Summary
このプロトコルは、頭蓋骨骨折や挫傷なしに広範囲にわたる白質損傷を誘発する脳びまん軸索損傷(DAI)の信頼性の高い、実行しやすく、再現可能なげっ歯類モデルを検証する。
Abstract
外傷性脳損傷(TBI)は、死亡および障害の主な原因である。びまん軸索損傷(DAI)は、入院を必要とするTBI患者の大部分において傷害の主要なメカニズムである。DAIは、揺れ、回転、または爆風による広範囲にわたる軸索損傷を伴い、急速な軸索ストレッチ損傷および機能回復への長期的な影響に関連する二次軸索変化を引き起こした。歴史的に、焦点損傷のないDAIの実験モデルは設計が困難であった。ここでは、頭蓋骨骨折や挫傷なしに広範囲にわたる白質損傷を引き起こすDAIのシンプルで再現可能で信頼性の高いげっ歯類モデルを検証します。
Introduction
外傷性脳損傷(TBI)は、米国における死亡および障害の主な原因である。TIは、全傷害関連死の約30%に寄与する11,2.2TBIの主な原因は、年齢層によって異なり、転倒、スポーツ中の高速衝突、意図的な自傷行為、自動車の衝突および暴行11、2、32,3が含まれます。
脳拡散軸索損傷(DAI)は、傷害後の瞬間における無制限の頭部の動きから生じる回転加速度、揺れまたは発爆傷害によって誘発される特定のタイプのTBIである44、5、6、7、8。5,6,7,8DAIは、結果の悪さ、負担の大きい医療費、および,33-64%の死亡率,,,1、2、4、5、9、10、112に関連1する長期的な神経障害につながる広範囲にわたる軸索損傷10を伴う。459DAIの病因に関する重要な最近の研究にもかかわらず、最良の治療オプション11、12、13、14,13,14についてのコンセンサスはありませんでした。11,
過去数十年にわたり、多数の,実験モデルがDAI 11、12、15、16のさまざまな側面を正確に複製しようとしました。11,12,1516しかし、これらのモデルには、他の焦点損傷と比較してDAIのユニークな提示を与えられた制限があります。これらの以前のモデルは、白質領域で軸索損傷を引き起こすだけでなく、焦点脳損傷をもたらす。臨床的には、DAIは微小出血を伴い、白質の損傷の主な原因となる可能性がある。
DAIの主要な臨床特徴を再現する動物モデルは2つだけ示されている。Gennarelliたちは、1982年に第1の横方向頭回転装置を製造し、非ヒト霊長類モデル15においてDAIを用いて昏睡を誘導するために、無衝撃頭部回転加速度を用いた。この霊長類モデルは、加速と減速のために制御された単一回転を採用し、10〜20ミリ秒以内に60°を通して頭を置き換えました。しかし、霊長類モデルは非常に高価な4,4、11、16,16です。前のモデルの一部に基づいて、回転加速度脳損傷の豚モデルは、同様の結果を持つ1994年(Rossら14)で設計された。
これら2つの動物モデルは、典型的な病理の異なるプレゼンテーションを生み出したものの、DAIの病態の概念に大きく加えた。急速な頭部の回転は一般にDAIを誘発するための最良の方法として受け入れられ、げっ歯類は急速な頭部回転の研究11、16,16のためのより安価なモデルを提供する。ここでは、頭蓋骨骨折や挫傷のない広範囲にわたる白質損傷を引き起こすDAIのシンプルで再現可能で信頼性の高いげっ歯類モデルを検証します。このモデルは、DAIの病態生理学の理解と、より効果的な治療法の開発を可能にします。
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Protocol
実験は、ヘルシンキと東京宣言の勧告と欧州共同体の実験動物の使用に関するガイドラインに従って行われた。実験は、ネゲブのベングリオン大学の動物ケア委員会によって承認されました.
実験手順のための1.ラットの準備
注:300〜350グラムの体重の成人オススプレイグドーリーラットを選択してください。
- これらの実験の承認を、施設動物の世話と使用委員会から取得します。
- ラットを12時間光、12時間暗いサイクルで、22±1°Cの室温で維持します。ラットチャウと水のアドリビタムを提供します。
- 午前6時から午後12時の間にすべての実験を行います。
- 麻酔を誘発するために連続イオブルラン投与システムを使用する。気化器システムがイオブルランで満たされていることを確認してください。
- 2%イオブルランでラットを麻酔します。
- 外部刺激に反応して動きやペダル反射の欠如を観察することによって、ラットが完全に麻酔されていることを確認します。
2. びまん軸索損傷の誘導
注:デバイスは、次のコンポーネントで構成されています: 1)透明プラスチックシリンダー、2)鉄重量(1308 g)、3)円筒形チューブ、軸が回転する2つの軸受けと頭の固定(耳のピン)からなる回転機構。4)2つのベアリングを固定している水平プラットフォーム。
- 装置を重く安定した実験室のテーブルの上に置く。
- 高さ120cmに引き上げられた文字列に重みを付けます。
- 自由落下重量がボルトに当たるようにし、回転機構を作動させます。横頭部回転装置を使用して、げっ歯類の頭部は0から90°に急速に回される。
- びまん軸索脳損傷の誘導後、ラットを回復室に移す。
3. 回転運動学/バイオメカティックパラメータの測定。
- 回転運動学/生体力学パラメータを次のように測定します。
ここで Fo - 動物の頭部に適用される力 (kg);M – 力の瞬間;K – 運動エネルギー;m – 落下重量の質量;g - 重力加速度。h – 高さ (cm);D – 耳のピン間の距離 (cm).
注:動物の頭部に適用される力(Fo)を計算するには、落下重量の質量、体重が落ちる高さ、および耳のピン間の距離を知る必要があります。他のパラメータは変更されません。
4. 48時間後の神経学的重症度スコアの評価
注:神経学的欠陥は、前に説明したように神経学的重症度スコアを使用して評価され、採点されました17,18,,19.運動機能および行動の変化は、24の最大スコアが重度の神経機能障害を表すような点系によって評価される。スコアが 0 の場合、神経学的状態がそのままであることを示します。以下の動作関数が評価されます。
- ラットが中心に放置すると、円(直径50cm)から出ることができないと評価します。30分、60分、60分以上続く3つのセッションでこれを実行します。
- 20分、40分、60分以上続く3回のセッションで、ラットの右反射の喪失をテストします。
- 片麻痺のテストを行い、ラットが強制的に位置の変化に抵抗できないこと。
- 後肢の屈曲をテストするために、その尾でラットを上げます。
- まっすぐ歩く能力をテストするために床にラットを置きます。
- 3つの別々の反射をテスト:ピナ反射、角膜反射、および驚くべき反射。
- ラットをシーク行動とプロストレーションの喪失に基づいて臨床グレードで評価する。
- 配置のために四肢の反射をテストします。左右の前肢、次に左右の後肢でテストを行います。
- ビームバランシングタスクを使用して機能テストを実行します。ビームは幅1.5cmを測定する必要があります。20 s、40 s、および 60 s 以上のセッションのテストを実行します。
- 幅8.5cm、幅5cm、幅2.5cmの3つの異なる幅のビームでラットのビームウォーキングテストを行います。
48時間後の組織学的検査のための5.脳コレクション
- 怪我後48時間で、インスピレーションを受けたガス混合物を20%O2 /80%CO2に置き2換えることによってラットを安楽死させる。2CO2は2、制度的動物のケアと使用委員会のガイドラインに従って、所定の速度で提供されることを確認してください。
- 施設の動物のケアと使用委員会のガイドラインに従って死亡確認を確認してください。
- 経皮的に、ラットを温度4°Cで0.9%ヘパリン化食塩水で穿ファゼンし、続いて0.1Mリン酸緩衝塩(pH 7.4)で4%パラホルムアルデヒドの500 mLが続く。
- 灌流後、ギロチンで切断を行う。
- 脳組織の損傷を避けるために、骨切断鉗子でカルバリアを除去することによって脳の収集を行います。
- すぐに脳を取り除き、4°Cで48時間48時間の4%緩衝ホルムアルデヒド溶液に固定します。
- 嗅球面から視覚皮質および二分小脳および脳幹までの5mmコロナセクションに脳をブロックする。
- パラフィン埋め込み後、コロナ切片と矢状切片(5μm)をミクロトーム切片で視床から離します。
6. 免疫化学染色と検査
- 柔らかいブラシでガラススライドにスライスをそっと置きます, スライドごとに1スライス.
- βAPPの免疫化学的染色を行う。
- スライスをキシレン(それぞれ5分間3回)で脱水し、エタノール濃度を徐々に減少させて常温で再水和する:エタノール100%2回3分、エタノール95%2回3分、エタノール90%で3分、エタノール70%で3分、DDWで3分。
- 内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断するために、室温で15分間、3%H2O2で脱パラフィン化および水分補給された脳切片を治療する。2
- 0.01 M クエン酸ナトリウム(pH 6.0)を 98 °Cで 5 分間インキュベートし、抗原検索を行います。
- スライドを室温で20分間バッファーに入れ、冷却します。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で5分間洗浄します。
- 2.5%の正常な馬の血清を室温で1時間ブロックし、ブロッキング血清中に希釈した一次ウサギの抗APP(1:4000)で4°Cで一晩インキュベートします。
- 一次抗体でインキュベーションした後、PBSで室温で切片を洗浄する。
- 適切に希釈したビオチン化二次抗体の切片を15分間インキュベートし、室温で3分間PBSで洗浄します。
- ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼを15分間インキュベートし、室温で3分間PBSで再洗浄します。
- 過酸化水素および3,3-ジアミノベンジジンクロモゲン溶液を含む緩衝基質溶液(pH 7.5)を用いたインキュベートセクションを、色が発達するまで光から保護する。
- 反応を止めるために、室温で5分間DDWでスライドをインキュベートします。
- ヘマトキシリンを室温で3分間カウンターステイン切片にし、流れる水道水で5分間洗浄します。
- 徐々にエタノール濃度を上昇させて、DDWで2分、エタノール70%で2分、エタノール90%で2分、エタノール95%で2分、エタノール100%で2分、キシレンで3回3分の脱水。
- 取り付け媒体と乾燥し、取付け。
- 顕微鏡で200xの顕微鏡倍率でスライスを調べ、20mmの対物レンズを使用して検査します。
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Representative Results
表 1 は、プロトコルのタイムラインを示しています。DAIのこのモデルの死亡率は0%であった。マン・ホイットニーの検定では、介入後48時間(Mdn = 1対0)、U=22.5、p<0.001、r=0.78(表2参照)に比べて15匹のDAIラットに対して神経学的欠損が有意に大きいことが示された。データはカウントで測定され、中央値と 25 ~ 75 パーセンタイル範囲として表示されます。
脳組織の視床切片の代表的な顕微鏡写真を図1に示す。顕微鏡写真は、対照群(67.46±30対0±0)、U=0、p<1.1E-06、r=0.92と比較して、傷害後48時間後のラットにおける単離されたDAIに続く軸索および神経細胞βAPP免疫活性を明らかにした。データはカウントとして測定され、平均値として提示されます。
| グループ | 時間 | 手順 |
| DAI (15匹) | 0時間 | インダクションディフューズ軸索損傷 |
| シャム (15匹) | 48時間 | 神経学的重症度スコア評価, |
| DAI (15匹) | BAPPの免疫化学的染色。 |
表1:プロトコルタイムラインのデモンストレーション異なる時間にラットの様々なグループが示されている:DAI = 実験の開始時に回拡散軸索脳損傷;48時間で、神経学的重症度スコアを決定し、両群でβAPPの免疫化学的染色を行った。
| 48時間での各種グループのNSS値 | ||
| 動物グループ | N | 大台から48時間後のNSS |
| 偽 | 15 | 0 (0-0) |
| 大 | 15 | 1 (1-1)* |
表2: 神経学的重症度スコア神経学的欠損 48 2研究グループのDAIに続く時間.マン・ホイットニー検査では、介入後48時間(Mdn = 1対0)、U=22.5、p<0.001、r=0.78の15匹の偽ラットと比較して、15匹のDAIラットに対して神経学的欠損が有意に大きいことが示された。データはカウントで測定され、中央値と 25 ~ 75 パーセンタイル範囲として表示されます。
図1:免疫化学検査脳組織の視床切片の代表的な顕微鏡写真は、対照群(A)と比較して、ラット(B)傷害後48時間後に単離されたDAIに続く軸索および神経細胞免疫活動を明らかにした(A)。βAPP免疫反応性は、全15個のDAIラットにおいて関心領域において検出されたが、いずれもシャム作動ラットのいずれにも全く検出されなかった。マン・ホイットニー試験では、βAPP陽性軸索の数は、DAI(67.46±30対0±0)、U=0、p<1.1E-06、r= 0.92に続く48時間で、恥を傷ついた動物よりも15匹のDAIラットに対して有意に多いことを示した。画像は元の倍率* 200です。データはカウントとして測定され、平均値として表示されます。
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Discussion
このプロトコルはDAIのげっ歯類モデルを記述する。DAIでは、脳の回転加速は、進行過程で軸索機能の喪失につながる軸索および生化学的変化を引き起こすせん断効果を引き起こす。二次軸索の変化は、急速な軸索ストレッチ傷害によって生成され、その程度および重症度44、5、105,10で可変である。一次損傷後数日以内に、生化学的変化は軸索機能44、5、105,10の喪失につながる。損傷後、軸索膜の透過性が変化し、大量のカルシウム流入が可能となる。カルシウムの摂取は、ミトコンドリアを膨らし、壊れ、カスパーゼを放出し、カスパーゼを介した進行性細胞死454、5、10、11、2010,11,20を引き起こす。,二次軸索損傷は、破裂した端部の軸索球の形で、または軸索44、21、2221,の長さに沿った静脈瘤の形態で存在し得る。22神経インパルス転移の喪失は、βアミロイド前駆体タンパク質(βAPP)の凝集によって表され、ほとんどの細胞および組織に存在する単一の膜貫通タンパク質44、23、24、25、25、26である。,23,24,25,26βAPP蓄積の免疫学的分析は現在,、DAI4、9、10、20、279,10の評価のための金標準の4臨床および20実験技術である。27研究は、βAPP免疫反応性が傷害後約2時間から始まると報告しているが、傷害後23、28、29,28,29後に1年以上にわたって継続的な変化が続いているという証拠がある。最も脆弱な領域は、脳幹、大脳皮質の寄座矢白質、および脳梁11である。
DAIの生体内動物モデルでは、横方向流体打楽器モデル30、31、衝撃加速度傷害30,3232、33、33および制御された皮質衝撃モデル3434、35、3635,36である。これらのモデルは、いくつかの有用な結果を提供しますが、大きな制限があります。
動物モデルにおける流体パーカッションモデルは、特にネコおよびウサギモデルにおいて、またはげっ歯類モデル30,31,31において、閉じた頭蓋腔に様々な量の生理食動物を注入することによって脳損傷を誘発する。損傷の重症度は、液圧を調整することによって軽度から重度に変化させることができる。このモデルは信頼性が高く、再現可能であるが、打楽器損傷は、短所および/またはくも膜下出血を生成し、主な影響の種類は、実際の生活傷害37、38とは異なっているので、38人間のDAIの理想的なモデルではありません。さらに、脳幾何学と頭蓋内構造が方向、変位および速度に及ぼす影響は、傷害39の精密な生体力学的解析を行うことを非常に困難にする。
衝撃加速度傷害モデル32、33は、33指定された高さからプレキシグラスガイドチューブを通って、歯垢によって固定された金属製のヘルメットからラットの頭蓋骨の頂点まで自由に落下するセグメント化された真鍮の重量を使用する。このモデルは安価で、実行しやすく、また等級付けられたDAIを作り出すことができるが、挫傷および頭蓋骨骨折の可能性もあり、モデルの再現性を損なう。さらに、誘発傷害は、ヒト39よりも脳の不釣り合いに小さい体積を伴う。
制御された皮質衝撃のモデルは、空気圧または電磁衝撃装置を用いて、一方的な頭蓋切除術を通じて硬質インパターを露出した全体の硬膜に駆動し、基礎となる皮質16、17,17の変形をもたらす。空気圧は衝撃速度を担い、シリンダが取り付けられているクロスバーの垂直調整により、皮質変形の深さを調整します。流体打楽器モデルと同様に、主に焦点損傷を引き起こす。
これらの欠点に関しては、より広範な軸索損傷40を生成するために、逆半球上の硬膜の開口部を持つ新しい修正げっ歯類モデルが開発されました。しかし、以前のほとんどのモデルは開頭術を必要とし、軸索病原発の結果は、通常、以前のモデルで現れる失調および出血の影響を受ける可能性があります。また、これらのモデルにおける傷害のメカニズムは、脳の加速・減速運動によって引き起こされるヒトDAIとは異なる。
プロトコルには、重要でメリットのあるいくつかのステップがあります。ラットの頭部は耳のピンにしっかりと固定されるべきか、またはラットが装置から落ちる可能性があることを考慮する必要があります。落下時には、他の力が計算の精度に影響を与える役割を果たす可能性があります。また、鉄の重量は、特定の重量と、このプロトコルで記載されている特定の高さでドロップする必要があります。これらの測定は経験的に決定され、モデルの再生のための必須条件である。プラスチックシリンダーの設置は、回転機構、すなわちボルトに対して90°の角度でなければなりません。これは、回転機構を駆動するボルトへのヒットだからです。それ以外の場合は、プラスチックシリンダーに対する鉄重量の摩擦が導入され、ラットの頭部に加えられる力の低下につながります。
このモデルには、いくつかの制限があります。人間のDAIの開発は、主に別の物体からの影響に二次的である。この場合、人はオブジェクトに向かって移動するか、オブジェクトが人に向かって移動するか、または両方が互いに向かって移動します。このような衝突では、患者は、拡散軸索損傷がTBIの一部に過ぎない組み合わせ頭部外傷を発症する。ここで、適用された回転加速度は、頭部外傷の他の要素のないDAIの開発につながる主なメカニズムである。
ここで提案されたモデルは、限られた追加の傷害なしに広範囲にわたる白質損傷を引き起こした頭蓋骨骨折および挫傷の合併症を軽減するように見える。他の最近のげっ歯類モデルと同様に、このモデルは有効であり、低い(0%)を提供する死亡率。DAIの病態生理学をより良く理解し、より効果的な治療法を開発するための貴重なリソースとして役立つ、再現性と手頃な価格の技術です。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ネイサン・クレーオリン博士(ネゲブのベングリオン大学機械工学科)が生体機械測定を支援してくれたことに感謝している。また、オレナ・スヴィノフスカ教授、マリナ・クシェリアワ教授、マクシム・クリヴォノソフ、ダリーナ・ヤクメンコ、エフゲニア・ゴンチャリク生物学・生態学・医学部、オレス・ホンチャー・ドニプロ大学、ドニプロ、ウクライナの支援と貢献に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M sodium citrate | SIGMA - ALDRICH | ||
| 2.5% normal horse serum | SIGMA - ALDRICH | H0146 | Liquid |
| 4 % buffered formaldehyde solution | |||
| Anti-Amyloid Precursor Protein, C - terminal antibodyproduced in rabbit | SIGMA - ALDRICH | Lot 056M4867V | |
| biotinylated secondary antibody | Vector | BA-1000-1.5 | 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin |
| bone-cutting forceps | |||
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine | vector laboratory | ||
| embedding cassettes | |||
| ethanol 99.9 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
| guillotine | |||
| Hematoxylin | SIGMA - ALDRICH | H3136-25G | |
| Hydrogen peroxide solution | Millipore | 88597-100ML-F | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| paraffine | paraplast plus leica biosystem | Tissue embedding medium | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | SIGMA - ALDRICH | P5368-10PAK | Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl - 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C. |
| Streptavidin HRP | ABCAM | ab64269 | Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry. |
| xylene |
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