Summary
Vi demonstrerer algetoksicitetstest for vanskelige stoffer (f.eks. farvede stoffer eller nanomaterialer) ved hjælp af en opsætning, der belyses lodret med en LED.
Abstract
Økotoksicitetsdata er et krav for registrering af kemikalier før og efter markedet i henhold til europæiske og internationale bestemmelser (f.eks. Algetoksicitetstesten anvendes ofte til lovpligtig risikovurdering af kemikalier. For at opnå høj pålidelighed og reproducerbarhed er det afgørende at udvikle standardiserede retningslinjer. For algetoksicitetstest kræver retningslinjerne stabile og ensartede betingelser for parametre som pH, temperatur, kuldioxidniveauer og lysintensitet. Nanomaterialer og andre såkaldte vanskelige stoffer kan forstyrre lyset, hvilket medfører en stor variation i de opnåede resultater, hvilket hæmmer deres regulerende accept. For at løse disse udfordringer har vi udviklet LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toksicitet Tests). Opsætningen udnytter LED belysning nedefra giver mulighed for en homogen lysfordeling og temperaturkontrol og samtidig minimere intra-prøve skygge. Opsætningen optimerer prøvevolumenet til biomassekvantificering og sikrer samtidig en tilstrækkelig tilstrømning af CO2 til at understøtte eksponentiel vækst af algerne. Derudover kan materialet i testbeholderne skræddersys for at minimere adsorption og fordampning. Når du tester farvede stoffer eller partikelsuspensioner, giver brugen af LED-lys også mulighed for at øge lysintensiteten uden yderligere varmeproduktion. Det kompakte design og kravene til minimalt udstyr øger mulighederne for implementering af LEVITATT i en lang række laboratorier. Mens levitatt variabilitet i overensstemmelse med standardiserede ISO- og OECD-retningslinjer for algetoksicitetstest, udviste det også en lavere variation mellem prøverne for to referencestoffer (3,5-Dicholorophenol og K2Cr2O7) og tre nanomaterialer (ZnO, CeO2og BaSO4) sammenlignet med Erlenmeyerskkolber og mikrotiterplader.
Introduction
Algetoksicitetstesten er en af kun tre obligatoriske test, der anvendes til at generere de økotoksicitetsdata, der kræves til1 registrering før og efter markedet af kemikalier i henhold til europæiske og internationale bestemmelser (f.eks. Med henblik herpå er internationale organisationer (f.eks. Disse teststandarder og retningslinjer foreskriver ideelle testbetingelser med hensyn til pH, temperatur, kuldioxidniveauer og lysintensitet. Det er imidlertid i praksis vanskeligt at opretholde stabile testbetingelser under algetestning, og resultaterne lider under problemer med reproducerbarhed og pålidelighed for en række kemiske stoffer og nanomaterialer (ofte kaldet "vanskelige stoffer")2. De fleste af de eksisterende algetoksicitetstestopsætninger opererer med relativt store mængder (100-250 ml) beliggende på en orbital shaker inde i en inkubator. En sådan opsætning begrænser antallet af testkoncentrationer og replikerer opnåelige og store mængder algekultur og testmateriale. Derudover har disse opsætninger sjældent et ensartet lysfelt, og pålidelige lysforhold er desuden vanskelige at opnå i store kolber, dels fordi lysintensiteten falder eksponentielt, jo længere lys bevæger sig, og dels på grund af kolbens geometri. Alternative opsætninger omfattermikrotiter af plast 3-plader, der indeholder små prøvemængder, som ikke giver mulighed for tilstrækkelige prøvetagningsmængder til måling af pH, yderligere biomassemålinger, pigmentekstraktion eller andre analyser, der kræver destruktiv prøveudtagning. En særlig udfordring ved hjælp af eksisterende opsætninger til algetoksicitetstest af nanomaterialer og stoffer, der danner farvede suspensioner, er interferensen eller blokeringen af det lys, der er tilgængeligt for algecellerne, ofte kaldet "skygge"4,5. Skygger kan forekomme i hætteglas af testmaterialet og/eller interaktioner mellem testmaterialet og algecellerne, eller der kan forekomme skygge mellem hætteglassene på grund af deres placering i forhold til hinanden og lyskilden.
Metoden er baseret på den lille algetoksicitetstest , der blev indført ved Arensberg et al.6 , og som gør det muligt at teste i overensstemmelse med standarder som OECD 2017og ISO 86928. Metoden er yderligere optimeret til at løse de begrænsninger, der er anført ovenfor ved: 1) anvendelse af LED-lysteknologien til at sikre ensartede lysforhold med minimal varmeproduktion, 2) der giver tilstrækkelig prøvevolumen til kemisk/biologisk analyse, samtidig med at konstant pH, CO2-niveauer og 3) bevarer mulighed for at anvende alsidigt testbeholdermateriale til test af flygtige stoffer eller stoffer med et højt sorptionspotentiale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beskrivelse af LEVITATT-opsætningen
- Brug 20 ml scintillation glasglas(Figur 1, indsæt 1) giver lysindtrængning. Alternativt kan lette hætteglas med plast kan anvendes. Kvantificere lysintensiteten ved hjælp af et fotometer.
- Der anvendes mindst en 4 ml prøvesuspension ved testens begyndelse for at gøre det muligt at kvantificere biomasse og til karakterisering/kvantificering af nanomaterialer under og efter inkubationen (figur 1, indsats 2).
- De 20 ml scintillationshætteglas monteres med en hætte (Figur 1, indsats 3), hvor der bores et lille hul (ca. 1 mm i diameter), så CO2 kan udskiftes med atmosfæren. Denne udveksling er afgørende for at sikre stabile pH- og CO2-niveauer under test.
- For flygtige stoffer anvendes en lufttæt Teflon-belagt hætte for at muliggøre CO2-berigelse af headspace ved hjælp af ensprøjte 9 eller helt lukkede kolber uden gasfase, hvor CO2 holdes i opløsning ved hjælp af et beriget natriumbikarbonat (NaHCO3) buffersystem10.
- Fastgør hætteglassene med klemmer monteret på det udvendige hus(Figur 1, indsats 4).
- Brug en LED-lyskilde under testglassene (Figur 1, indsats 5), der giver en ensartet lysstoflysning af typen "koldhvid" eller "dagslys" og en lysintensitet i området 60-120 μE∙m-2∙s-1 målt i det fotosyntetisk effektive bølgelængdeområde på 400 nm til 700 nm. Opsætningen anvender justerbar lysintensitet i området 5-160 μE∙m-2∙s-1 ved at montere en lysdæmper på kilden. Dette giver mulighed for test ved højere og lavere lysintensiteter.
- Monter opsætningen på en orbital shaker for at agitere prøver under hele testens varighed. Dette holder cellerne i fri suspension og letter CO2 masseoverførsel fra luft til vand(Figur 1,indsats 6).
- Sæt opsætningen i et temperaturstyret rum eller et termostatskab for at opretholde stabile temperaturer under hele prøvningen(Figur 1, indsats 7).
Figur 1: Billede af LED Lodret belysningstabel for Algetoksicitetstest (LEVITATT). 1) 20 ml glas scintillation hætteglas til inkubation, 2) 4 ml prøve til analyse, 3) låg med boret hul til CO2 udveksling, 4) kabinet for definerede lysforhold, 5) LED lyskilde placeret i midten af kabinettet, 6) orbital shaker for agitation under forsøget, og 7) astat termoiske kabinet. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Forberedelse af algevækstmedium
- ISO 8692 algevækstmediet består af fire forskellige lagerløsninger. Salte vejes og fortyndes i ultrarent vand i henhold til tabel 1.
| Lagerløsninger | Næringsstof | Koncentration i lageropløsning | Koncentration i testopløsning |
| 1: Makronæringsstoffer | NH4Cl | 1,5 g/L | 15 mg/l (N: 3,9 mg/l) |
| MgCl2∙6H2O | 1,2 g/L | 12 mg/l (Mg: 2,9 mg/l) | |
| CaCl2∙2H2O | 1,8 g/L | 18 mg/l (ca. | |
| MgSO4∙7H2O | 1,5 g/L | 15 mg/l (S: 1,95 mg/l) | |
| KH2PO4 | 0,16 g/l | 1,6 mg/l (P: 0,36 mg/l) | |
| 2: Fe-EDTA | FeCl3∙6H2O | 64 mg/L | 64 μg/L (Fe: 13 μg/L) |
| Na2EDTA∙2H2O | 100 mg/L | 100 μg/L | |
| 3: Sporstoffer | H3BO3a | 185 mg/L | 185 μg/L (B: 32 μg/L) |
| MnCl2∙4H2O | 415 mg/L | 415 μg/L (Mn: 115 μg/L) | |
| ZnCl2 | 3 mg/L | 3 μg/L (Zn: 1,4 μg/L) | |
| CoCl2∙6H2O | 1,5 mg/L | 1,5 μg/L (Co: 0,37 μg/L) | |
| CuCl2∙2H2O | 0,01 mg/l | 0,01 μg/L (Cu: 3,7 ng/L) | |
| Na2MoO4∙2H2O | 7 mg/L | 7 μg/L (Mo: 2,8 μg/L) | |
| 4: NaHCO3 | NaHCO3 | 50 g/L | 50 mg/l (C: 7,14 mg/l) |
Tabel 1: Koncentrationer af næringsstoffer på lagerløsninger for algevækstmedium
BEMÆRK: H3BO3 kan opløses ved at tilføje 0,1 M NaOH. EDTA bør fjernes, når metal testes, for at undgå teint med metalioner. Stockopløsningerne steriliseres ved membranfiltrering (gennemsnitlig porediameter 0,2 μm) eller ved autoklavering (120 °C, 15 min.). Der må ikke anvendes autoklavebestandopløsninger 2 og 4, men de steriliseres ved membranfiltrering. Opløsningerne opbevares i mørke ved 4 °C.
- For at producere 1 L af algevækstmedium overføres 500 ml steriliseret ultrarent vand til en 1 L steriliseret målekolbe og tilsættes 10 ml lageropløsning 1: Makronæringsstoffer, 1 ml lageropløsning 2: Fe-EDTA, 1 ml lageropløsning 3: Sporelementer og 1 ml lageropløsning 4: NaHCO3.
- Fyld op til 1 L med steriliseret ultrarent vand, tilstopper kolben og ryst grundigt for at homogenisere algevækstmediet.
- Ækvibrer opløsningen før brug ved at lade den natten over i kontakt med luft eller ved at boble med steril, filtreret luft i 30 minutter. Efter ækvilibrering justeres om nødvendigt pH-3 til pH 8,1 ± 0,2 med enten 1 M HCl eller 1 M NaOH.
3. Opsætning af algetesten
BEMÆRK: Et flowdiagram over algeprøvningsproceduren er vist i figur 2.
Figur 2: Flowdiagram over algetestopsætningen. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Der fremstilles en lageropløsning af teststoffet ved den ønskede højeste testkoncentration i algevækstmediet, der er fremstillet i henhold til trin 2. Ved fremstilling af stockopløsninger/suspensioner skal du følge OECD 201 (for opløselige forbindelser) eller OECD 318 (for nanomaterialer).
- Mål pH-3 i lageropløsningen. Hvis den afviger mere end én enhed fra algevækstmediet, justeres pH-prisen til 8 med enten 1 M HCl eller 1 M NaOH.
- Inokulumvolumen, der er nødvendigt for at opnå en endelig cellekoncentration på 1 x 104 celler/ml, beregnes i en 25 ml testopløsning.
BEMÆRK: Inoculum bør komme fra en kultur af uforurenet eksponentielt voksende Raphidocelis subkapitalitata dyrket ved hjælp af LEVITATT setup. - Den mængde lageropløsning, der skal tilsættes hver 25 ml målekolbe, beregnes for at opnå de ønskede testkoncentrationer. Faktoren mellem hver koncentration bør ikke overstige 3,2.
- Der mærkes en 25 ml målekolbe for hver valgt koncentration og en yderligere 25 ml målekolbe mærket betjeningsenhed.
- Der tilsættes den mængde lageropløsning af teststoffet, der er nødvendig for at nå de ønskede koncentrationer, til den 25 ml målekolbe. Tilføj ikke lageropløsning til kontrolelementet.
- Tilsættes mediet til hver 25 ml målekolbe for at nå et volumen på ca. 20 ml.
- Der tilsættes det i trin 3.3 beregnede volumen af inokulum til hver 25 ml målekolbe. Mediet til hver 25 ml målekolbe til et endeligt samlet volumen på 25 ml.
- Kolberne afpropperne og blandes grundigt ved at dreje kolberne to gange lodret.
- 0,4 ml fra hver kolbe overføres til individuelle skruedækselglas og tilsættes 1,6 ml acetone (mættet med MgCO3): en prøve for hver prøvekoncentration og kontrol. Fast luk lågene tæt og opbevar i mørke ved stuetemperatur, indtil fluorescensmålinger (afsnit 4).
- Pipet 4 ml af hver testopløsning i 20 ml scintillationshætteglas (3 replikater pr. koncentration og 5 replikater til kontrol). Skru låg på scintillationshætteglas. Husk, at lågene skal have et boret hul (ca. 1 mm i diameter) for at muliggøre CO2-udskiftning.
- Efter 24 timer, 48 timer og 72 timer pipet 0,4 ml fra hvert hætteglas i skruedækselglas og tilsættes 1,6 ml acetone (mættet med MgCO3). Fast luk lågene tæt og opbevar i mørke ved stuetemperatur, indtil fluorescensmålinger (afsnit 4).
- Efter den sidste prøve er udtaget ved 72 timer, skal de tre replikater forsigtigt samles for en given koncentration i et hætteglas, og pH-hætten måles. Gentag for alle koncentrationer og kontrol. PH-3 bør ikke afvige mere end 1,5 enheder fra den oprindelige pH-værdi for nogen af de målte prøver.
- De resterende væsker udlades i en affaldsbeholder efter dine institutionelle regler og forskrifter.
4. Analyse af algetestprøver
- Brug et fluorescensspektrofotometer til at måle algebiomassen (her udtrykt som klorofyl A). Den maksimale emission for klorofyl A er 420 nm for excitation bølgelængde og 671 nm for emission bølgelængde.
- Der måles fluorescens for hver enkelt prøve tre gange, og gennemsnitsværdien for hver prøve beregnes.
- Brug ligning 1 til at beregne vækstraten. Den målte fluorescens (relative enheder) kan anvendes direkte som biomasseparameter i ligning 1.
Ligning 1: μ = (ln Nt - ln N0) / t
hvor μ er vækstraten (d-1),N0 er den oprindelige biomasse, Nt er biomassen på tidspunktet t, og t er længden af testperioden (d). Bemærk, at N0 og Nt skal udtrykkes i samme enhed. - Brug en statistisk software til at tilpasse en ikke-lineær regressionskurve (f.eks. en loglogi- eller Weibull-funktion) til væksthastighedsdataene for at opnå effektive koncentrationsværdier ved 10 %, 20 % og 50 % hæmning. I de supplerende oplysninger gives et eksempel på kode for montering i den statistiske software R ved hjælp af DRC-pakke11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der udføres en indledende test med et referencestof for at bestemme algestammens følsomhed. Referencestoffer, der regelmæssigt anvendes til R. subcapitata, er kaliumdichromat og 3,5-Dichlorphenol7,8. Figur 3 og tabel 2 viser et repræsentativt resultat af en algetest, herunder kurvemontering og statistiske output, når DrC-pakken i R anvendes på vækstraterne.
Figur 3: Repræsentativ koncentrations-respons-kurve for 72 timers eksponering af en kemisk forbindelse for alger (R. subcapitata). Den faste linje repræsenterer den log-logistiske pasform, og det skyggelagte område er konfidensintervallet på 95 % for pasformen. De åbne cirkler repræsenterer den beregnede vækstrate for hver replikat. Klik her for at se en større version af dette tal.
| kr. | KR. | kr. | |
| [mg/L] | [mg/L] | [mg/L] | |
| Kemisk forbindelse | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
Tabel 2: Repræsentative effektive koncentrationer for 10%, 20% og 50% hæmning af vækstraten for en kemisk forbindelse ved hjælp af alger (R. subcapitata). Værdien i parentes repræsenterer konfidensintervallet på 95 % for en loglogistisk tilpasning.
En vellykket test vil have vækstrater over 0,9 d-1 for at overholde OECD's retningslinje og 1,5 d-1 for at overholde ISO 8692-retningslinjen og skal indeholde mindst én koncentration mellem 0 % og 100 % hæmning. Lave vækstrater kan forekomme som følge af forskellige spørgsmål såsom bakteriel forurening eller inoculum ikke er i den eksponentielle vækstfase i begyndelsen af testen. Mikroskopisk undersøgelse af replikaterne bør kun vise ensartede seglformede grønne alger (R. subkapital )med dimensioner på ca. 2 μm bredde og 8 μm længde. Hvis en enkelt replikat er forurenet, kan den udelades, og analysen kan udføres uden disse data. Men hvis flere replikater er forurenet, gentages eksperimentet med uforurenet eksponentielt voksende inokulum. For at vurdere, om inokulumet var i den eksponentielle vækstfase ved testens begyndelse, skal du beregne vækstraten for kontrolrelikterne med 24 h intervaller og kun bruge det tidsinterval, hvormed kontrolelementets algevækst er eksponentiel til statistisk analyse.
For at teste opsætningens robusthed blev en toksicitetstest med to referencestoffer (K2Cr2O7 og 3,5-Dichlorophenol) og tre nanomaterialer gentaget tre gange (3,5-Dichlorophenol, BaSO4 nanopartikler (NM-220) og ZnO-nanopartikler (NM-111)) og fire gange (K2Cr2O7 og CeO2 nanopartikler (NM-212)). Resultaterne viste en variationskoefficient påEF-50-værdiernemellem 11 % og 39 %, med den laveste variationskoefficient observeret for ZnO-nanopartikler (NM-111) og den højeste variationskoefficient for CeO2-nanopartikler (NM-212) ( tabel3).
| Sammensatte | # af eksperimenter | Inter-prøve variationskoefficient for vækstrate % |
kr. (gennemsnit) mg/L |
Variationskoefficient for EC50-værdier % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3,5-Dichlorophenol | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| CeO2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| ZnO NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
Tabel 3: Resultater af en intern laboratorietoksicitetstest med R. subcapitata eksponeret for to referencestoffer og tre nanomaterialer fra FFC-lageret i 72 timer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fytoplankton omdanner solenergi og kuldioxid til organisk materiale og spiller dermed en central rolle i det akvatiske økosystem. Af denne grund, alge vækstrate hæmning test er inkluderet som en af tre obligatoriske toksicitetsprøver for vandmiljøet, der kræves til lovpligtig risikovurdering af kemikalier. Evnen til at udføre en pålidelig og reproducerbar algetoksicitetstest er nøglen i denne henseende. Testopsætninger ved hjælp af Erlenmeyerkolber introducerer en række varia evner og ulemper som beskrevet i indledningen. For at omgå dette problem er der foreslået mikrotiterplader3. Mens mikrotiterpladerne minimerer den mængde og plads, der kræves til test, er der i litteraturen blevet udtrykt bekymring med hensyn til sådanne opsætningers overensstemmelse med test validitetskriterierne itestretningslinjer 6. For eksempel, betydelige tab af semivolatile kemikalier samt cross-over til andre brønde i microtiter plader ved 37 °C i cellulære vækstmedier (DMEM GluteMAX, Opti-MEM, og Hams F12 GlutaMAX) blev for nylig demonstreret af Birch et al.12. Test af flygtige stoffer kan udføres med succes med LEVITATT-opsætningen ved hjælp af 1) lukkede hætteglas med CO2-beriget headspace9, 2) der direkte fyldes den flygtige forbindelse gennem headspace13 eller i et fyldttesthætteglas 10. Med hensyn til pladskrav giver LEVITATT en testopsætning, der udfylder hullet mellem mikrotiterplader og Erlenmeyerkolbeopsætninger, samtidig med at der stadig er fordele ved begge opsætninger, f.eks.
Variationen mellem prøverne for LEVITATT-testsystemet varierede fra 3,4 % (3,5-Dichlorophenol og ZnO NP) til 5,6 % (BaSO4 NP). Dette ligger inden for kravet om variationskoefficient for den gennemsnitlige vækst i replikatkontrolkulturer på 15 %, som fremgår af OECD 201-retningslinje7 (for LEVITATT-variationen i udtagelsesprøven blev alle eksponeringer også inkluderet).
Reproducerbarheden med hensyn tilEF-50-værdiernefor testopsætningen for referencestofferne viste en varefficient på 13% for K2Cr2O7 (n = 4) og 21% for 3,5-Dichlorophenol (n = 3). Dette kan sammenlignes med test udført med konventionelle 250 ml Erlenmeyerkolbebioassays for referencestoffet K2Cr2O7 med 16,8 %14 og 25,4 %15 variationskoefficient forEF-værdier på 50-værdier. Mikrotiterplader har vist lavere variationskoefficient for visse referencestoffer16(f.eks.214,1527 17 Der foreligger begrænsede oplysninger om reproducerbarheden af undersøgelser med nanomaterialer. Sammenligning af variationskoefficienten for ZnO ved hjælp af LEVITATT-systemet (3,4 %) med mikrotiterplader (67%18) eller Erlenmeyer kolber (13%19 og 35%20)det har mindre variation. For yderligere at teste LEVITATT-systemets robusthed er der indledt en round-robin-undersøgelse af to testmaterialer (et referencestof og et stof, der er vanskeligt at teste).
Opretholdelse af en uforurenet algekultur kan være vanskelig, hvis den ikke håndteres under sterile forhold. Eksponentiel algevækst er en vigtig forudsætning for at udføre algetestning af retningslinje. Måling af væksten på flere tidspunkter (f.eks. 24 timer, 48 timer, 72 timer) kan identificere, om eksponentiel vækst finder sted i hele testperioden. Udsving i temperatur og pH kan påvirke algevæksten; Disse parametre skal således være stabile i hele testperioden. I små mængder prøve forekommer udsving i temperatur og pH hurtigere sammenlignet med større mængder, og de praktiske problemer med at måle disse parametre bliver stadig vanskeligere med faldende testvolumen. Parametre som pH og temperatur med 4 ml testvolumen var stabile i hele en testperiode på 72 timer i LEVITATT både i et temperaturstyret rum ved 20 °C ± 2 °C og i en inkubator under lignende forhold.
Analysemetoder til kvantificering af algevækst er mange: celletælling i et hæmocytometer, skærtæller eller fluorescens af pigmentekstrakter. For vanskelige stoffer bør der tages hensyn til den mest hensigtsmæssige metode til biomasseankvantificering. For metaloxid nanopartikler, fluorescens af pigment ekstrakter har vist sig at klare sig bedst på grund af interferens af agglomerater ved optælling alger ved hæmocytometer eller coulter counter21. I modsætning hertil fandt Farkas og Booth22, at kvantificering af biomasse ved fluorescens ikke var en egnet metode til økotoksicitetstest af kulstofbaserede nanomaterialer på grund af automatiskfluorescens og absorbans af pigmenter til nanomaterialerne. For farvede stoffer kan der også være interferens mellem farven og fluorescensemissionssignalet, hvilket kræver yderligere betjenings- eller fortyndinger til et niveau, hvor denne interferens er ubetydelig.
I vejledningsdokumentet for test af toksicitet forvandmiljøet af vanskelige stoffer 2er en af anbefalingerne til test af farvede materialer at øge lysintensiteten. Tilsvarende er øget lysintensitet blevet nævnt for at omgå skyggeproblemer ved afprøvning af nanomaterialer23,24. Men sådanne ændringer er ofte forbundet med øgede temperaturer, således kræver yderligere køling eller ventilation af prøverne. I LEVITATT-opsætningen løses dette ved hjælp af LED-lys, der giver lidt varme sammenlignet med konventionelle pærer eller lysstofrør. Derudover giver valget af en LED med en tilstrækkelig høj lysintensitetsoutput og installation af en lysdæmper mulighed for at øge lysintensiteten for at teste farvede stoffer eller nanomaterialer og almindelige kemikalier uden at ændre den overordnede opsætning mellem test. Desuden giver placeringen af lyskilden under prøverne og i separate hylstinger mulighed for et ensartet og homogent lysfelt.
Afslutningsvis giver LEVITATT en kompakt platform til algetoksicitetstest af almindelige kemikalier, der er i overensstemmelse med internationale standardiserede retningslinjer. Desuden giver opsætningen en robust platform til test af vanskelige stoffer, der forstyrrer passagen af lys mod alge, f.eks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 under Forskning og Innovationsprogram under Horisont 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
