Summary
Este protocolo valida un modelo de roedor fiable, fácil de realizar y reproducible de lesión axonal difusa cerebral (DAI) que induce daño generalizado a la materia blanca sin fracturas o contusiones de cráneo.
Abstract
La lesión cerebral traumática (TBI) es una de las principales causas de muerte y discapacidad. La lesión axonal difusa (DAI) es el mecanismo predominante de lesión en un gran porcentaje de pacientes con TBI que requieren hospitalización. DAI implica daño axonal generalizado por sacudida, rotación o lesiones por explosión, lo que conduce a lesiones de estiramiento axonal rápido y cambios axonales secundarios que se asocian con un impacto duradero en la recuperación funcional. Históricamente, los modelos experimentales de DAI sin lesiones focales han sido difíciles de diseñar. Aquí validamos un modelo de roedor simple, reproducible y confiable de DAI que causa daños generalizados en la materia blanca sin fracturas de cráneo o contusiones.
Introduction
La lesión cerebral traumática (TBI, por sus) es una de las principales causas de muerte y discapacidad en los Estados Unidos. Los TMI contribuyen a aproximadamente el 30% de todas las muertes relacionadas con lesiones1,2. Las principales causas de TBI difieren entre grupos de edad e incluyen caídas, colisiones de alta velocidad durante los deportes, autolesiones intencionales, accidentes automovilísticos y asaltos1,2,3.
La lesión axonal difusa cerebral (DAI) es un tipo específico de TBI inducida por la aceleración rotacional, temblores o lesiones por explosión del cerebro resultantes del movimiento sin restricciones de la cabeza en el instante después de la lesión4,5,6,7,8. DAI implica un daño axonal generalizado que conduce a un deterioro neurológico duradero que se asocia con un mal resultado, costos de atención de la salud gravosos, y una tasa de mortalidad del 33-64%1,2,4,5,9,10,11. A pesar de importantes investigaciones recientes sobre la patogénesis de DAI, no ha habido un consenso sobre las mejores opciones de tratamiento11,12,13,14.
En las últimas décadas, numerosos modelos experimentales han intentado replicar con precisión diferentes aspectos de DAI11,,12,15,16. Sin embargo, estos modelos tienen limitaciones dada la presentación única de DAI en comparación con otras lesiones focales. Estos modelos anteriores no sólo causan lesiones axonales en regiones de materia blanca, sino que también resultan en lesiones cerebrales focales. Clínicamente, DAI va acompañado de micro hemorragias, que pueden constituir una causa importante de daño a la materia blanca.
Sólo se ha demostrado que dos modelos animales replican las características clínicas clave de DAI. Gennarelli y sus colegas produjeron el primer dispositivo de rotación de cabeza lateral en 1982, utilizando la aceleración rotacional de la cabeza sin impacto para inducir coma con DAI en un primate no humano modelo15. Este modelo de primate empleó una sola rotación controlada para la aceleración y desaceleración para desplazar la cabeza a través de 60o dentro de 10-20 ms. Esta técnica fue capaz de emular la conciencia deteriorada y el daño axonal generalizado que se asemejaba a los efectos de la TBI grave observada en el cerebro humano. Sin embargo, los modelos de primates son muy caros4,11,16. Basado en parte en el modelo anterior, un modelo porcino de lesión cerebral de aceleración rotacional fue diseñado en 1994 (Ross et al.) con resultados similares14.
Estos dos modelos animales, aunque produjeron diferentes presentaciones de patología típica, han añadido en gran medida a los conceptos de patogénesis DAI. La rotación rápida de la cabeza es generalmente aceptada como el mejor método para inducir DAI, y los roedores proporcionan un modelo menos costoso para los estudios de rotación rápida de la cabeza11,16. Aquí, validamos un modelo de roedor simple, reproducible y confiable de DAI que causa daños generalizados en la materia blanca sin fracturas de cráneo o contusiones. Este modelo actual permitirá una mejor comprensión de la fisiopatología de la DAI y el desarrollo de tratamientos más eficaces.
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Protocol
Los experimentos se realizaron siguiendo las recomendaciones de las Declaraciones de Helsinki y Tokio y de las Directrices para el Uso de Animales Experimentales de la Comunidad Europea. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado Animal de la Universidad Ben-Gurion del Negev.
1. Preparación de ratas para el procedimiento experimental
NOTA: Seleccione ratas macho adultas Sprague-Dawley que pesen 300-350 g.
- Obtener la aprobación para la realización de estos experimentos del Comité Institucional de Cuidado y Uso animal.
- Mantener las ratas a una temperatura ambiente de 22 oC, con ciclos de luz de 12 horas y 12 horas de oscuridad. Proporcione comida para ratas y agua ad libitum.
- Realice todos los experimentos entre las 6:00 a.m. y las 12:00 p.m.
- Utilice un sistema de administración continua de isoflurano para inducir anestesia. Asegúrese de que el sistema de vaporizador esté lleno de isoflurano.
- Anestesiar a las ratas con 2% de isoflurano.
- Confirme que la rata está completamente anestesiada observando una falta de movimiento o reflejo del pedal en respuesta a un estímulo externo.
2. Inducción de lesiones axonales difusas
NOTA: El dispositivo consta de los siguientes componentes: 1) cilindro de plástico transparente, 2) peso de hierro (1308 g), 3) mecanismo de rotación que consta de un tubo cilíndrico, dos rodamientos sobre los cuales gira el eje y una fijación de la cabeza (para pasadores de oído); 4) plataforma horizontal en la que se fijan dos rodamientos.
- Coloque el dispositivo en una mesa de laboratorio pesada y estable.
- Fije el peso a una cuerda que esté elevada a una altura de 120 cm.
- Permita que el peso que cae libremente golpee el perno, activando el mecanismo de rotación. Usando el dispositivo de rotación lateral de la cabeza, la cabeza del roedor se gira rápidamente de 0 a 90o.
- Después de la inducción de una lesión cerebral axonal difusa, transfiera la rata a una sala de recuperación.
3. Medición de la cinemática rotacional/parámetros biomecánicos.
- Mida la cinemática rotacional/los parámetros biomecánicos de la siguiente manera:
donde Fo - fuerza aplicada a la cabeza de animal (kg); M – momento de fuerza; K – energía cinética; m – masa de la caída de peso; g - aceleración gravitacional; h – altura (cm); D – distancia entre los pasadores auditivos (cm).
NOTA: Para calcular la fuerza aplicada a la cabeza del animal (Fo), es necesario conocer la masa del peso que cae, la altura a la que cae el peso y la distancia entre los pasadores auditivos. Los demás parámetros permanecen sin cambios.
4. Evaluación de la puntuación de gravedad neurológica después de 48 horas
NOTA: Los déficits neurológicos se evaluaron y calificaron utilizando una puntuación de gravedad neurológica, como se describió anteriormente17,18,19. Las alteraciones en la función motora y el comportamiento se evalúan mediante un sistema puntual de tal manera que una puntuación máxima de 24 representa una disfunción neurológica grave. Una puntuación de 0 indica el estado neurológico intacto. Se evalúan las siguientes funciones de comportamiento.
- Evalúe la incapacidad de la rata para salir de un círculo (50 cm de diámetro) cuando se deja en su centro. Realice esto para tres sesiones individuales que duran 30 min, 60 min y más de 60 min.
- Pruebe la rata para una pérdida de reflejo de corrección en tres sesiones que duran 20 min, 40 min y más de 60 min.
- Realizar la prueba de hemiplejía, la incapacidad de la rata para resistir los cambios forzados en la posición.
- Levante la rata por su cola para probar la flexión de la extremidad posterior.
- Coloque la rata en el suelo para probar su capacidad para caminar recto.
- Prueba de tres reflejos separados: el reflejo pinna, el reflejo corneal y el reflejo de sobresalto.
- Califique a la rata con un grado clínico basado en la pérdida de comportamiento de búsqueda y la postración.
- Pruebe los reflejos de las extremidades para la colocación. Realice la prueba en las extremidades delanteras izquierda y derecha, y luego en las extremidades posteriores izquierda y derecha.
- Realice una prueba funcional a través de la tarea de equilibrio de haz. La viga debe medir 1,5 cm de ancho. Ejecute la prueba para sesiones de 20 s, 40 s y más de 60 s.
- Realizar prueba de caminar de haz en la rata con vigas de tres anchuras diferentes: 8,5 cm de ancho, 5 cm de ancho y 2,5 cm de ancho.
5. Recolección de cerebros para el examen histológico después de 48 horas
- A las 48 horas después de la lesión, eutanasia a las ratas reemplazando su mezcla de gas inspirada por 20% O2/80% CO2. Asegúrese de que elCO2 se entregue a una tarifa predeterminada de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
- Asegurar la confirmación de la muerte de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
- Perfumar transcardiacamente la rata con solución salina heparinizada al 0,9% a temperatura de 4 oC, seguida de 500 ml de paraformaldehído al 4% en solución salina tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7,4).
- Después de la perfusión, realizar la decapitación con una guillotina.
- Realizar la recolección del cerebro mediante la eliminación de las calvarias con fórceps de corte óseo para evitar dañar el tejido cerebral.
- Retire el cerebro inmediatamente y retírelo en una solución de formaldehído tampón del 4% durante 48 h a 4 oC.
- Bloquear cerebros en secciones coronales de 5 mm desde la cara de la bombilla olfativa hasta la corteza visual y cerebelos y tallos cerebrales bisectas.
- Después de la incrustación de parafina, corte las secciones coronales y sagitales (5 m) lejos del tálamo mediante la sección de microtomos.
6. Tinción y examen inmunoquímicos
- Coloque suavemente las rodajas en los portaobjetos de vidrio con un cepillo suave, 1 rebanada por diapositiva.
- Producir tinción inmunoquímica de la APP.
- Desparaffinizar rodajas con xileno (3 veces para 5 min cada una) y rehidratar con concentraciones de etanol gradualmente reducidas a temperatura ambiente: 3 min en 100% etanol dos veces, 3 min en 95% etanol dos veces, 3 min en 90% etanol, 3 min en 70% etanol, y 3 min en DDW.
- Tratar las secciones cerebrales desparafinas y rehidratadas con 3% H2O2 durante 15 min a temperatura ambiente para bloquear la actividad endógena de peroxidasa.
- Incubar secciones con citrato sódico de 0,01 M (pH 6,0) a 98 oC durante 5 min para la recuperación de antígenos.
- Mantenga las diapositivas en el búfer durante 20 minutos a temperatura ambiente para enfriar.
- Lave las secciones con solución salina con fosfato (PBS) dos veces durante 5 min.
- Bloquear las secciones con un 2,5% de suero de caballo normal durante 1 h a temperatura ambiente e incubar durante la noche a 4oC en el conejo primario anti-APP (1:4000) diluido en el suero de bloqueo.
- Después de la incubación en anticuerpos primarios, lave las secciones en PBS a temperatura ambiente.
- Incubar secciones en anticuerpos secundarios biotinylados adecuadamente diluidos durante 15 minutos y lavar con PBS durante 3 minutos dos veces a temperatura ambiente.
- Incubar en estreptavidina-peroxidasa durante 15 minutos y lavar de nuevo en PBS durante 3 minutos dos veces a temperatura ambiente.
- Incubar secciones con solución de sustrato tamponado (pH 7.5) que contenga peróxido de hidrógeno y solución cromática de 3,3-diaminobenzidina y proteger de la luz hasta que se desarrolle el color.
- Incubar los portaobjetos con DDW a temperatura ambiente durante 5 min para detener la reacción.
- Secciones de contramancha con hematoxilina durante 3 minutos a temperatura ambiente y lavar durante 5 minutos con agua del grifo que fluye.
- Deshidratar los portaobjetos con concentraciones graduales de etanol a temperatura ambiente: 2 min en DDW, 2 min en 70% etanol, 2 min en 90% etanol, 2 min en etanol 95%, 2 min en 100% etanol, y 3 min en xileno tres veces.
- Secar y montar con medio de montaje.
- Examine las rodajas bajo aumento del microscopio de 200x con una lente objetivo de 20 mm utilizando un microscopio.
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Representative Results
La Tabla 1 ilustra la línea de tiempo del protocolo. La tasa de mortalidad en este modelo de DAI fue del 0%. Una prueba de Mann-Whitney indicó que el déficit neurológico era significativamente mayor para las 15 ratas DAI en comparación con las 15 ratas falsas a las 48 horas siguientes a la intervención (Mdn 1 frente a 0), U a 22,5, p < 0,001, r a 0,78 (véase el Cuadro 2). Los datos se miden en recuentos y se presentan como mediana y rango de percentiles de 25 a 75.
Fotomicrografías representativas de secciones talámicas del tejido cerebral se muestran en la Figura 1. Los fotomicrografías revelaron inmunoresiones axonales y neuronales de APP tras un DAI aislado en ratas 48 horas después de una lesión en comparación con el grupo de control (67,46 a 30 contra 0 a 0), U a 0, p < 1,1E-06, r a 0,92. Los datos se miden como recuentos y se presentan como medias sd.
| Grupos | hora | Procedimientos |
| DAI (15 ratas) | 0 h | Lesión axonal difusa de inducción |
| Sham (15 ratas) | 48 h | Evaluación de la Puntuación de Gravedad Neurológica, |
| DAI (15 ratas) | Tinción inmunoquímica de BAPP. |
Tabla 1: Demostración de la línea de tiempo del protocolo. Los diferentes grupos de ratas en diferentes momentos se muestran: DAI - Lesión cerebral axonal difusa al comienzo del experimento; A las 48 horas, se determinó una puntuación de gravedad neurológica y se realizó una tinción inmunoquímica de la APP en ambos grupos.
| Valores NSS de los diversos grupos a las 48 horas | ||
| Grupo Animal | N | NSS 48 horas después de DAI |
| Farsa | 15 | 0 (0-0) |
| Dai | 15 | 1 (1-1)* |
Tabla 2: Puntuación de gravedad neurológica. Déficit neurológico 48 horas después de DAI para 2 grupos de estudio. Una prueba de Mann-Whitney indicó que el déficit neurológico era significativamente mayor para las 15 ratas DAI en comparación con las 15 ratas falsas a las 48 horas siguientes a la intervención (Mdn 1 frente a 0), U a 22,5, p < 0,001, r a 0,78. Los datos se miden en recuentos y se presentan como mediana y rango de percentiles de 25 a 75.
Figura 1: Examen inmunoquímico. Los fotomicrografías representativas de las secciones talámicas del tejido cerebral revelaron inmunorreactividades axonales y neuronales después de un DAI aislado en ratas (B) 48 horas después de una lesión en comparación con el grupo de control (A). La inmunoreactividad de APP se detectó en la región de interés en las 15 ratas DAI, y en absoluto en ninguna de las ratas que funcionan con las estafas. La prueba de Mann-Whitney indicó que el número de axones positivos de la APP era significativamente mayor para 15 ratas DAI que para los animales heridos de estafa a 48 horas después de DAI (67,46 a 30 contra 0 a 0), U a 0, p < 1,1E-06, r a 0,92. Las imágenes están en el aumento original * 200. Los datos se miden como recuentos y se presentan como media sd. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo describe un modelo de roedor de DAI. En DAI, la aceleración rotacional en el cerebro causa un efecto de cizallamiento que desencadena cambios axonales y bioquímicos que conducen a la pérdida de la función axonal en un proceso progresivo. Los cambios axonales secundarios son producidos por una lesión rápida del estiramiento axonal y son variables en su extensión y gravedad4,,5,,10. En cuestión de horas a días después de la lesión primaria, los cambios bioquímicos conducirán a la pérdida de la función axonal4,5,10. Después de la lesión, la permeabilidad de la membrana de axón cambia, permitiendo una afluencia masiva de calcio. La ingesta de calcio hace que las mitocondrias se hinchen y se rompan, liberando caspasas y desencadenando la muerte celular progresiva mediada por caspasa4,5,10,11,20. La lesión axonal secundaria puede presentarse en forma de bulbos axonales en el extremo roto o en forma de varicosidades a lo largo de la longitud del axón4,,21,22. La pérdida de la transición del impulso nervioso se expresa por la agregación de la proteína precursora de amiloide (-APP), una sola proteína transmembrana presente en la mayoría de las células y tejidos4,,23,24,25,26. El análisis inmunohistoquímico de la acumulación de la APP es actualmente la técnica clínica y experimental estándar de oro para la evaluación de DAI4,,9,10,20,27. Los estudios han reportado inmunoreactividad de la APP a partir de aproximadamente 2 horas después de la lesión, pero hay evidencia de que los cambios continuos continúan durante uno o más años después de la lesión23,28,29. Las áreas más vulnerables son el tronco encefálico, la materia blanca parasagital de la corteza cerebral y el cuerpo calloso11.
Los modelos animales in vivo comunes de DAI son el modelo de percusión de fluido lateral30,,31, la lesión de aceleración de impacto32,33 y el impacto cortical controlado modelo34,,35,36. Estos modelos proporcionan algunos resultados útiles pero con limitaciones significativas.
Los modelos de percusión fluida en modelos animales inducen lesiones cerebrales inyectando diferentes volúmenes de salina en la cavidad craneal cerrada en la línea media, especialmente en modelos de gatos y conejos, o lateralmente en modelos de roedores30,,31. La gravedad de la lesión puede variar de leve a grave ajustando la presión del líquido. Aunque este modelo es fiable y reproducible, no es un modelo ideal de DAI humano, ya que la lesión de percusión produce contusión y/o hemorragia subaracnoidea y el tipo de impacto primario es distinto de las lesiones de la vida real37,,38. Además, los efectos de la geometría cerebral y la estructura intracraneal en la dirección, el desplazamiento y la velocidad hacen muy difícil realizar un análisis biomecánico preciso de la lesión39.
La lesión de aceleración de impacto modelo32,33 utiliza pesos de latón segmentados de caída libre desde una altura especificada a través de un tubo guía de plexiglás en un casco metálico fijado por acrílico dental al vértice del cráneo de la rata. Este modelo es barato, fácil de realizar y puede producir DAI calificado, pero también existe la posibilidad de contusiones y fracturas de cráneo, comprometiendo la reproducibilidad del modelo. Además, la lesión inducida implica un volumen del cerebro desproporcionadamente menor que en los seres humanos39.
El modelo de impacto cortical controlado emplea un dispositivo de impacto neumático o electromagnético para conducir un impactador rígido sobre la dura entera expuesta a través de una craneotomía unilateral, que conduce a la deformación de la corteza subyacente16,17. La presión del aire es responsable de la velocidad del impacto, y la profundidad de la deformación cortical está regulada por el ajuste vertical de la barra transversal donde está unido el cilindro. Al igual que el modelo de percusión fluida, causa principalmente lesiones focales.
En cuanto a estas desventajas, se ha desarrollado un nuevo modelo de roedor modificado con la apertura de la dura mater sobre el hemisferio contralateral para producir una lesión axonal más extendida40. Sin embargo, la mayoría de los modelos anteriores requieren craneotomía, y los resultados de la patogénesis axonal pueden verse afectados por la contusión y la hemorragia que suelen aparecer en modelos anteriores. Además, el mecanismo de lesión en estos modelos es diferente del DAI humano causado por los movimientos de aceleración-desaceleración del cerebro.
Hay varios pasos en el protocolo que son críticos y merecen una cuidadosa consideración. Uno debe considerar que la cabeza de la rata debe estar firmemente fijada a los pasadores de los oídos, o la rata puede caer del dispositivo. Al caer, otras fuerzas pueden desempeñar un papel que afectará a la precisión de cualquier cálculo. Además, el peso del hierro debe ser el peso específico y caer a la altura específica indicada en este protocolo. Estas mediciones se han determinado empíricamente y son condiciones obligatorias para la reproducción del modelo. La instalación del cilindro de plástico debe estar en un ángulo de 90o en relación con el mecanismo de rotación, a saber, el perno. Esto se debe a que es el golpe al perno que impulsa el mecanismo de rotación. De lo contrario, se introduce la fricción del peso de hierro en relación con el cilindro de plástico, lo que conducirá a una disminución en la fuerza aplicada a la cabeza de la rata.
Hay algunas limitaciones en este modelo. El desarrollo de DAI en humanos es principalmente secundario a un impacto de otro objeto. En este caso, la persona se mueve hacia el objeto, el objeto se mueve hacia la persona, o ambos se mueven hacia el otro. En tal colisión, un paciente desarrolla una lesión combinada en la cabeza, donde el daño axonal difuso es sólo una parte del TBI. Aquí, la aceleración rotacional aplicada es el mecanismo principal que conduce al desarrollo de DAI sin otros elementos de lesión en la cabeza.
El modelo propuesto aquí parece aliviar las complicaciones de las fracturas y contusiones de cráneo que causaron daños generalizados en la materia blanca sin lesiones adicionales limitadas. Al igual que otros modelos recientes de roedores, este modelo es eficaz y proporciona un bajo (0%) tasa de mortalidad. Es una técnica reproducible y asequible que podría servir como un recurso valioso para comprender mejor la fisiopatología de DAI para desarrollar tratamientos más eficaces.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen agradecidamente al Dr. Nathan Kleeorin (Departamento de Ingeniería Mecánica de la Universidad Ben-Gurion del Negev) por su ayuda con las mediciones biomecánicas. Además, agradecemos a la profesora Olena Severynovska, Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko y Evgenia Goncharyk del Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Ecología y Medicina, Universidad Oles Honchar Dnipro, Dnipro, Ucrania por su apoyo y contribuciones útiles a nuestras discusiones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M sodium citrate | SIGMA - ALDRICH | ||
| 2.5% normal horse serum | SIGMA - ALDRICH | H0146 | Liquid |
| 4 % buffered formaldehyde solution | |||
| Anti-Amyloid Precursor Protein, C - terminal antibodyproduced in rabbit | SIGMA - ALDRICH | Lot 056M4867V | |
| biotinylated secondary antibody | Vector | BA-1000-1.5 | 10 mM sodium phosphate, pH 7.8, 0.15 M NaCl, 0.08% sodium azide, 3 mg/ml bovine serum albumin |
| bone-cutting forceps | |||
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3’-diaminobenzidine | vector laboratory | ||
| embedding cassettes | |||
| ethanol 99.9 % | ROMICAL | Flammable Liquid | |
| guillotine | |||
| Hematoxylin | SIGMA - ALDRICH | H3136-25G | |
| Hydrogen peroxide solution | Millipore | 88597-100ML-F | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| paraffine | paraplast plus leica biosystem | Tissue embedding medium | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | SIGMA - ALDRICH | P5368-10PAK | Contents of one pouch, when dissolved in one liter of distilled or deionized water, will yield 0.01 M phosphate buffered saline (NaCl 0.138 M; KCl - 0.0027 M); pH 7.4, at 25 °C. |
| Streptavidin HRP | ABCAM | ab64269 | Streptavidin-HRP for use with biotinylated secondary antibodies during IHC / immunohistochemistry. |
| xylene |
References
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