Summary
אנו מדגימים בדיקות רעילות אצות לחומרים קשים (למשל, חומרים צבעוניים או ננו חומרים) באמצעות התקנה מוארת אנכית עם LED.
Abstract
נתוני Ecotoxicity הם דרישה לרישום לפני ופוסט-שוק של כימיקלים על ידי תקנות אירופאיות ובינלאומיות (למשל, REACH). בדיקת רעילות אצות משמשת לעתים קרובות בהערכת סיכון רגולטורי של כימיקלים. על מנת להשיג אמינות גבוהה ושחזור הפיתוח של קווים מנחים מתוקנים הוא חיוני. לבדיקת רעילות אצות, הקווים המנחים דורשים תנאים יציבים ואחידים של פרמטרים כגון pH, טמפרטורה, רמות פחמן דו חמצני ועוצמת אור. ננו-חומרים וחומרים קשים אחרים לכאורה יכולים להפריע לאור ולגרום לשינוי גדול בתוצאות שהושגו הפוגעות בקבלה הרגולטורית שלהם. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, פיתחנו LEVITATT (LED אנכי תאורה טבלה עבור בדיקות רעילות אצות). ההתקנה משתמשת בתאורת LED מלמטה ומאפשרת התפלגות אור הומוגני ובקרה בטמפרטורה, תוך מזעור הצללה תוך-מדגם. ההתקנה ממטבת את נפח הדגימה לכמת ביומסה ומבטיחה בו זמנית זרימה מספקת של CO2 כדי לתמוך בצמיחה אקספוננציאלית של אצות. בנוסף, ניתן להתאים את החומר של מיכלי הבדיקה כדי למזער את ההסחתה וההתבוללות. בעת בדיקת חומרים צבעוניים או מתלי חלקיקים, השימוש בנורות LED מאפשר גם להגדיל את עוצמת האור ללא ייצור חום נוסף. העיצוב הקומפקטי ודרישות הציוד המינימליות מגדילים את האפשרויות ליישום ה-LEVITATT במגוון רחב של מעבדות. בעוד תואם עם הנחיות ISO ו-OECD מתוקננת לבדיקת רעילות אצות, LEVITATT גם הראה שונות בין-מדגם נמוך יותר עבור שני חומרים הפניה (3,5-Dicholorophenol ו K2Cr2O7) ושלושהננו חומרים (ZnO, CeO2,ו BaSO4)בהשוואה למבחנות Erlenmeyer וצלחת microtiter.
Introduction
בדיקת הרעילות של אצות היא אחת משלוש בדיקות חובה בלבד המשמשות ליצירת נתוני רעילות אקולוגית הנדרשים לרישום לפני ופוסט-שוק של כימיקלים על ידי תקנות אירופאיות ובינלאומיות (למשל, REACH1 ו-TSCA (ארה"ב).). לשם כך פותחו הנחיות למבחן אצות מתוקנות על ידי ארגונים בינלאומיים (למשל, ISO ו-OECD). תקני בדיקה וקווים מנחים אלה רושמים תנאי בדיקה אידיאליים במונחים של pH, טמפרטורה, רמות פחמן דו חמצני ועוצמת אור. עם זאת, שמירה על תנאי בדיקה יציבים במהלך בדיקות אצות היא למעשה קשה והתוצאות סובלות מבעיות עם רבייה ואמינות עבור מגוון של חומרים כימיים וננו חומרים (המכונה לעתים קרובות "חומרים קשים")2. רוב התקנות הקיימות לבדיקת רעילות אצות פועלות בכמויות גדולות יחסית (100-250 מ"ל) הממוקמות על שייקר מסלולי בתוך אינקובטור. הגדרה כזו מגבילה את מספר ריכוזי הבדיקה ומשכפלת כמויות ברות השגה וגביות של תרבות אצות וחומר בדיקה. בנוסף, הגדרות אלה לעתים נדירות יש שדה אור אחיד תנאי תאורה אמינים קשה יותר להשיג במבחנות גדולות, בין השאר כמו עוצמת האור פוחתת אקספוננציאלית ככל שהאור נע ובחלקו בשל גיאומטריית הבקבוקון. הגדרות חלופיות כוללות מיקרוטיטרפלסטיק 3 צלחות המכילות נפחי מדגם קטנים שלא מאפשרים נפחי דגימה נאותים כדי למדוד pH, מדידות ביומסה נוספות, חילוץ פיגמנטים או ניתוחים אחרים הדורשים דגימה הרסנית. אחד האתגרים המסוימים באמצעות הגדרות קיימות לבדיקת רעילות אצות של ננו חומרים וחומרים יוצרים השעיות צבעוניות הוא הפרעה או חסימה של האור הזמין לתאי אצות, המכונה לעתים קרובות"הצללה" 4,,5. הצללה עלולה להתרחש בתוך בקבוקונים על ידי חומר הבדיקה ו/או אינטראקציות בין חומר הבדיקה לבין תאי הצלחות, או הצללה יכולה להתרחש בין בקבוקונים, בשל מיקומם ביחס זה לזה ומקור האור.
השיטה מבוססת על התקנה של בדיקת רעילות אצות בקנה מידה קטן שהציגה ארנסברג ואח'6, המאפשרת בדיקה בהתאם לתקנים כגון OECD 2017 ו-ISO 869278. השיטה ממוטבת עוד יותר כדי לטפל במגבלות שצוינו לעיל על ידי: 1) ניצול טכנולוגיית תאורת LED כדי להבטיח תנאי תאורה אחידים עם ייצור חום מינימלי, 2) מתן נפח מדגם הולם לניתוח כימי/ביולוגי תוך שמירה על רמת pH קבועה, CO2 ו-3) המאפשר שימוש בחומר מיכל בדיקה רב-תכליתי לבדיקת חומרים או חומרים נדיפים בעלי פוטנציאל פתרון גבוה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תיאור ההתקנה של LEVITATT
- השתמש בקבוקונים זכוכית מבריק 20 מ"ל(איור 1,הכנס 1) המאפשר חדירה קלה. לחלופין, ניתן להשתמש בבקבוקונים מפלסטיק הניתנים להעברה קלה. מכמת את עוצמת האור באמצעות מד פוטומטר.
- השתמש לפחות 4 מ"ל מתלה מבחן בתחילת הבדיקה כדי לאפשר כימות של ביומסה ואפיון / כימות של ננו חומרים במהלך ואחרי דגירה(איור 1,להוסיף 2).
- להתאים את בקבוקונים מבריק 20 מ"ל עםכובע (איור 1,להוסיף 3) שבו חור קטן נקדח (כ 1 מ"מ קוטר) כדי לאפשר חילופי CO2 עם האווירה. החלפה זו חיונית כדי להבטיח רמות pH ו-CO2 יציבות במהלך הבדיקה.
- עבור חומרים נדיפים, השתמש בכובע טפלון מצופה אוויר כדי לאפשר CO2 העשרה של headspace באמצעות מזרק9 או מבחנות סגורות לחלוטין ללא שלב גז שבו CO 2 נשמרבפתרון על ידי מערכת מאגר נתרן מועשר (NaHCO3)מאגר 10.
- הדקו את הבקבוקונים עם מהדקים המותקן על המעטפת החיצונית(איור 1,הכנס 4).
- השתמש במקור אור LED הממוקם מתחת בקבוקוניהבדיקה (איור 1, הכנס 5) מתן תאורת פלורסנט אחידה של "cool-white" או "אור יום" סוג ועוצמת אור בטווח 60-120 μE∙m-2∙-1 נמדד בטווח אורך הגל פוטוסינתטי יעיל של 400 טנ"מ עד 700 טנ"מ. ההתקנה משתמשת בעוצמת אור מתכווננת בטווח של 5-160 μE∙m-2∙-1 על-ידי התאמת עמעם אור למקור. הדבר מאפשר בדיקה בעוצמות אור גבוהות ונשומות יותר.
- הר את ההתקנה על שייקר מסלולי כדי להרגיז דגימות לאורך כל הבדיקה. זה שומר את התאים בהשעיה חופשית ומקל עלCO 2 העברה המונית מאווירלמים (איור 1,הכנס 6).
- מניחים את ההתקנה בחדר מבוקר טמפרטורה או ארון תרמוסטי כדי לשמור על טמפרטורות יציבות לאורך כל הבדיקות(איור 1, הכנס 7).
איור 1: תמונה של טבלת תאורה אנכית LED עבור בדיקות רעילות אצות (LEVITATT). 1) 20 מ"ל זכוכית scintillation בקבוקונים עבור דגירה, 2) 4 מדגם מ"ל לניתוח, 3) מכסה עם חור קדוח עבור חילופי CO2, 4) מעטפת עבור תנאי אור מוגדרים, 5) מקור אור LED הממוקם במרכז המעטפת, 6) שייקר מסלולית לתסיסה במהלך הניסוי, ו 7) ארון תרמוסטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
2. הכנת אצות בינוניות
- מדד ISO 8692 אצות החברה מורכב מארבעה פתרונות מניות שונים. שקלו את הכמות המתאימה של מלחים ודיללו במים אולטרה-תכליתיים לפי שולחן 1.
| פתרונות מלאי | מזין | ריכוז בתמיסת מלאי | ריכוז בתמיסת בדיקה |
| 1: מקרונו-ונים | NH4Cl | 1.5 גר'/ל | 15 מ"ג/L (N: 3.9 מ"ג/ל') |
| MgCl2∙6H2O | 1.2 גר'/ל | 12 מ"ג/L (מ"ג: 2.9 מ"ג/L) | |
| CaCl2∙2H2O | 1.8 גר'/ל | 18 מ"ג/L (Ca: 4.9 מ"ג/L) | |
| MgSO4∙7H2O | 1.5 גר'/ל | 15 מ"ג/ל') (S: 1.95 מ"ג/ל') | |
| KH2PO4 | 0.16 ג'/ל' | 1.6 מ"ג/ל' (P: 0,36 מ"ג/L) | |
| 2: פה-אדטה | פ"ק 3∙6H2O | 64 מ"ג/L | 64 μg / L (פה: 13 μg / L) |
| Na2EDTA∙2H2O | 100 מ"ג/ל' | 100 μg/ L | |
| 3: רכיבי מעקב | H3BO3a | 185 מ"ג/L | 185 μg/L (ב: 32 μg/L) |
| MnCl2∙4H2O | 415 מ"ג/ל' | 415 μg/L (Mn: 115 μg/L) | |
| ת.ז.2 | 3 מ"ג/L | 3 μg/L (Zn: 1.4 μg/L) | |
| CoCl2∙6H2O | 1.5 מ"ג/L | 1.5 μg/L (Co: 0.37 μg/L) | |
| CuCl2∙2H2O | 0.01 מ"ג/L | 0.01 μg/L (Cu: 3.7 ng/L) | |
| Na2MoO4∙2H2O | 7 מ"ג/ל' | 7 μg /L (מו: 2.8 μg / L) | |
| 4: NaHCO3 | 3(000)3 | 50 גר'/ל | 50 מ"ג/ל' (C: 7.14 מ"ג/L) |
טבלה 1: ריכוזים של חומרים מזינים בפתרונות מלאי עבור אצות צמיחה בינונית
הערה:ניתן לפרקאת H 3 BO3 על-ידי הוספת 0.1 M NaOH. EDTA יש להסיר בעת בדיקת מתכות, כדי למנוע עור עם יונים מתכת. לחטא את פתרונות המניות על ידי סינון קרום (אומר נקבוביות קוטר 0.2 μm) או על ידי autoclaving (120 ° C, 15 דקות). אין לעשות פתרונות מלאי autoclave 2 ו 4, אבל לחטא אותם על ידי סינון קרום. אחסן את הפתרונות בחושך ב- 4 °C.
- כדי לייצר 1 L של אצות צמיחה בינונית, להעביר 500 מ"ל מים אולטרה-אפורים מחטאים לתוך בקבוקון נפחי נפח 1 L ולהוסיף 10 מ"ל של פתרון מניות 1: Macronutrients, 1 מ"ל של פתרון מניות 2: Fe-EDTA, 1 מ"ל של פתרון מניות 3: רכיבי עקבות, ו 1 מ"ל של פתרון מניות 4: NaHCO3.
- מלא עד 1 ל' במים אולטרה-תכליתיים מחטאים, תעצור את הבקבוקון ונענע ביסודיות כדי להפוך את מדיום גידול האצות להומוגני.
- לערבב את הפתרון לפני השימוש על ידי השארתו לילה במגע עם האוויר או על ידי מבעבע עם סטרילי, אוויר מסונן במשך 30 דקות. לאחר שיווי המשקל, להתאים את ה-pH, במידת הצורך, ל- pH 8.1 ± 0.2, עם 1 M HCl או 1 M NaOH.
3. הגדרת מבחן אצות
הערה: דיאגרמת זרימה של הליך בדיקת אצות מוצגת באות 2.
איור 2: דיאגרמת זרימה של כיוונון בדיקת אצות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
- הכינו פתרון מניות של תרכובת הבדיקה בריכוז הבדיקה הגבוה ביותר הרצוי במדיום גידול אצות המוכן על פי שלב 2. להכנת פתרונות/השעיות למניות, עקבו אחר ה-OECD 201 (לתרכובות מסיסות) או OECD 318 (לננו-חומרים).
- למדוד את ה-pH בפתרון המניות. אם הוא סוטה יותר מיחידה אחת ממדיום צמיחת אצות, להתאים את ה-pH ל 8 עם או 1 M HCl או 1 M NaOH.
- חשב את אמצעי האחסון inoculum הדרוש כדי להגיע לריכוז תא סופי של 1 x 104 תאים /מ"ל בפתרון בדיקה 25 מ"ל.
הערה: האינוקולום צריך לבוא מתרבות של תת-קפיטטה הגדלה באופן אקספוננציאלי של Raphidocelis שגדלה באופן אקספוננציאלי באמצעות ההתקנה של LEVITATT. - לחשב את כמות פתרון המניות כדי להוסיף לכל בקבוקון נפח 25 מ"ל כדי להשיג את ריכוזי הבדיקה הרצויים. הגורם בין כל ריכוז לא יעלה על 3.2.
- סמן בקבוקון נפח אחד 25 מ"ל עבור כל ריכוז שנבחר ותוביל נוסף של 25 מ"ל מנוקב נפח מסומן בקרה.
- הוסף את כמות תמיסת המניות של תרכובת הבדיקה הדרושה כדי להגיע לריכוזים הרצויים לבקבוקון נפח 25 מ"ל. אל תוסיף פתרון מניות לפקד.
- הוסף את המדיום לכל בקבוקון נפח 25 מ"ל כדי להגיע לנפח של כ-20 מ"ל.
- הוסף את נפח inoculum מחושב בשלב 3.3 לכל בקבוקון נפח 25 מ"ל. הוסף את המדיום לכל בקבוקון נפח 25 מ"ל לנפח כולל סופי של 25 מ"ל.
- תעצור את המבחנות ומערבבים ביסודיות על ידי הפיכת הבקבוקונים פעמיים אנכית.
- להעביר 0.4 מ"ל מכל בקבוקון לתוך בקבוקונים כובע בורג בודד ולהוסיף 1.6 מ"ל של אצטון (רווי MgCO3): מדגםאחד עבור כל ריכוז בדיקה ואת הבקרה. סגור את המכסים בחוזקה ואחסן בחושך בטמפרטורת החדר עד מדידות פלואורסצסצנציה (סעיף 4).
- Pipet 4 מ"ל של כל פתרון בדיקה לתוך בקבוקונים מבריקים 20 מ"ל (3 שכפולים לכל ריכוז ו 5 שכפולים עבור הבקרה). לעזאזל עם המכסים על בקבוקונים מבריקים. זכור כי המכסים חייב להיות חור קדוח (כ 1 מ"מ קוטר) כדי לאפשר חילופי CO2.
- לאחר 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות, צינור 0.4 מ"ל מכל בקבוקון לתוך בקבוקונים של מכסה בורג ולהוסיף 1.6 מ"ל של אצטון (רווי ב-MgCO3). סגור את המכסים בחוזקה ואחסן בחושך בטמפרטורת החדר עד מדידות פלואורסצסצנציה (סעיף 4).
- לאחר הדגימה האחרונה נלקח ב 72 שעות, בעדינות מאגר שלושת משכפלים עבור ריכוז נתון במבחנה אחת למדוד את ה-pH. חזור על כל הריכוזים והפקד. ה-pH לא צריך לסטות יותר מ- 1.5 יחידות מה- pH הראשוני עבור כל הדגימות שנמדדו.
- שחררו את הנוזלים הנותרים לתוך מיכל פסולת תוך כך שהם מחוקים ותקנות מוסדיים.
4. ניתוח דגימות בדיקת אצות
- השתמש בספקטרופוטומטר פלואורסצנס כדי למדוד את ביומסה אצות (כאן מבוטא כמו כלורופיל A). פליטת השיא של כלורופיל A היא 420 00 00 000 00:00-10:00-00:00,000 --& 00:00:00,000 --& 00:00:00,000 --& 00:00:00,000 --& 00:00
- מדוד את הפלואורסנסנס של כל מדגם בודד שלוש פעמים וחשב את הערך הממוצע עבור כל מדגם.
- השתמש במשוואה 1 כדי לחשב את קצב הצמיחה. ניתן להשתמש בפלואורסנצנס (יחידות יחסיות) הנמדדות ישירות כפרמטר ביומסה במשוואה 1.
משוואה 1: μ = (ב Nt – ב N0) / t
כאשר μ הוא קצב הצמיחה (d-1), N0 הוא הביומסה הראשונית, Nt הוא הביומסה בזמן t, ו t הוא אורך תקופת הבדיקה (ד). הערה, N0 ו- Nt צריכים לבוא לידי ביטוי באותה יחידה. - השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי להתאים עקומת רגרסיה לא ליניארית (לדוגמה, פונקציית לוג-לוגיסטי או Weibull) לנתוני קצב הצמיחה כדי להשיג ערכי ריכוז אפקטיביים ב- 10%, 20% ו- 50% עיכוב. במידע המשלים ניתנת דוגמה של קוד להשתלבות בתוכנה הסטטיסטית R באמצעות חבילת DRC11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדיקה ראשונית עם חומר התייחסות מתבצעת כדי לקבוע את הרגישות של זן אצות. חומרים עזר המשמשים באופן קבוע עבור R. תת-קפיטטה הם אשלגן dichromate ו 3,5-Dichlorphenol7,,8. איור 3 וטבלה 2 מציגים תוצאה מייצגת של בדיקת אצות, כולל התאמת עקומה ויציאות סטטיסטיות כאשר חבילת DRC ב- R מוחלת על שיעורי הצמיחה.
איור 3: עקומת תגובת ריכוז מייצגת לחשיפה של 72 ש"ח של תרכובת כימית לאץ (R. subcapitata). הקו המוצק מייצג את התאמת יומן הרישום ואת האזור המוצל הוא מרווח הביטחון של 95% עבור התאים. המעגלים הפתוחים מייצגים את קצב הצמיחה המחושב עבור כל שכפל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
| 10 דולר לאקז'ו | 1000000000 | אק50 (100) | |
| [מ"ג / L] | [מ"ג / L] | [מ"ג / L] | |
| תרכובת כימית | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
טבלה 2: ריכוזים אפקטיביים מייצגים עבור 10%, 20%, ו 50% עיכוב של קצב הצמיחה עבור תרכובת כימית באמצעות אצות (R. תת-capitata). הערך בסוגריים מרובעים מייצג את מרווח הביטחון של 95% של התאמה לוגיסטית.
מבחן מוצלח יהיה שיעורי צמיחה מעל 0.9 d-1 כדי לציית להנחיות ה-OECD ו 1.5 d-1 כדי לציית להנחיות ISO 8692 וצריך להכיל לפחות ריכוז אחד בין 0% ו 100% עיכוב. שיעורי צמיחה נמוכים עלולים להתרחש כתוצאה מנושאים שונים כגון זיהום חיידקי או אינוקולום לא להיות בשלב הצמיחה אקספוננציאלי בתחילת הבדיקה. חקירה מיקרוסקופית של השכפולים צריכה להראות רק אצות ירוקות אחידות בצורת מגל (R. subcapitata) עם ממדים של כ 2 μm רוחב ו 8 μm אורך. אם משוכפל יחיד מזוהם, ניתן להשמיט אותו ואת הניתוח יכול להתבצע ללא נתונים אלה. עם זאת, אם שכפולים מרובים מזוהמים, חזור על הניסוי עם אינוקולום גדל באופן אקספוננציאלי ללא זיהום. כדי להעריך אם האינוקולום היה בשלב הצמיחה המעריכי בתחילת הבדיקה, חשב את קצב הצמיחה של הפקד משכפל במרווחי זמן של 24 שעות והשתמש רק במרווח הזמן שבו הצמיחה אצות של הפקד הוא מעריכי לניתוח סטטיסטי.
כדי לבדוק את החוסן של ההתקנה, בדיקת רעילות באמצעות שני חומרים הפניה (K2Cr2O7 ו 3,5-Dichlorophenol) ושלושה ננו חומרים חזר שלוש פעמים (3,5-Dichlorophenol, BaSO4 חלקיקים (NM-220), וחלקיקים ZnO (NM-111)) וארבע פעמים (K2Cr2O7 ו CeO2 חלקיקים (NM-212)). התוצאות הראו מקדם של וריאציה של EC50 -ערכיםבין 11% ו 39%, עם מקדם הנמוך ביותר של וריאציה שנצפתה עבור חלקיקי ZnO (NM-111) ואת המקדם הגבוה ביותר של וריאציה עבור CeO2 חלקיקים (NM-212) (טבלה 3).
| מורכבים | של ניסויים | מקדם בין-מדגם של וריאציה עבור קצב צמיחה % |
אק50 (100) (ממוצע) אני לא יודע. מ"ג/L |
מקדם וריאציה עבור ערכי EC50 % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3,5-דיכלורונול | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| Ceo2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| זנו NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
טבלה 3: תוצאות של בדיקת רעילות מעבדה פנימית עם R. תת-capitata נחשפה במשך 72 שעות לשני חומרים ננו-חומרים ממאגר JRC
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Phytoplankton ממירה אנרגיה סולארית ופחמן דו חמצני חומר אורגני ובכך מחזיק תפקיד מרכזי במערכת האקולוגית הימית. מסיבה זו, בדיקות עיכוב קצב הצמיחה אצות כלולים כאחד משלוש בדיקות רעילות ימית חובה הנדרשים להערכת סיכון רגולטורי של כימיקלים. היכולת לבצע בדיקת רעילות אצות אמינה ותורגלית היא המפתח בהקשר זה. הגדרות בדיקה באמצעות מבחנות Erlenmeyer מציגות מגוון של שונות ואי נוחות כמתואר בהקדמה. כדי לעקוף בעיה זו, צלחות microtiterהוצעו 3. בעוד לוחות microtiter למזער את עוצמת הקול ואת השטח הדרוש לבדיקה, חששות הועלו בספרות לגבי תאימות של הגדרות כאלה עם קריטריוני תוקף הבדיקה של הנחיות בדיקה6. לדוגמה, אובדן משמעותי של כימיקלים חצי-נדיים, כמו גם הצלבה לבארות אחרות בלחות microtiter ב 37 ° C במדיה צמיחה סלולרית (DMEM GluteMAX, Opti-MEM, ו Hams F12 GlutaMAX) הוכח לאחרונה על ידי ליבנה ואח'. 12. בדיקות של חומרים נדיפים עשויים לערך בהצלחה עם ההתקנה LEVITATT באמצעות 1) בקבוקונים סגורים עם CO2 מועשר headspace9,2) ישירות מנון המתחם הנדיף דרך headspace13 או במבחנה מבחןמלא 10. במונחים של דרישות שטח, LEVITATT מספקת כיוונון בדיקה שממלא את הפער בין לוחות microtiter לבין תכננות בקבוקון Erlenmeyer תוך מתן יתרונות משני הכיוונונים, למשל, שמירה על סביבת בדיקה תמציתית וקומפקטית ונפח בדיקה מספיק לדגום הרסני (למשל, לאפיון ננו-חומרים במהלך הבדיקה).
השונות בין המדגם עבור מערכת הבדיקה LEVITATT נע בין 3.4% (3,5-Dichlorophenol ו ZnO NP) כדי 5.6% (BaSO4 NP). זאת במסגרת הדרישה של מקדם של וריאציה של צמיחה ממוצעת במשכפל תרביות בקרה של 15% שצוין על ידי ה-OECD 201קו מנחה 7 (עבור השונות בין המדגם LEVITATT כל החשיפות נכללו גם).
הרבייה לגבי EC50-ערכים של הגדרת הבדיקה עבור חומרים התייחסות הראה מקדם של שונות של 13% עבור K2Cr2O7 (n = 4) ו 21% עבור 3,5-Dichlorophenol (n = 3). זה דומה לבדיקות שבוצעו עם bioassays בקבוק בקבוק Erlenmeyer קונבנציונלי 250 מ"ל עבור חומר הייחוס K2Cr2O7 מראה 16.8%14 ו 25.4%15 מקדם וריאציה עבור EC50-ערכים. לוחות Microtiter הראו מקדם וריאציה נמוכה יותר עבור כמה חומרים התייחסות (למשל, K2Cr2O7 (9%14,15),בעוד מקדם גבוה יותר של וריאציה נצפו עבור פנול (34.9%16)ו Dichlorophenol (38%17). מידע מוגבל זמין לגבי רבייה של מחקרים עם ננו חומרים. עם זאת, השוואת מקדם המדגם הבין-מדגם של וריאציה עבור NPs ZnO באמצעות מערכת LEVITATT (3.4%) עם צלחות microtiter (67%18)או מבחנות ארלנומאייר (13%19 ו 35%20)יש לו פחות וריאציה. כדי לבחון עוד יותר את החוסן של מערכת LEVITATT, החל מחקר עגול של שני חומרי בדיקה (חומר התייחסות אחד ואחד קשה לבדיקה חומר) כבר יזם.
שמירה על תרבות אצות לא מחוסמת יכולה להיות קשה אם לא מטופלת בתנאים סטריליים. צמיחת אצות אקספוננציאלית היא תנאי מוקדם מרכזי לביצוע בדיקות אצות קוונחיות. מדידת הצמיחה בנקודות זמן מרובות (לדוגמה, 24 שעות, 48 שעות, 72 ש') יכולה לזהות אם צמיחה מעריכית מתרחשת לאורך כל תקופת הבדיקה. תנודות בטמפרטורה וברמות ה-pH יכולות להשפיע על הצמיחה באצות; לפיכך, פרמטרים אלה חייבים להיות יציבים לאורך כל תקופת הבדיקה. בכמויות קטנות של מדגם בדיקה, תנודות בטמפרטורה וב-pH מתרחשות מהר יותר בהשוואה לנפחים גדולים יותר והבעיות המעשיות של מדידת פרמטרים אלה קשות יותר ויותר עם הפחתת נפח הבדיקה. פרמטרים כגון pH וטמפרטורה באמצעות נפח בדיקה 4 מ"ל היה יציב לאורך תקופת בדיקה 72 שעות ב LEVITATT הן בחדר מבוקר טמפרטורה ב 20 מעלות צלזיוס ± 2 ° C ובאינקובטור בתנאים דומים.
שיטות אנליטיות לכמת את צמיחת האצות הן רבות: ספירת תאים בהאמוציטומטר, מונה קולטר, או פלואורסצנטיות של תמציות פיגמנט. עבור חומרים קשים, שיקולים צריכים להיעשות לגבי השיטה המתאימה ביותר לכמת ביומסה. עבור חלקיקי תחמוצת מתכת, פלואורסצנטיות של תמציות פיגמנט נמצא לבצע בצורה הטובה ביותר עקב הפרעה של agglomerates בעת ספירת אצות על ידי haemocytometer או מונה קולטר21. לעומת זאת, פרקסובות' 22 מצאו כי כימות ביומסה על ידי פלואורסצנטיות לא הייתה שיטה מתאימה לבדיקת ecotoxicity של ננו-חומרים מבוססי פחמן בשל פלואורסצנטיות אוטו-פלורסנטית וספיגה של פיגמנטים לננו-חומרים. עבור חומרים צבעוניים, ייתכן גם תהיה הפרעה של הצבע עם אות פליטת פלואורסץ, ובכך, הדורש פקדים נוספים או דילול לרמה שבה הפרעה זו זניחה.
במסמך ההדרכה לבדיקת רעילות ימית של חומריםקשים 2, אחת ההמלצות לבדיקת חומרים צבעוניים היא להגביר את עוצמת האור. באופן דומה, עוצמת אור מוגברת הוזכרה לעקוף בעיות הצללה בעת בדיקת ננו חומרים23,24. עם זאת, שינויים כאלה קשורים לעתים קרובות עם טמפרטורות מוגברות, ובכך, הדורשים קירור נוסף או אוורור של הדגימות. בהגדרת LEVITATT, זה נפתר באמצעות אור LED המייצר מעט חום בהשוואה נורות קונבנציונליות או צינורות פלורסנט. בנוסף, בחירת LED עם פלט עוצמת אור גבוהה מספיק והתקנה של עמעם מאפשרים להגדיל את עוצמת האור כדי לבדוק חומרים צבעוניים או ננו חומרים וכימיקלים רגילים מבלי לשנות את ההתקנה הכוללת בין בדיקות. יתר על כן, מיקום מקור האור מתחת לדגימות ובתרפסים נפרדים מאפשר שדה אור עקבי והומוגני.
לסיכום, ה-LEVITATT מספק פלטפורמה קומפקטית לבדיקת רעילות אצות של כימיקלים רגילים התואמים להנחיות הבינלאומיות הסטנדרטיות. יתר על כן, ההתקנה מספקת פלטפורמה חזקה לבדיקת חומרים קשים המפרים את מעבר האור לכיוון אצות, למשל, ננו חומרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי PATROLS – כלים מתקדמים לבדיקת NanoSafety, הסכם מענק 760813 במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
