 30 min, 60 min e mais de 60 min.
- Teste o rato para uma perda de reflexo de redireitaem em três sessões com duração de 20 min, 40 min e mais de 60 min.
- Realizar o teste para hemiplegia, a incapacidade do rato de resistir a mudanças forçadas de posição.
- Levante o rato pela cauda para testar a flexão do membro traseiro.
- Coloque o rato no chão para testar sua habilidade de andar em linha reta.
- Teste para três reflexos separados: o reflexo da pinna, o reflexo da córnea e o reflexo de assusto.
- Avalie o rato com grau clínico baseado na perda de comportamento de busca e prostração.
- Teste os reflexos dos membros para colocação. Realize o teste nos membros dianteiros esquerdo e direito, e depois nos membros traseiros esquerdo e direito.
- Realize um teste funcional através da tarefa de balanceamento de feixes. O feixe deve medir 1,5 cm de largura. Execute o teste para sessões de 20, 40 s e mais de 60 s.
- Realizar teste de caminhada de feixe no rato com vigas de três larguras diferentes: 8,5 cm de largura, 5 cm de largura e 2,5 cm de largura.
5. Coleta cerebral para exame histológico após 48 horas
- Às 48 horas após a lesão, eutanize os ratos substituindo sua mistura de gás inspirada por 20% O2/80% CO2. Certifique-se de que o CO2 seja entregue a uma taxa pré-determinada de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais.
- Garantir a confirmação de óbito de acordo com as diretrizes do Comitê de Cuidados e Uso de Animais Institucionais.
- Transcardiacally perfundir o rato com 0,9% de soro salino heparinizado a temperatura de 4 °C, seguido por 500 mL de 4% de paraformaldeído em 0,1 M salino tampão fosfato (pH 7.4).
- Após a perfusão, realize a decapitação com uma guilhotina.
- Realize a coleta cerebral removendo as calvarias com fórceps de corte ósseo para evitar danos ao tecido cerebral.
- Remova o cérebro imediatamente e fixe em uma solução de formaldeído tampão de 4% para 48 h a 4 °C.
- Bloqueie cérebros em seções coronais de 5 mm da face da lâmpada olfativa para o córtex visual e cerebelo bissecto e hastes cerebrais.
- Após a incorporação da parafina, corte as seções coronal e sagital (5 μm) de distância do tálamo por secção de microtome.
6. Coloração e exame imunoquímicos
- Coloque delicadamente as fatias em lâminas de vidro com um pincel macio, 1 fatia por slide.
- Produzir coloração imunoquímica de βAPP.
- Deparafinar fatias com xileno (3 vezes para 5 min cada) e reidratar com concentrações gradualmente reduzidas de etanol à temperatura ambiente: 3 min em 100% etanol duas vezes, 3 min em 95% etanol duas vezes, 3 min em 90% de etanol, 3 min em 70% de etanol e 3 min em DDW.
- Tratar seções cerebrais deparafinadas e rehidratadas com 3% H2O2 por 15 min à temperatura ambiente para bloquear a atividade endógena da peroxidase.
- Incubar seções com citrato de sódio de 0,01 M (pH 6.0) a 98 °C por 5 min para recuperação de antígenos.
- Mantenha os slides no tampão por 20 min em temperatura ambiente para esfriar.
- Lave as seções com solução de solução salina tamponada com fosfato (PBS) duas vezes por 5 min.
- Bloqueie as seções com soro de cavalo normal de 2,5% para 1 h à temperatura ambiente e incuba durante a noite a 4 °C no anti-APP do coelho primário (1:4000) diluído no soro de bloqueio.
- Após a incubação em anticorpo primário, lave seções em PBS à temperatura ambiente.
- Incubar seções em anticorpo secundário biotinylado devidamente diluído por 15 min e lavar com PBS por 3 min duas vezes à temperatura ambiente.
- Incubar em streptavidin-peroxidase por 15 min e lavar novamente em PBS por 3 min duas vezes em temperatura ambiente.
- Incubar seções com solução de substrato tampão (pH 7.5) contendo peróxido de hidrogênio e solução cromogeno de 3,3 diaminobenzidinae e proteger da luz até que a cor seja desenvolvida.
- Incubar os slides com DDW em temperatura ambiente por 5 min, a fim de parar a reação.
- Seções de contra-coloração com Hematoxilina por 3 min em temperatura ambiente e lave por 5 min com água da torneira fluindo.
- Desidratar os slides com concentrações gradualmente crescentes de etanol à temperatura ambiente: 2 min em DDW, 2 min em 70% de etanol, 2 min em 90% de etanol, 2 min de etanol 95%, 2 min em 100% de etanol e 3 min em xileno três vezes.
- Seque e monte com meio de montagem.
- Examine as fatias sob a ampliação do microscópio de 200x com uma lente objetiva de 20 mm usando um microscópio.
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Representative Results
A Tabela 1 ilustra a linha do tempo do protocolo. A taxa de mortalidade nesse modelo de DAI foi de 0%. Um teste de Mann-Whitney indicou que o déficit neurológico foi significativamente maior para os 15 ratos DAI em comparação com os 15 ratos falsos em 48 horas após a intervenção (Mdn = 1 vs. 0), U = 22,5, p < 0,001, r = 0,78 (ver Tabela 2). Os dados são medidos em contagem e são apresentados como intervalo mediano e de 25 a 75 percentis.
Fotomicrografos representativos de seções talâmicas do tecido cerebral são mostrados na Figura 1. Os fotomicrogramas revelaram imunoreatividades βAPP axonais e neuronais após dai isolado em ratos 48 horas após a lesão em comparação com o grupo controle (67,46 ± 30 vs. 0 ± 0), U = 0, p < 1.1E-06, r = 0,92. Os dados são medidos como contagem e apresentados como média ± DP.
| Grupos | Tempo | Procedimentos |
| DAI (15 ratos) | 0 h | Lesão Axonal Difusa por indução |
| Sham (15 ratos) | 48 h | Avaliação do escore de gravidade neurológica, |
| DAI (15 ratos) | Coloração imunoquímica de BAPP. |
Tabela 1: Demonstração do cronograma do protocolo. Os vários grupos de ratos em diferentes momentos são mostrados: DAI = Lesão cerebral axonal difusa no início do experimento; Às 48 horas, foi determinado um Escore de Gravidade Neurológica e a coloração imunoquímica de βAPP foi realizada em ambos os grupos.
| Valores de NSS dos vários grupos em 48 horas | ||
| Grupo Animal | N | NSS 48 horas após dai |
| Farsa | 15 | 0 (0-0) |
| Dai | 15 | 1 (1-1)* |
Tabela 2: Pontuação de gravidade neurológica. Déficit neurológico 48 horas após o DAI para 2 grupos de estudo. Um teste de Mann-Whitney indicou que o déficit neurológico foi significativamente maior para os 15 ratos DAI em comparação com os 15 ratos falsos em 48 horas após a intervenção (Mdn = 1 vs. 0), U = 22,5, p < 0,001, r = 0,78. Os dados são medidos em contagem e são apresentados como intervalo mediano e de 25 a 75 percentis.
Figura 1: Exame imunoquímico. Fotomicrografias representativas de seções talâmicas do tecido cerebral revelaram imunoreatividades axonais e neuronais após dai isolado em ratos (B) 48 horas após a lesão em comparação com o grupo controle (A). ΒAPP imunoreatividade foi detectada na região de interesse em todos os 15 ratos DAI, e não em nenhum dos ratos falsos operados. O teste de Mann-Whitney indicou que o número de axônios βAPP -positivos foi significativamente maior para 15 ratos DAI do que para animais com lesãs em 48h após dai (67,46 ± 30 vs. 0 ± 0), U = 0, p < 1.1E-06, r = 0,92. As imagens estão na ampliação original * 200. Os dados são medidos como contagem e apresentados como média ± SD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo descreve um modelo de roedor da DAI. No DAI, a aceleração rotacional no cérebro causa um efeito de cisalhamento que desencadeia alterações axonais e bioquímicas que levam à perda da função axonal em um processo progressivo. As alterações axonais secundárias são produzidas por uma lesão de estiramento axonal rápida e são variáveis em sua extensão e gravidade4,5,10. Dentro de horas a dias após a lesão primária, alterações bioquímicas levarão à perda da função axonal4,5,10. Após a lesão, a permeabilidade da membrana de axôno muda, permitindo um influxo maciço de cálcio. A ingestão de cálcio faz com que as mitocôndrias inchem e se rompam, liberando caspases e desencadeando a morte celular progressiva mediada pela caspase4,5,10,11,20. A lesão axonal secundária pode apresentar-se na forma das lâmpadas axonais na extremidade rompida ou na forma de varizes ao longo do comprimento do axôono4,21,22. A perda da transição do impulso nervoso é expressa pela agregação da proteína precursora β-amilóide (βAPP), uma única proteína transmembrana presente na maioria das células e tecidos4,,23,24,25,26. A análise imunohistoquímica do acúmulo βAPP é atualmente a técnica clínica e experimental padrão-ouro para avaliação de DAI4,9,10,20,27. Estudos relataram imunoreatividade βAPP a partir de aproximadamente 2 horas após a lesão, mas há evidências de que as mudanças em curso continuam por um ou mais anos após a lesão23,28,29. As áreas mais vulneráveis são o tronco cerebral, a matéria branca parasagitária do córtex cerebral e o corpus callosum11.
Os modelos animais vivos comuns do DAI são o modelo de percussão de fluido lateral30,31, a lesão de aceleração de impacto32,33 e o modelo de impacto cortical controlado34,,35,36. Esses modelos fornecem alguns resultados úteis, mas com limitações significativas.
Modelos de percussão fluida em modelos animais induzem lesões cerebrais injetando volumes variados de soro na cavidade craniana fechada na linha média, especialmente em modelos de gato e coelho, ou lateralmente em modelos de roedores30,31. A gravidade da lesão pode variar de leve a grave, ajustando a pressão do fluido. Embora este modelo seja confiável e reprodutível, não é um modelo ideal de DAI humano, pois a lesão de percussão produz contusão e/ou hemorragia subaracnóidea e o tipo de impacto primário é distinto das lesões da vida real37,38. Além disso, os efeitos da geometria cerebral e da estrutura intracraniana na direção, deslocamento e velocidade tornam muito difícil realizar uma análise biomecânica precisa da lesão39.
A lesão de aceleração de impacto modelo32,33 usa pesos segmentados de latão que caem livremente de uma altura especificada através de um tubo guia plexiglas em um capacete metálico fixado por acrílico dental ao vértice do crânio do rato. Este modelo é barato, fácil de executar, e pode produzir DAI classificado, mas há também a possibilidade de contusões e fraturas no crânio, comprometendo a reprodutibilidade do modelo. Além disso, a lesão induzida envolve um volume desproporcionalmente menor do cérebro do que em humanos39.
O modelo de impacto cortical controlado emprega um dispositivo de impacto pneumático ou eletromagnético para conduzir um impactante rígido para a dura exposta, inteira através de uma craniotomia unilateral, o que leva à deformação do córtex subjacente16,17. A pressão do ar é responsável pela velocidade do impacto, e a profundidade da deformação cortical é regulada pelo ajuste vertical da trave onde o cilindro é ligado. Como o modelo de percussão fluido, causa principalmente lesões focais.
Em relação a essas desvantagens, um novo modelo de roedor modificado foi desenvolvido com a abertura da dura-máter sobre o hemisfério contralateral para produzir lesões axonais mais difundidas40. No entanto, a maioria dos modelos anteriores requerem craniotomia, e os resultados da patogênese axonal podem ser afetados por contusão e hemorragia que geralmente aparecem em modelos anteriores. Além disso, o mecanismo de lesão nesses modelos é diferente do DAI humano causado pelos movimentos de aceleração-desaceleração do cérebro.
Existem várias etapas no protocolo que são críticas e merecem uma consideração cuidadosa. Deve-se considerar que a cabeça do rato deve ser fixada firmemente nos pinos de ouvido, ou o rato pode cair do dispositivo. Ao cair, outras forças podem desempenhar um papel que afetará a precisão de quaisquer cálculos. Além disso, o peso de ferro deve ser o peso específico e caiu na altura específica observada neste protocolo. Essas medidas foram determinadas empiricamente e são condições obrigatórias para a reprodução do modelo. A instalação do cilindro de plástico deve ser em um ângulo de 90° em relação ao mecanismo de rotação, ou seja, o parafuso. Isso porque é o golpe no parafuso que conduz o mecanismo de rotação. Caso contrário, o atrito do peso de ferro em relação ao cilindro de plástico é introduzido, o que levará a uma diminuição da força aplicada na cabeça do rato.
Existem algumas limitações para este modelo. O desenvolvimento do DAI em humanos é principalmente secundário a um impacto de outro objeto. Neste caso, ou a pessoa se move em direção ao objeto, o objeto se move em direção à pessoa, ou ambos se movem em direção um ao outro. Em tal colisão, um paciente desenvolve uma lesão na cabeça combinada, onde o dano axonal difuso é apenas parte do TCE. Aqui, a aceleração rotacional aplicada é o principal mecanismo que leva ao desenvolvimento do DAI sem outros elementos de lesão na cabeça.
O modelo aqui proposto parece aliviar as complicações das fraturas cranianas e contusões que causaram danos generalizados de matéria branca sem danos adicionais limitados. Semelhante a outros modelos de roedores recentes, este modelo é eficaz e fornece uma baixa (0%) taxa de mortalidade. É uma técnica reprodutível e acessível que poderia servir como um recurso valioso para entender melhor a fisiopatologia do DAI para desenvolver tratamentos mais eficazes.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem com gratidão o Dr. Nathan Kleeorin (Departamento de Engenharia Mecânica da Universidade Ben-Gurion do Negev) por sua ajuda com as medidas biomecânicas. Além disso, agradecemos à professora Olena Severynovska, Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko e Evgenia Goncharyk do Departamento de Fisiologia, Faculdade de Biologia, Ecologia e Medicina, Universidade Oles Honchar Dnipro, Dnipro, Ucrânia por seu apoio e contribuições úteis às nossas discussões.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M sodium citrate | SIGMA - ALDRICH | ||
| 2.5% normal horse serum | SIGMA - ALDRICH | H0146 | Liquid |
| 4 % buffered formaldehyde solution | |||
| Anti-Amyloid Precursor Protein, C - terminal antibodyproduced in rabbit | SIGMA - ALDRICH | Lot 056M4867V | |
| biotinylated secondary antibody | Vector | BA-1000-1.5 | 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin |
| bone-cutting forceps | |||
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine | vector laboratory | ||
| embedding cassettes | |||
| ethanol 99.9 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
| guillotine | |||
| Hematoxylin | SIGMA - ALDRICH | H3136-25G | |
| Hydrogen peroxide solution | Millipore | 88597-100ML-F | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| paraffine | paraplast plus leica biosystem | Tissue embedding medium | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | SIGMA - ALDRICH | P5368-10PAK | Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl - 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C. |
| Streptavidin HRP | ABCAM | ab64269 | Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry. |
| xylene |
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