Summary
我们使用使用 LED 垂直照明的装置，演示对困难物质（如彩色物质或纳米材料）的藻类毒性测试。
Abstract
生态毒性数据是欧洲和国际法规（例如 REACH）对化学品进行上市前和上市后注册的要求。藻类毒性试验经常用于化学品的法规风险评估。为了实现高可靠性和可重复性，制定标准化准则至关重要。对于藻类毒性测试，指南要求参数条件稳定且统一，如pH值、温度、二氧化碳水平和光强度。纳米材料和其他所谓的困难物质会干扰光，导致结果变化很大，妨碍了其监管的接受。为了应对这些挑战，我们开发了LEVITATT（藻类毒性试验LED垂直照明表）。该设置利用下面的 LED 照明，实现均匀的光分布和温度控制，同时最大限度地减少样品内阴影。该设置优化了生物量定量的样本量，同时确保 CO2 的充分流入，以支持藻类的指数级增长。此外，可定制测试容器的材料，以最大限度地减少吸附和挥发。在测试彩色物质或颗粒悬浮液时，LED 灯的使用还允许增加光强，而无需额外产生热量。紧凑的设计和最小的设备要求增加了在广泛的实验室中实施 LEVITATT 的可能性。在符合标准化ISO和经合组织藻类毒性测试指南的同时，LEVITATT还显示出两种参考物质（3，5-5-Dicholorophenol和K2Cr2O7）和三种纳米材料（ZnO、CeO2和BaSO4）的样品间变异性低于埃伦迈尔烧瓶和微蒂特板。
Introduction
藻类毒性试验是用于生成欧洲和国际法规（例如 REACH 1 和 TSCA（美国））对化学品上市前和上市后注册所需的生态毒性数据所需的三种强制性测试之一。为此，国际组织（如ISO和经合组织）制定了标准化藻类测试准则。这些测试标准和准则在 pH、温度、二氧化碳水平和光强方面规定了理想的测试条件。然而，在藻类试验期间保持稳定的测试条件实际上是困难的，结果存在一系列化学物质和纳米材料（通常称为"困难物质"）的可重复性和可靠性问题2。大多数现有的藻类毒性测试装置都位于孵化器内的轨道摇床上，其体积相对较大（100–250 mL）。这种设置限制了测试浓度和可复制的海藻培养和测试材料的数量。此外，这些设置很少具有均匀的光场，在大型烧瓶中还难以获得可靠的照明条件，部分原因是光强度在光传播得更远时呈指数级下降，部分由于烧瓶几何形状。替代设置包括塑料微刺激器3板，包含小样本量，不允许足够的采样量来测量 pH 值、额外的生物量测量、颜料提取或其他需要破坏性采样的分析。利用现有的纳米材料和形成彩色悬浮物的物质的藻类毒性测试的一个特别挑战是干扰或阻挡藻类细胞可用的光，通常被称为"阴影"4，5。,5测试材料和/或测试材料与藻类细胞之间的相互作用可能发生小瓶内的阴影，或者由于小瓶相对于彼此和光源的定位，在小瓶之间可能发生阴影。
该方法基于阿伦斯伯格等人提出的 小规模藻类毒性测试装置，允许按照经合组织2017和ISO 86928等标准进行测试。该方法得到进一步优化，以解决上述限制：1） 利用 LED 光技术确保均匀的光条件，产生最少的热量;2） 在保持恒定 pH、CO 2 水平的同时，为化学/生物分析提供足够的样品量;3） 允许使用多功能测试容器材料来测试挥发性物质或具有高吸附潜力的物质。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 莱维特设置的描述
- 使用20 mL闪烁玻璃瓶（图1，插入1），允许光线穿透。或者，可以使用轻的可塑胶瓶。使用光度计量化光强。
- 在测试开始时至少使用 4 mL 测试悬浮液，以便对生物量进行定量，并在孵化期间和之后对纳米材料进行表征/定量（图 1，插入 2）。
- 将 20 mL 闪烁小瓶与盖（图1，插入 3）配合，其中钻了一个小孔（直径约 1 mm），以便与大气交换CO2。 这种交换对于确保测试期间稳定的pH和CO2 水平至关重要。
- 对于挥发性物质，使用气密特氟龙涂层盖，允许使用注射器9或完全封闭的烧瓶对头部空间进行 CO2富集，其中 CO2由富集的碳酸氢钠 （NaHCO3）缓冲液系统10在溶液中保持 CO 2 。
- 用安装在外套管上的夹子固定小瓶（图1，插入4）。
- 使用位于测试小瓶下方的 LED 光源（图 1，插入 5），提供"冷白"或"日光"类型的均匀荧光照明，以及 60×120 μE μm-2μs-1范围内的光照强度，在光合作用有效波长范围 400 nm 至 700 nm 中测量。该装置通过将光调光器安装到光源上，在 5~160 μEμm-2[s-1）范围内采用可调光强。-1这允许在更高和更低的光强度下进行测试。
- 将设置安装在轨道摇床上，以在整个测试期间搅拌样品。这保持细胞自由悬浮，并促进CO2质量 从空气转移到水（图1，插入6）。
- 将设置放在温度控制室或恒温柜中，以在整个测试过程中保持稳定的温度（图 1，插入 7）。
图1：藻类毒性试验LED垂直照明表图片（LEVITATT）。1） 20 mL 玻璃闪烁小瓶用于孵化，2） 4 mL 样品用于分析，3） 带钻孔的盖子用于 CO2 交换，4） 用于定义光条件的外壳，5） 位于外壳中心的 LED 光源，6） 用于实验期间搅拌的轨道摇床，以及 7） 恒温柜。 请单击此处查看此图的较大版本。
2. 准备藻类生长介质
- ISO 8692 藻类生长介质由四种不同的库存解决方案组成。根据表1称量出适当量的盐，并在超纯 水中稀释。
| 库存解决方案 | 营养 | 库存溶液中的浓度 | 测试溶液中的浓度 |
| 1： 宏量营养素 | NH4Cl | 1.5 克/升 | 15毫克/升（N：3.9毫克/升） |
| Mgcl2+6H2O | 1.2 克/升 | 12毫克/升（毫克：2.9毫克/升） | |
| CaCl2+2H2O | 1.8 克/升 | 18毫克/升（卡：4.9毫克/升） | |
| MgSO4+7H2O | 1.5 克/升 | 15毫克/升（S：1.95毫克/升） | |
| Kh2PO4 | 0.16 克/升 | 1.6毫克/升（P：0，36毫克/升） | |
| 2： 费-埃塔 | 费克3+6H2O | 64毫克/升 | 64 μg/L （费： 13 μg/L） |
| Na2EDTA=2H2O | 100毫克/升 | 100 μg/L | |
| 3： 微量元素 | H3BO3a | 185毫克/升 | 185 μg/L （B： 32 μg/L） |
| MnCl2+4H2O | 415毫克/升 | 415 μg/L （Mn： 115 μg/L） | |
| ZnCl2 | 3毫克/升 | 3 μg/L （Zn： 1.4 μg/L） | |
| CoCl2+6H2O | 1.5毫克/升 | 1.5 μg/L （公司： 0.37 μg/L） | |
| CuCl2+2H2O | 0.01毫克/升 | 0.01 μg/L （铜： 3.7 纳克/升） | |
| Na2MOO4+2H2O | 7毫克/升 | 7 μg/L （摩尔： 2.8 μg/L） | |
| 4： 纳赫科3 | 纳赫科3 | 50 克/升 | 50毫克/升（C： 7.14毫克/升） |
表1：藻类生长介质库存溶液中的养分浓度
注： H3BO3 可以通过添加 0.1 M NaOH 溶解。测试金属时应去除EDTA，以避免与金属离子混为一格。通过膜过滤（平均孔径 0.2 μm）或高压灭菌（120°C，15分钟）对库存溶液进行灭菌。不要使用 2 和 4 的灭菌剂库存解决方案，但通过膜过滤进行消毒。将溶液存放在4°C的黑暗中。
- 要生产1升藻类生长介质，将500 mL灭菌超纯水转移到1L灭菌体积瓶中，并加入10 mL的库存溶液1：微量营养剂，1 mL的库存溶液2：Fe-EDTA，1 mL的库存溶液3：微量元素，1mL的库存溶液4：NaHCO3。
- 用消毒的超纯水填充高达 1 L，塞下烧瓶，彻底摇动，使藻类生长介质均匀。
- 在使用前，通过让溶液与空气接触过夜或用无菌过滤空气冒泡 30 分钟来平衡溶液。平衡后，如有必要，将 pH 调整为 pH 8.1 ± 0.2，使用 1 M HCl 或 1 M NaOH。
3. 设置藻类测试
注：图2显示了藻类试验程序的 流程图。
图2：藻类测试设置流程图。请单击此处查看此图的较大版本。
- 按照步骤2，在藻类生长介质中，以所需的最高测试浓度准备试验化合物的库存溶液。如要制备库存溶液/悬浮液，请遵循经合组织201（可溶性化合物）或经合组织318（纳米材料）。
- 测量库存溶液中的 pH 值。如果与藻类生长介质偏离多个单位，则使用 1 M HCl 或 1 M NaOH 将 pH 值调整为 8。
- 在 25 mL 测试溶液中计算最终细胞浓度达到 1 x 104 细胞 /mL 所需的中分量。
注意： 幼崽应该来自使用 LEVITATT 设置生长的未污染指数级 生长的 Raphidocelis 子胶囊的文化。 - 计算要添加到每个 25 mL 体积烧瓶中的库存溶液量，以获得所需的测试浓度。每个浓度之间的系数不应超过3.2。
- 标记每个选定浓度的 25 mL 体积烧瓶，并标记另外 25 mL 体积烧瓶标记控制。
- 将达到所需浓度所需的测试化合物的库存溶液量添加到 25 mL 体积烧瓶中。不要 向 控件添加库存溶液。
- 将介质添加到每个 25 mL 体积烧瓶中，达到约 20 mL 的体积。
- 将步骤 3.3 中计算的 inolum 体积添加到每个 25 mL 体积烧瓶中。将介质添加到每个 25 mL 体积烧瓶中，最终总体积为 25 mL。
- 通过垂直转动烧瓶两次，止塞烧瓶并彻底混合。
- 将 0.4 mL 从每个烧瓶转移到单独的螺帽小瓶中，并添加 1.6 mL 的丙酮（饱和与 MgCO3）：每个测试浓度和控制一个样本。紧闭盖子，在室温下存放在黑暗中，直到荧光测量（第 4 节）。
- 将每个测试溶液的 4 mL 移入 20 mL 闪烁小瓶（每次浓度 3 次复制，控制 5 次）。在闪烁小瓶上拧紧盖子。 请记住 ，盖子必须有一个钻孔（直径约 1 mm），以便进行 CO2 交换。
- 24 小时、48 小时和 72 小时后，将每瓶 0.4 mL 移入螺帽小瓶中，并加入 1.6 mL 丙酮（饱和 MgCO3）。紧闭盖子，在室温下存放在黑暗中，直到荧光测量（第 4 节）。
- 在72小时取最后一个样本后，轻轻地将给定浓度的三个复制物汇集在一个小瓶中，并测量pH值。对所有浓度和控件重复。对于任何测量的样品，pH 值不应超过 1.5 个单位的初始 pH。
- 按照您的机构规则和规定，将剩余的液体排放到废物容器中。
4. 分析藻类试验样品
- 使用荧光分光光度计测量藻类生物量（此处表示为叶绿素A）。1 叶绿素 A 的峰值发射量为 420 nm，用于激发波长，671 nm 表示发射波长。
- 测量每个样品的荧光三次，并计算每个样品的平均值。
- 使用方程 1 计算增长率。测量荧光（相对单位）可直接用作方程1中的生物量参数。
方程 1： μ = （ln Nt = ln N0） / t
其中μ是增长率（d-1），N0是初始生物量，Nt是时间t时的生物量，t是测试周期（d）的长度。请注意，N0和 Nt应以同一单位表示。 - 使用统计软件将非线性回归曲线（例如，日志逻辑或 Weibull 函数）拟合到增长率数据中，以获得 10%、20% 和 50% 抑制的有效浓度值。在补充信息中，提供了使用DRC包11 在统计软件R中拟合的代码示例。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
对参考物质进行初始测试，以确定藻类菌株的敏感性。经常用于R. 亚卡皮塔的参考物质是二氯酸钾和 3，5-二氯酚7，,8。图 3 和表 2显示了藻类测试的代表性结果，包括曲线拟合和统计输出，当 DRC 包装在 R 中应用于增长率时。
图3：72小时化合物接触藻类（R.亚资本）的代表性浓度-反应曲线。实线表示对数逻辑拟合，阴影区域为拟合的 95% 置信区间。打开的圆圈表示每个复制的计算增长率。 请单击此处查看此图的较大版本。
| EC10 | EC20 | EC50 | |
| [毫克/升] | [毫克/升] | [毫克/升] | |
| 化合物 | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
表2：使用藻类（R.亚资本）抑制化学化合物生长速率的10%、20%和50%的代表性有效浓度。 括号中的值表示日志物流接头的 95% 置信区间。
成功的测试将使增长率高于 0.9d-1 以符合 OECD 准则，1.5d-1 符合 ISO 8692 准则，并且至少应包含 0% 至 100% 抑制之间的一个浓度。由于各种问题（如细菌污染或在测试开始时未处于指数增长阶段）而出现低增长率。对复制的微观调查应只显示均匀的刀状绿藻（R. 子藻类），尺寸约为2 μm宽度和8 μm长度。如果单个复制被污染，可以省略它，并且无需此数据即可执行分析。但是，如果多个复制被污染，重复实验与未受污染的指数增长的内分。要评估 inoculum 在测试开始时是否处于指数生长阶段，请计算控制以 24 小时间隔复制的生长速率，并且仅使用控制藻类生长呈指数化的时间间隔进行统计分析。
为了测试装置的鲁棒性，对使用两种参考物质（K2Cr2O 7 和 3，5-二氯酚）和三种纳米材料进行了三次毒性试验（3，5-二氯酚， BaSO4纳米粒子 （NM-220） 和 ZnO 纳米粒子 （NM-111） 和四次（K2Cr2O7和 CeO2纳米粒子 （NM-212）。7结果显示，EC50-值的变化系数在11%至39%之间，ZnO纳米粒子（NM-111）观察到的最低变异系数，CeO 2纳米粒子（NM-212）变化系数最高（2表3）。
| 复合 | 实验数 | 增长率的样本间变化系数 % |
EC50 （平均） 毫克/升 |
EC50 值的变异系数 % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3，5-二氯酚 | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP （NM-220） | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| CEO2 NP （NM-212） | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| ZnO NP （NM-111） | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
表 3：R.子 胶囊暴露为72小时至JRC储存库的两种参考物质和三种纳米材料的内部实验室毒性试验结果
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
浮游植物将太阳能和二氧化碳转化为有机物，因此在水生生态系统中起着关键作用。因此，藻类生长率抑制试验是化学品监管风险评估所需的三项强制性水生毒性试验之一。在这方面，进行可靠和可重复的藻类毒性测试的能力是关键。使用 Erlenmeyer 烧瓶的测试设置引入了一系列变化和不便，如简介 中所述。为了规避这个问题，已经提出了微刺激板3。虽然微刺激板最大限度地减少了测试所需的体积和空间，但文献中对此类设置是否符合测试指南6的测试有效性标准提出了关注。例如，在细胞生长介质（DMEMGRTERMAX、Opti-MEM和Hams F12 GlutaMAX）中，半挥发性化学品的显著损失以及微刺激板中其他孔的交叉，最近由Birch等人演示。挥发性物质的测试可以成功地进行与LEVITATT设置使用1）封闭小瓶与CO 2 富集头空间9，2）直接给挥发性化合物通过头部空间13 或在填充测试小瓶10。在空间要求方面，LEVITATT 提供一个测试设置，填补了微蒂板和 Erlenmeyer 烧瓶设置之间的空白，同时仍然提供两种设置的好处，例如，保持简洁紧凑的测试环境和足够的测试体积进行破坏性采样（例如，在测试期间对纳米材料进行表征）。
LEVITATT测试系统的样品间变异性从3.4%（3，5-二氯酚和ZnO NP）到5.6%（BaSO4 NP）不等。这符合经合组织201准则7 所指明的复制控制培养物平均生长变化系数15%的要求（对于LEVATT样本间变异性，还包括所有接触）。
参考物质测试设置的 EC50值的可重复性显示 K 2 Cr2O7（n =7 4） 的方差系数为 13%，3，5-二氯酚 （n = 3） 的方差系数为 21%。这与使用常规 250 mL Erlenmeyer 烧瓶生物测定进行的测试相当，参考物质 K2Cr2O7显示 EC50-值的 16.8%14和25.4% 15变异系数。微刺激板显示某些参考物质（例如K2Cr2O7（9% 14，15）的变异系数较低，15而苯酚（34.9%16）和二氯苯酚（38%17）的变异系数较高。关于纳米材料研究的可重复性，信息有限。但是，使用 LEVITATT 系统比较 ZnO NPs 的样本间变异系数 （3.4%）与微蒂板（67%18）或埃伦迈尔烧瓶（13%19和1935%20），它有20较少的变化。为了进一步测试LEVITATT系统的鲁棒性，对两种试验材料（一种参考物质和一种难以测试的物质）进行了循环研究。
如果不在无菌条件下处理，很难维持未污染的藻类养殖。指数藻类生长是执行指导性藻类测试的关键先决条件。测量多个时间点（例如 24 小时、48 小时、72 小时）的生长可以确定在整个测试期间是否呈指数增长。温度和pH值的波动会影响藻类的生长;因此，这些参数在整个测试期间必须稳定。在小批量测试样品中，温度和 pH 值的波动比较大的体积波动更快，随着测试体积的减少，测量这些参数的实际问题变得越来越困难。在 LEVITATT 的 72 h 测试期间，使用 4 mL 测试体积的 pH 和温度等参数在 20 °C ± 2 °C 的温度控制室和类似条件下的培养箱中保持稳定。
定量藻类生长的分析方法很多：血细胞计中的细胞计数、库尔特计数器或色素提取物的荧光。对于困难物质，应考虑哪种最适宜的生物量量化方法。对于金属氧化物纳米粒子，由于通过血细胞计或光酸计数器21计算藻类时，由于聚集物的干扰，颜料提取物的荧光效果最佳。相比之下，Farkas和S booth22 发现，由于颜料对纳米材料的自荧光和吸收性，通过荧光对生物量进行定量并不是碳基纳米材料生态毒性测试的合适方法。对于有色物质，颜色也可能与荧光发射信号发生干扰，因此，需要额外的控制或稀释到这种干扰可以忽略不计的水平。
在水生毒性试验的指导文件中，对彩色物质进行检测的建议之一是增加光强度。同样，在测试纳米材料23，24时，也提到了增加光强来规避着色问题。然而，这种修改往往与温度升高有关，因此，需要增加样品的冷却或通风。在 LEVITATT 设置中，与传统灯泡或荧光灯相比，使用发光灯解决了这种问题，这种光产生的热量很小。此外，选择具有足够高光强输出的 LED 和安装调光器，可以增加光强以测试有色物质或纳米材料和常规化学品，而无需更改测试之间的整体设置。此外，将光源放置在样品下方和单独的套管中，可实现一致且均匀的光场。
总之，LEVITATT为符合国际标准化准则的常规化学品的藻类毒性测试提供了一个紧凑的平台。此外，该装置为测试干扰光向藻类（如纳米材料）的光传递的困难物质提供了一个强大的平台。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究由S前-纳米安全测试先进工具资助，根据Horizon 2020研究和创新计划授予协议760813。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
