Summary
Wir zeigen Algentoxizitätstests für schwierige Stoffe (z.B. farbige Substanzen oder Nanomaterialien) anhand eines vertikal mit einer LED beleuchteten Setups.
Abstract
Ökotoxizitätsdaten sind eine Voraussetzung für die Registrierung von Chemikalien vor und nach dem Inverkehrbringen durch europäische und internationale Vorschriften (z. B. REACH). Der Algentoxizitätstest wird häufig bei der regulatorischen Risikobewertung von Chemikalien verwendet. Um eine hohe Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit zu erreichen, ist die Entwicklung standardisierter Richtlinien unerlässlich. Für Algentoxizitätstests erfordern die Richtlinien stabile und einheitliche Bedingungen für Parameter wie pH, Temperatur, Kohlendioxidgehalt und Lichtintensität. Nanomaterialien und andere so genannte schwierige Stoffe können das Licht stören und eine große Streuung der erzielten Ergebnisse zur Behinderung ihrer regulatorischen Akzeptanz verursachen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests) entwickelt. Das Setup nutzt led-Beleuchtung von unten, was eine homogene Lichtverteilung und Temperaturregelung ermöglicht und gleichzeitig die Beschattung der Proben minimiert. Das Setup optimiert das Probenvolumen für die Biomassequantifizierung und sorgt2 gleichzeitig für einen ausreichenden CO2-Zustrom, um das exponentielle Wachstum der Algen zu unterstützen. Darüber hinaus kann das Material der Testbehälter so angepasst werden, dass Adsorption und Verflüchtigung minimiert werden. Bei der Prüfung von farbigen Substanzen oder Partikelsuspensionen ermöglicht der Einsatz von LED-Leuchten auch eine Erhöhung der Lichtintensität ohne zusätzliche Wärmeerzeugung. Die kompakte Bauweise und minimale Ausstattungsanforderungen erhöhen die Möglichkeiten zur Implementierung des LEVITATT in einer Vielzahl von Laboren. WÄHREND LEVITATT den standardisierten ISO- und OECD-Richtlinien für Algentoxizitätstests entspricht, zeigte es eine geringere Variabilität zwischen Proben für zwei Referenzsubstanzen (3,5-Dicholorophenol und K2Cr2O7) und drei Nanomaterialien (ZnO, CeO2und BaSO4) im Vergleich zu Erlenmeyerkolben und Mikrotiterplatten.
Introduction
Der Algentoxizitätstest ist einer von nur drei obligatorischen Tests, die zur Generierung der Ökotoxizitätsdaten verwendet werden, die für die Registrierung von Chemikalien vor und nach dem Inverkehrbringen durch europäische und internationale Vorschriften (z. B. REACH1 und TSCA (USA)) erforderlich sind. Zu diesem Zweck wurden standardisierte Algentestrichtlinien von internationalen Organisationen (z.B. ISO und OECD) entwickelt. Diese Prüfnormen und -richtlinien schreiben ideale Prüfbedingungen in Bezug auf pH, Temperatur, Kohlendioxidgehalt und Lichtintensität vor. Die Aufrechterhaltung stabiler Testbedingungen während der Algenprüfung ist jedoch in der Praxis schwierig, und die Ergebnisse leiden unter Problemen mit der Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit einer Reihe chemischer Substanzen und Nanomaterialien (häufig als "schwierige Stoffe" bezeichnet)2. Die meisten der vorhandenen Algentoxizitätstests arbeiten mit relativ großen Volumina (100–250 ml) auf einem Orbital-Shaker in einem Inkubator. Ein solches Setup begrenzt die Anzahl der Testkonzentrationen und repliziert erreichbare und hohe Mengen an Algenkultur und Testmaterial. Darüber hinaus haben diese Setups selten ein einheitliches Lichtfeld und zuverlässige Lichtverhältnisse sind zudem in großen Kolben schwer zu bekommen, teils, da die Lichtintensität exponentiell abnimmt, je weiter sich das Licht bewegt, und teils aufgrund der Kolbengeometrie. Alternative Aufbauten umfassen Kunststoff-Mikrotiter-3-Platten mit kleinen Probenvolumina, die keine ausreichenden Probenahmemengen zur PH-Messung, zusätzliche Biomassemessungen, Pigmentextraktion oder andere Analysen, die eine destruktive Probenahme erfordern, zulassen.3 Eine besondere Herausforderung bei der Verwendung bestehender Setups für Algentoxizitätstests von Nanomaterialien und Substanzen, die farbige Suspensionen bilden, ist die Interferenz oder Blockierung des Lichts, das den Algenzellen zur Verfügung steht, oft als "Schattierung"4,5bezeichnet. Schattierungen können innerhalb von Durchstechflaschen durch das Testmaterial und/oder Wechselwirkungen zwischen dem Testmaterial und den Algenzellen auftreten, oder Schattierungen zwischen Durchstechflaschen können aufgrund ihrer Positionierung relativ zueinander und der Lichtquelle auftreten.
Die Methode basiert auf dem von Arensberg et al.6 eingeführten Testaufbau für die Kleinalgentoxizität, der Tests in Übereinstimmung mit Normen wie OECD 2017und ISO 86928ermöglicht. Das Verfahren wird weiter optimiert, um die oben genannten Einschränkungen zu beheben: 1) Einsatz der LED-Lichttechnologie, um einheitliche Lichtverhältnisse bei minimaler Wärmeerzeugung zu gewährleisten, 2) bereitstellung eines ausreichenden Probenvolumens für die chemische/biologische Analyse unter Beibehaltung konstanter pH-,CO2-Werte und 3) ermöglicht den Einsatz von vielseitigem Testbehältermaterial zur Prüfung flüchtiger Stoffe oder Substanzen mit hohem Sorptionspotenzial.
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Protocol
1. Beschreibung des LEVITATT-Setups
- Verwenden Sie 20 ml Szintillationsglasfläschchen(Abbildung 1, Einsatz 1), die ein Lichtdurchdringung ermöglichen. Alternativ können auch leichte durchlässige Kunststofffläschchen verwendet werden. Quantifizieren Sie die Lichtintensität mit einem Photometer.
- Verwenden Sie mindestens eine 4 ml-Testsuspension zu Beginn des Tests, um die Quantifizierung von Biomasse und die Charakterisierung/Quantifizierung von Nanomaterialien während und nach der Inkubation zu ermöglichen(Abbildung 1, Einsatz 2).
- Passen Sie die 20 ml Szintillationsfläschchen mit einer Kappe an(Abbildung 1, Einsatz 3), bei der ein kleines Loch (ca. 1 mm Durchmesser) gebohrt wird, um einenCO2-Austausch mit der Atmosphäre zu ermöglichen. Dieser Austausch ist entscheidend, um einen stabilen pH- undCO2-Gehalt während der Tests zu gewährleisten.
- Verwenden Sie für flüchtige Stoffe eine luftdichte Teflon-beschichtete Kappe, um eineCO2-Anreicherung des Kopfraums mit einer Spritze9 oder vollständig geschlossenen Kolben ohne Gasphase zu ermöglichen, in derCO2 in Lösung durch ein angereichertes Natriumbicarbonat (NaHCO3) Puffersystem10gehalten wird.
- Befestigen Sie die Durchstechflaschen mit Klemmen, die am Außengehäuse montiert sind(Abbildung 1, Einsatz 4).
- Verwenden Sie eine LED-Lichtquelle unterhalb der Testfläschchen(Abbildung 1, Einsatz 5), die eine gleichmäßige fluoreszierende Beleuchtung vom Typ "kühl-weiß" oder "Tageslicht" und eine Lichtintensität im Bereich von 60–120 'E'm-s-1 im photosynthetisch wirksamen Wellenlängenbereich von 400 nm bis 700 nm misst. Das Setup verwendet eine einstellbare Lichtintensität im Bereich von 5–160 'E'm-2's-1, indem ein Lichtdimmer an die Quelle anpasst. Dies ermöglicht Tests bei höheren und niedrigeren Lichtintensitäten.
- Montieren Sie das Setup auf einem Orbital-Shaker, um Proben während der gesamten Testdauer zu agitieren. Dies hält die Zellen in freier Suspension und erleichtert dieCO2-Massenübertragung von Luft zu Wasser(Abbildung 1, Einsatz 6).
- Platzieren Sie das Setup in einem temperaturgeregelten Raum oder einem Thermostatschrank, um während der gesamten Prüfung stabile Temperaturen zu erhalten(Abbildung 1, Einsatz 7).
Abbildung 1: Bild der LED-Vertikalbeleuchtungstabelle für Algentoxizitätstests (LEVITATT). 1) 20 ml Glasszintillationsfläschchen zur Inkubation, 2) 4 ml Probe zur2 Analyse, 3) Deckel mit Bohrloch für CO 2-Austausch, 4) Gehäuse für definierte Lichtverhältnisse, 5) LED-Lichtquelle in der Mitte des Gehäuses, 6) Orbitalschüttler zur Erregung während des Experiments und 7) ein thermostatischer Schrank. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Vorbereitung des Algenwachstums medium
- Das Algenwachstumsmedium ISO 8692 besteht aus vier verschiedenen Bestandslösungen. Die entsprechende Salzmenge abwiegen und in Reinstwasser nach Tabelle 1verdünnen.
| Aktienlösungen | Nährstoff | Konzentration in Lagerlösung | Konzentration in Dertestlösung |
| 1: Makronährstoffe | NH4Cl | 1,5 g/L | 15 mg/L (N: 3,9 mg/L) |
| MgCl26H2O | 1,2 g/L | 12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L) | |
| CaCl2x 2H2O | 1,8 g/L | 18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L) | |
| MgSO4bei 7H2O | 1,5 g/L | 15 mg/L (S: 1,95 mg/L) | |
| KH2PO4 | 0,16 g/L | 1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L) | |
| 2: Fe-EDTA | FeCl3x 6H2O | 64 mg/L | 64 g/L (Fe: 13 g/L) |
| Na2EDTA-2H2O | 100 mg/L | 100 g/L | |
| 3: Spurenelemente | H3BO3a | 185 mg/L | 185 g/L (B: 32 g/L) |
| MnCl2x 4H2O | 415 mg/L | 415 g/L (Mn: 115 g/L) | |
| ZnCl2 | 3 mg/L | 3 g/L (Zn: 1,4 g/L) | |
| CoCl2x 6H2O | 1,5 mg/L | 1,5 g/l (Co: 0,37 g/l) | |
| CuCl2x 2H2O | 0,01 mg/L | 0,01 g/l (Cu: 3,7 ng/L) | |
| Na2MoO4x 2H2O | 7 mg/L | 7 g/L (Mo: 2,8 g/l) | |
| 4: NaHCO3 | NaHCO3 | 50 g/L | 50 mg/L (C: 7,14 mg/L) |
Tabelle 1: Konzentrationen von Nährstoffen in Stammlösungen für Algenwachstumsmedium
HINWEIS: H3BO3 kann durch Hinzufügen von 0,1 M NaOH aufgelöst werden. EDTA sollte bei der Prüfung von Metallen entfernt werden, um eine Komplexierung mit Metallionen zu vermeiden. Sterilisieren Sie die Lagerlösungen durch Membranfiltration (mittlerer Porendurchmesser 0,2 m) oder durch Autoklavieren (120 °C, 15 min). Keine Autoklaven-Lagerlösungen 2 und 4, sondern sterilisieren Sie sie durch Membranfiltration. Bewahren Sie die Lösungen im Dunkeln bei 4 °C auf.
- Um 1 L Algenwachstumsmedium zu produzieren, 500 ml sterilisiertes Reinstwasser in einen 1 L sterilisierten Volumenkolben zu übertragen und 10 ml Stammlösung 1: Makronährstoffe, 1 ml Stammlösung 2: Fe-EDTA, 1 ml Stammlösung 3: Spurenelemente und 1 ml Stammlösung 4: NaHCO3hinzuzufügen.
- Bis zu 1 L mit sterilisiertem Reinstwasser füllen, den Kolben stoppen und gründlich schütteln, um das Algenwachstumsmedium zu homogenisieren.
- Gleichgewichten Sie die Lösung vor der Anwendung, indem Sie sie über Nacht in Kontakt mit Luft lassen oder indem Sie mit steriler, gefilterter Luft 30 min sprudeln. Nach dem Ausgleich den pH-Wert ggf. auf pH 8,1 ± 0,2 einstellen, entweder mit 1 M HCl oder 1 M NaOH.
3. Einrichten des Algentests
HINWEIS: Ein Flussdiagramm des Algentestverfahrens ist in Abbildung 2dargestellt.
Abbildung 2: Flussdiagramm des Algentestaufbaus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
- Bereiten Sie eine Lagerlösung der Testverbindung bei der gewünschten höchsten Testkonzentration im Algenwachstumsmedium vor, die gemäß Schritt 2 vorbereitet wird. Zur Herstellung von Stofflösungen/Suspensionen folgen Sie DER OECD 201 (für lösliche Verbindungen) oder DER OECD 318 (für Nanomaterialien).
- Messen Sie den pH-Wert in der Lagerlösung. Weicht er mehr als eine Einheit vom Algenwachstumsmedium ab, stellen Sie den pH-Wert auf 8 mit entweder 1 M HCl oder 1 M NaOH ein.
- Berechnen Sie das Inokulumvolumen, das erforderlich ist, um eine endgültige Zellkonzentration von 1 x 104 Zellen/ml in einer 25 ml Testlösung zu erreichen.
HINWEIS: Das Inokulum sollte aus einer Kultur der nicht kontaminierten exponentiell wachsenden Raphidocelis subcapitata stammen, die mit dem LEVITATT-Setup angebaut wird. - Berechnen Sie die Menge der Lagerlösung, die jedem 25 ml Volumetkolben hinzugefügt werden soll, um die gewünschten Testkonzentrationen zu erhalten. Der Faktor zwischen jeder Konzentration sollte 3,2 nicht überschreiten.
- Markieren Sie einen 25 ml Volumetrischen Kolben für jede gewählte Konzentration und eine zusätzliche 25 ml volumetrische Kolben markierte Kontrolle.
- Fügen Sie die Menge der Stammlösung der Testverbindung hinzu, die benötigt wird, um die gewünschten Konzentrationen zu erreichen, zum 25 ml Volumetrischen Kolben. Fügen Sie dem Steuerelement keine Lagerlösung hinzu.
- Fügen Sie das Medium zu jedem 25 ml volumetrischen Kolben hinzu, um ein Volumen von ca. 20 ml zu erreichen.
- Fügen Sie das in Schritt 3.3 berechnete Inokulumvolumen zu jedem 25 ml volumetrischen Kolben hinzu. Fügen Sie das Medium zu jedem 25 ml volumetrischen Kolben zu einem Endvolumen von 25 ml hinzu.
- Stoppen Sie die Kolben und mischen Sie gründlich, indem Sie die Kolben zwei Mal vertikal drehen.
- 0,4 ml von jedem Kolben in einzelne Schraubkappenfläschchen geben und 1,6 ml Aceton (gesättigt mit MgCO3)hinzufügen: eine Probe für jede Prüfkonzentration und die Kontrolle. Schließen Sie die Deckel fest und lagern Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur bis zu Fluoreszenzmessungen (Abschnitt 4).
- Pipetten Sie 4 ml jeder Testlösung in 20 ml Szintillationsfläschchen (3 Replikationen pro Konzentration und 5 Replikationen für die Kontrolle). Schraubendeckel auf den Szintillationsfläschchen. Denken Sie daran, dass die Deckel ein Gebohrloch (ca. 1 mm Durchmesser) haben müssen, um einenCO2-Austausch zu ermöglichen.
- Nach 24 h, 48 h und 72 h, Pipetten 0,4 ml von jeder Durchstechflasche in Schraubkappenfläschchen und 1,6 ml Aceton hinzufügen (gesättigt mit MgCO3). Schließen Sie die Deckel fest und lagern Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur bis zu Fluoreszenzmessungen (Abschnitt 4).
- Nachdem die letzte Probe bei 72 h entnommen wurde, die drei Replikationen für eine bestimmte Konzentration vorsichtig in einer Durchstechflasche bündeln und den pH-Wert messen. Wiederholen Sie dies für alle Konzentrationen und die Steuerung. Der pH-Wert sollte für eine der gemessenen Proben nicht mehr als 1,5 Einheiten vom ursprünglichen pH-Wert abweichen.
- Entleeren Sie die restlichen Flüssigkeiten gemäß Ihren institutionellen Regeln und Vorschriften in einen Abfallbehälter.
4. Analyse von Algenproben
- Verwenden Sie ein Fluoreszenzspektrophotometer, um die Algenbiomasse zu messen (hier ausgedrückt als Chlorophyll A). Die Spitzenemission für Chlorophyll A beträgt 420 nm für die Anregungswellenlänge und 671 nm für die Emissionswellenlänge.
- Messen Sie die Fluoreszenz jeder einzelnen Probe dreimal und berechnen Sie den Durchschnittswert für jede Probe.
- Verwenden Sie Gleichung 1, um die Wachstumsrate zu berechnen. Die gemessene Fluoreszenz (relative Einheiten) kann direkt als Biomasseparameter in Gleichung 1 verwendet werden.
Gleichung 1: μ = (ln Nt – ln N0) / t
wobei μ die Wachstumsrate (d-1), N0 die ursprüngliche Biomasse ist, Nt die Biomasse zum Zeitpunkt t und t die Länge des Testzeitraums (d). Hinweis: N0 und Nt sollten in derselben Einheit ausgedrückt werden. - Verwenden Sie eine statistische Software, um eine nichtlineare Regressionskurve (z. B. eine Log-Logistik- oder Weibull-Funktion) an die Wachstumsratendaten anzupassen, um effektive Konzentrationswerte bei 10 %, 20 % und 50 % Hemmung zu erhalten. In den Zusatzinformationen ist ein Beispiel für Code für die Anpassung an die statistische Software R mit dem DRK-Paket11 gegeben.
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Representative Results
Ein erster Test mit einer Referenzsubstanz wird durchgeführt, um die Empfindlichkeit des Algenstamms zu bestimmen. Referenzsubstanzen, die regelmäßig für R. subcapitata verwendet werden, sind Kaliumdichromat und 3,5-Dichlorphenol7,8. Abbildung 3 und Tabelle 2 zeigen ein repräsentatives Ergebnis eines Algentests einschließlich Kurvenanpassung und statistischer Ergebnisse, wenn das DRK-Paket in R auf die Wachstumsraten angewendet wird.
Abbildung 3: Repräsentative Konzentrations-Wirkungs-Kurve für 72 h Exposition einer chemischen Verbindung gegenüber Algen (R. subcapitata). Die durchgezogene Linie stellt die loglogistische Anpassung dar, und der schattierte Bereich ist das 95%-Konfidenzintervall für die Anpassung. Die offenen Kreise stellen die berechnete Wachstumsrate für jede Replikation dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| EC10 | EC20 | EC50 | |
| [mg/L] | [mg/L] | [mg/L] | |
| Chemische Verbindung | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
Tabelle 2: Repräsentative effektive Konzentrationen für 10%, 20% und 50% Hemmung der Wachstumsrate für eine chemische Verbindung mit Algen (R. subcapitata). Der Wert in Klammern stellt das 95%-Konfidenzintervall eines loglogistischen Fittings dar.
Ein erfolgreicher Test wird Wachstumsraten von mehr als 0,9 d-1 aufweisen, um der OECD-Richtlinie zu entsprechen, und 1,5 d-1, um der ISO 8692-Richtlinie zu entsprechen, und sollte mindestens eine Konzentration zwischen 0 % und 100 % Hemmung enthalten. Niedrige Wachstumsraten können als Folge verschiedener Probleme wie bakterielle Kontamination oder Inokulum auftreten, die sich zu Beginn des Tests nicht in der exponentiellen Wachstumsphase befinden. Die mikroskopische Untersuchung der Repliken sollte nur einheitliche Sichel-förmige Grünalgen (R. subcapitata) mit Abmessungen von ca. 2 m Breite und 8 m Länge aufweisen. Wenn eine einzelne Replikation kontaminiert ist, kann sie weggelassen werden und die Analyse kann ohne diese Daten durchgeführt werden. Wenn jedoch mehrere Replikationen kontaminiert sind, wiederholen Sie das Experiment mit nicht kontaminierten exponentiell wachsenden Inokulum. Um zu beurteilen, ob sich das Inokulum zu Beginn des Tests in der exponentiellen Wachstumsphase befand, berechnen Sie die Wachstumsrate der Kontrollreplikation in 24-Stunden-Intervallen und verwenden Sie nur das Zeitintervall, in dem das Algenwachstum der Kontrolle für die statistische Analyse exponentiell ist.
Um die Robustheit des Setups zu testen, wurde dreimal ein Toxizitätstest mit zwei Referenzsubstanzen (K2Cr2O7 und 3,5-Dichlorphenol) und drei Nanomaterialien (3,5-Dichlorphenol, BaSO4-Nanopartikel (NM-220) und ZnO-Nanopartikel (NM-111)) und viermal (K2Cr2O7 und CeO2 Nanopartikel (NM-212)) wiederholt. Die Ergebnisse zeigten einen Variationskoeffizienten derEG-50-Wertezwischen 11 % und 39 %, wobei der niedrigste Variationskoeffizient für ZnO-Nanopartikel (NM-111) und der höchste Variationskoeffizient für CeO2-Nanopartikel (NM-212)(Tabelle 3)beobachtet wurden.
| Verbindung | Anzahl der Experimente | Interstichprobenkoeffizient für Wachstumsrate % |
EC50 (Durchschnitt) mg/L |
Variationskoeffizient für EC50-Werte % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3,5-Dichlorphenol | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| CeO2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| ZnO NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
Tabelle 3: Ergebnisse eines internen Labortoxizitätstests mit R. Subcapitata, die für 72 h zwei Referenzsubstanzen und drei Nanomaterialien aus dem GFS-Lager ausgesetzt sind
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Discussion
Phytoplankton wandelt Sonnenenergie und Kohlendioxid in organische Materie um und spielt damit eine zentrale Rolle im aquatischen Ökosystem. Aus diesem Grund werden Algenwachstumshemmungstests als einer von drei obligatorischen aquatischen Toxizitätstests aufgenommen, die für die regulatorische Risikobewertung von Chemikalien erforderlich sind. Die Fähigkeit, einen zuverlässigen und reproduzierbaren Algentoxizitätstest durchzuführen, ist in dieser Hinsicht von entscheidender Bedeutung. Test-Setups mit Erlenmeyer-Kolben führen zu einer Reihe von Variabilitäten und Unannehmlichkeiten, wie in der Einleitung beschrieben. Um dieses Problem zu umgehen, wurden Mikrotiterplatten vorgeschlagen3. Während die Mikrotiterplatten das Volumen und den Platzbedarf für Tests minimieren, wurden in der Literatur Bedenken hinsichtlich der Übereinstimmung solcher Setups mit den Prüfgültigkeitskriterien der Prüfrichtlinien6geäußert. So wurde beispielsweise kürzlich ein signifikanter Verlust von semiflüchtigen Chemikalien sowie cross-over zu anderen Brunnen in Mikrotiterplatten bei 37 °C in zellulären Wachstumsmedien (DMEM GluteMAX, Opti-MEM und Hams F12 GlutaMAX) von Birch et al.12nachgewiesen. Die Prüfung flüchtiger Substanzen kann mit dem LEVITATT-Setup erfolgreich mit 1) geschlossenen Durchstechflaschen mitCO2-angereichertem Kopfraum9, 2) direkt durchgeführt werden, wobei die flüchtige Verbindung durch den Kopfraum13 oder in einer gefüllten Testdurchstechs10dosiert wird. In Bezug auf den Platzbedarf bietet LEVITATT ein Test-Setup, das die Lücke zwischen Mikrotiterplatten und Erlenmeyerkolben-Setups füllt und gleichzeitig Vorteile aus beiden Setups bietet, z. B. die Aufrechterhaltung einer präzisen und kompakten Testumgebung und ein ausreichendes Testvolumen für zerstörerische Probennahme (z. B. für die Charakterisierung von Nanomaterialien während des Tests).
Die Streuung zwischen Proben für das LEVITATT-Testsystem reichte von 3,4% (3,5-Dichlorphenol und ZnO NP) bis 5,6% (BaSO4 NP). Dies liegt im Rahmen der Anforderung des Variationskoeffizienten des durchschnittlichen Wachstums in Replizien-Kontrollkulturen von 15 %, die in der OECD-Leitlinie7 201 angegeben sind (für die LEVITATT-Interstichprobenvariabilität wurden auch alle Expositionen einbezogen).
Die Reproduzierbarkeit in Bezug auf EC50-Wertedes Testaufbaus für die Referenzsubstanzen ergab einen Varianzkoeffizienten von 13 % für K2Cr2O7 (n = 4) und 21 % für 3,5-Dichlorphenol (n = 3). Dies ist vergleichbar mit Tests, die mit herkömmlichen 250 ml Erlenmeyerkolbenbioassays für den Referenzstoff K2Cr2O7 durchgeführt wurden und 16,8 %14 und 25,4 %15 Variationskoeffizienten fürEG-50-Werteaufweisen. Mikrotiterplatten haben für einige Referenzsubstanzen einen niedrigeren Variationskoeffizienten gezeigt (z. B. K2Cr2O7 (9%14,15), während höhere Variationskoeffizienten für Phenol (34,9%16) und Dichlorphenol (38%17) beobachtet wurden. Über die Reproduzierbarkeit von Studien mit Nanomaterialien liegen nur begrenzte Informationen vor. Vergleich des Variationskoeffizienten zwischen Stichproben für ZnO-NPs mit dem LEVITATT-System (3,4 %) mit Mikrotiterplatten (67%18) oder Erlenmeyerkolben (13%19 und 35%20) hat es weniger Variation. Um die Robustheit des LEVITATT-Systems weiter zu testen, wurde eine Roundrobin-Studie von zwei Prüfmaterialien (eine Referenzsubstanz und eine schwer zu prüfende Substanz) eingeleitet.
Die Aufrechterhaltung einer unbelasteten Algenkultur kann schwierig sein, wenn sie nicht unter sterilen Bedingungen behandelt wird. Exponentielles Algenwachstum ist eine wichtige Voraussetzung für die Durchführung von Leitalgentests. Die Messung des Wachstums an mehreren Zeitpunkten (z. B. 24 h, 48 h, 72 h) kann feststellen, ob während des gesamten Testzeitraums ein exponentielles Wachstum auftritt. Temperatur- und pH-Schwankungen können das Algenwachstum beeinflussen; daher müssen diese Parameter während des gesamten Testzeitraums stabil sein. In kleinen Probenmengen treten Temperatur- und pH-Schwankungen im Vergleich zu größeren Mengen schneller auf und die praktischen Probleme bei der Messung dieser Parameter werden mit abnehmendem Prüfvolumen immer schwieriger. Parameter wie pH-Wert und Temperatur bei 4 ml Prüfvolumen waren während einer 72-Stunden-Prüfzeit im LEVITATT sowohl in einem temperaturgeregelten Raum bei 20 °C ± 2 °C als auch in einem Inkubator unter ähnlichen Bedingungen stabil.
Analytische Methoden zur Quantifizierung des Algenwachstums sind vielfältig: Zellzählung in einem Hämozytometer, Coulterzähler oder Fluoreszenz von Pigmentextrakten. Bei schwierigen Stoffen sollten Überlegungen hinsichtlich der am besten geeigneten Methode für die Quantifizierung von Biomasse angestellt werden. Bei Metalloxid-Nanopartikeln ist die Fluoreszenz von Pigmentextrakten aufgrund von Interferenzen von Agglomeraten beim Zählen von Algen durch Hämozytometer oder Coulterzähler21am besten abschneidet. Im Gegensatz dazu stellten Farkas und Stand22 fest, dass die Quantifizierung von Biomasse durch Fluoreszenz aufgrund der Autofluoreszenz und Absorption von Pigmenten an die Nanomaterialien keine geeignete Methode zur Ökotoxizitätsprüfung von kohlenstoffbasierten Nanomaterialien war. Bei farbigen Stoffen kann es auch zu Störungen der Farbe mit dem Fluoreszenz-Emissionssignal kommen, so dass zusätzliche Kontrollen oder Verdünnung auf ein Niveau erforderlich sind, in dem diese Interferenz vernachlässigbar ist.
Im Leitfaden für die Prüfung der aquatischen Toxizität von schwierigen Stoffen2ist eine der Empfehlungen für die Prüfung farbiger Materialien die Erhöhung der Lichtintensität. In ähnlicher Weise wurde eine erhöhte Lichtintensität erwähnt, um Schattierungsprobleme beim Testen von Nanomaterialien23,24zu umgehen. Solche Modifikationen sind jedoch häufig mit erhöhten Temperaturen verbunden, so dass eine zusätzliche Kühlung oder Belüftung der Proben erforderlich ist. Im LEVITATT-Setup wird dies mit LED-Licht gelöst, das im Vergleich zu herkömmlichen Glühbirnen oder Leuchtstoffröhren wenig Wärme erzeugt. Darüber hinaus ermöglichen die Wahl einer LED mit einer ausreichend hohen Lichtintensitätsleistung und die Installation eines Dimmers eine Erhöhung der Lichtintensität zum Testen farbiger Substanzen oder Nanomaterialien und regulärer Chemikalien, ohne das Gesamtbild zwischen den Tests zu verändern. Darüber hinaus ermöglicht die Platzierung der Lichtquelle unter den Proben und in separaten Gehäusen ein konsistentes und homogenes Lichtfeld.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das LEVITATT eine kompakte Plattform für Dieontoxizitätsprüfungen regelmäßiger Chemikalien bietet, die internationalen standardisierten Richtlinien entsprechen. Darüber hinaus bietet das Setup eine robuste Plattform für die Prüfung schwieriger Substanzen, die den Lichtdurchgang in Richtung des Algen, z.B. Nanomaterialien, stören.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant Agreement 760813 im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizont 2020 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
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