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नैनोमैटेरियल्स और अन्य कठिन पदार्थों के शैवाल विषाक्तता परीक्षण के लिए एक छोटे पैमाने पर सेटअप

Published: October 10, 2020 doi: 10.3791/61209
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Environmental Engineering, Technical University of Denmark

Summary

हम एक एलईडी के साथ खड़ी प्रबुद्ध सेटअप का उपयोग करके कठिन पदार्थों (जैसे, रंगीन पदार्थों या नैनोमैटेरियल्स) के लिए शैवाल विषाक्तता परीक्षण प्रदर्शित करते हैं।

Abstract

इकोटॉक्सीसिटी डेटा यूरोपीय और अंतरराष्ट्रीय नियमों (जैसे, पहुंच) द्वारा रसायनों के पूर्व और बाद के बाजार पंजीकरण के लिए एक आवश्यकता है। शैवाल विषाक्तता परीक्षण अक्सर रसायनों के नियामक जोखिम आकलन में प्रयोग किया जाता है। उच्च विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता प्राप्त करने के लिए मानकीकृत दिशानिर्देशों का विकास महत्वपूर्ण है। शैवाल विषाक्तता परीक्षण के लिए, दिशा-निर्देशों में पीएच, तापमान, कार्बन डाइऑक्साइड के स्तर और प्रकाश तीव्रता जैसे मापदंडों की स्थिर और समान स्थितियों की आवश्यकता होती है । नैनोमैटेरियल्स और अन्य तथाकथित कठिन पदार्थ प्रकाश के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जिससे उनके नियामक स्वीकृति में बाधा उत्पन्न करने वाले परिणामों में एक बड़ी भिन्नता होती है। इन चुनौतियों से निपटने के लिए, हमने लेविट (शैवाल विषाक्तता परीक्षणों के लिए एलईडी वर्टिकल रोशनी तालिका) विकसित किया है। सेटअप नीचे से एलईडी रोशनी का उपयोग करता है जो एक समरूप प्रकाश वितरण और तापमान नियंत्रण की अनुमति देता है, जबकि अंतर-नमूना छायांकन को भी कम करता है। सेटअप बायोमास क्वांटिफिकेशन के लिए नमूना मात्रा का अनुकूलन करता है और एक ही समय में शैवाल के घातीय विकास का समर्थन करने के लिए सीओ2 की पर्याप्त आमद सुनिश्चित करता है। इसके अतिरिक्त, परीक्षण कंटेनरों की सामग्री को सोखने और वाष्पीकरण को कम करने के लिए सिलवाया जा सकता है। रंगीन पदार्थों या कण निलंबन का परीक्षण करते समय, एलईडी रोशनी का उपयोग अतिरिक्त गर्मी उत्पादन के बिना प्रकाश तीव्रता बढ़ाने की अनुमति देता है। कॉम्पैक्ट डिजाइन और न्यूनतम उपकरण आवश्यकताएं प्रयोगशालाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में लेविट के कार्यान्वयन के लिए संभावनाओं को बढ़ाती हैं। शैवाल विषाक्तता परीक्षण के लिए मानकीकृत आईएसओ और ओईसीडी दिशानिर्देशों के अनुरूप, लेविट ने एर्लेनमेयर फ्लैक्स और माइक्रोटिटर प्लेटों की तुलना में दो संदर्भ पदार्थों (3,5-डिकोलोरोफेनोल और के2सीआर2ओ7)और तीन नैनोमैटेरियल्स (जेडएनओ, सीईओ2,और बासो4)के लिए कम अंतर-नमूना परिवर्तनशीलता भी दिखाई।

Introduction

शैवाल विषाक्तता परीक्षण केवल तीन अनिवार्य परीक्षणों में से एक है जो यूरोपीय और अंतरराष्ट्रीय विनियमों (जैसे, पहुंच 1 और टीएससीए (यूएसए) द्वारा रसायनों के पूर्व और बाद के बाजार पंजीकरण के लिए आवश्यक इकोटॉक्सीसिटी डेटा उत्पन्न करने के लिए उपयोग कियाजाता है। इस उद्देश्य के लिए, अंतरराष्ट्रीय संगठनों (जैसे, आईएसओ और ओईसीडी) द्वारा मानकीकृत शैवाल परीक्षण दिशानिर्देश विकसित किए गए हैं। ये परीक्षण मानक और दिशानिर्देश पीएच, तापमान, कार्बन डाइऑक्साइड के स्तर और प्रकाश तीव्रता के संदर्भ में आदर्श परीक्षण की स्थिति निर्धारित करते हैं। हालांकि, शैवाल परीक्षण के दौरान स्थिर परीक्षण की स्थिति को बनाए रखना व्यवहार में मुश्किल है और परिणाम रासायनिक पदार्थों और नैनोमैटेरियल्स (अक्सर "कठिन पदार्थ" के रूप में संदर्भित)2के लिए प्रजनन क्षमता और विश्वसनीयता के साथ समस्याओं से पीड़ित हैं। मौजूदा शैवाल विषाक्तता परीक्षण सेटअप के अधिकांश अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा (100-250 मिलीएल) एक इनक्यूबेटर के अंदर एक कक्षीय शेखर पर स्थित के साथ काम करते हैं । इस तरह के एक सेटअप परीक्षण सांद्रता की संख्या को सीमित करता है और शैवाल संस्कृति और परीक्षण सामग्री की प्राप्त करने योग्य और उच्च मात्रा को दोहराता है। इसके अतिरिक्त, इन सेटअप में शायद ही कभी एक समान प्रकाश क्षेत्र होता है और विश्वसनीय प्रकाश की स्थिति बड़े फ्लास्क में प्राप्त करना इसके अलावा मुश्किल होता है, आंशिक रूप से प्रकाश तीव्रता तेजी से कम हो जाती है और प्रकाश यात्रा और आंशिक रूप से फ्लास्क ज्यामिति के कारण। वैकल्पिक सेटअप में प्लास्टिक माइक्रोटिटर3 प्लेटें शामिल हैं जिनमें छोटे नमूना वॉल्यूम होते हैं जो पीएच, अतिरिक्त बायोमास माप, वर्णक निष्कर्षण या विनाशकारी नमूने की आवश्यकता वाले अन्य विश्लेषणों को मापने के लिए पर्याप्त नमूना मात्रा की अनुमति नहीं देते हैं। नैनोमैटेरियल्स और रंगीन निलंबन बनाने वाले पदार्थों के शैवाल विषाक्तता परीक्षण के लिए मौजूदा सेटअप का उपयोग करके एक विशेष चुनौती शैवाल कोशिकाओं के लिए उपलब्ध प्रकाश का हस्तक्षेप या अवरुद्ध करना है, जिसे अक्सर "छायांकन"4,,5कहा जाता है। छायांकन परीक्षण सामग्री और/या परीक्षण सामग्री और शैवाल कोशिकाओं के बीच बातचीत, या छायांकन शीशियों के बीच हो सकता है, एक दूसरे के सापेक्ष उनकी स्थिति और प्रकाश स्रोत के कारण शीशियों के भीतर हो सकता है ।

यह विधि एरेन्सबर्ग एट अल द्वारा शुरू किए गए छोटे पैमाने6 पर शैवाल विषाक्तता परीक्षण सेटअप पर आधारित है जो ओईसीडी 201 7 और आईएसओ 86928जैसे मानकों के अनुपालन में परीक्षण की अनुमति देता है।8 विधि आगे द्वारा उल् दिए गए सीमाओं को संबोधित करने के लिए अनुकूलित है: 1) न्यूनतम गर्मी उत्पादन के साथ एक समान प्रकाश की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए एलईडी प्रकाश प्रौद्योगिकी का उपयोग करना,2) निरंतर पीएच, सीओ 2 स्तरों और 3 को बनाए रखते हुए रासायनिक/जैविक विश्लेषण के लिए पर्याप्त नमूना मात्रा प्रदान करना) अस्थिर पदार्थों या पदार्थों के परीक्षण के लिए बहुमुखी परीक्षण कंटेनर सामग्री के उपयोग को सक्षम करता है जिसमें उच्च सोरप्शन क्षमता होती है।

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Protocol

1. लेविट सेटअप का विवरण

  1. प्रकाश प्रवेश की अनुमति देने वाले 20 एमएल प्रस्फुटन ग्लास शीशियों(चित्रा 1,डालें 1) का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, हल्के पेनेट्रेबल प्लास्टिक की शीशियों का उपयोग किया जा सकता है। फोटोमीटर का उपयोग करके प्रकाश तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें।
  2. परीक्षण की शुरुआत में कम से कम 4 एमएल परीक्षण निलंबन का उपयोग बायोमास के मात्राकरण के लिए और इनक्यूबेशन के दौरान और बाद में नैनोमैटेरियल्स के लक्षण वर्णन/मात्राकरण के लिए अनुमति देने के लिए(चित्रा 1,डालें 2)।
  3. वातावरण के साथ सीओ 2 एक्सचेंज के लिए अनुमति देने के लिए एक टोपी(चित्रा 1,डालें 3) के साथ20 एमएल प्रस्फुटन शीशियों को फिट करें जहां एक छोटा छेद ड्रिल किया जाता है (व्यास में लगभग 1 मिमी)। परीक्षण के दौरान स्थिर पीएच और सीओ2 स्तर सुनिश्चित करने के लिए यह एक्सचेंज महत्वपूर्ण है।
  4. अस्थिर पदार्थों के लिए, एक एयर-टाइट टेफ्लॉन कोटेड कैप का उपयोग करें ताकि सिरिंज9 या पूरी तरह से बंद फ्लास्क का उपयोग करके हेडस्पेस के सीओ2 को समृद्ध करने की अनुमति दी जा सके जिसमें सीओ2 को एक समृद्ध सोडियम बाइकार्बोनेट (नाएचको3)बफर सिस्टम10द्वारा समाधान में बनाए रखा जाता है।
  5. बाहरी आवरण(चित्रा 1, 4डालें) पर घुड़सवार क्लैंप के साथ शीशियों को जकड़ना।
  6. परीक्षण शीशियों के नीचे स्थित एक एलईडी प्रकाश स्रोत का उपयोग करें(चित्रा 1,डालें 5) "कूल-व्हाइट" या "डेलाइट" प्रकार की एक समान फ्लोरोसेंट रोशनी और रेंज 60-120 माइक्रोन∙एम-2∙-1में एक समान फ्लोरोसेंट रोशनी प्रदान करता है जो 400 एनएम से700 एनएम तक की फोटोसिंथिक रूप से प्रभावी तरंगदैर्ध्य रेंज में मापा जाता है। सेटअप स्रोत के लिए एक प्रकाश मंद फिटिंग द्वारा रेंज 5-160-2μe∙m-2∙-1 में समायोज्य प्रकाश तीव्रता को रोजगार । यह उच्च और कम प्रकाश तीव्रता पर परीक्षण के लिए अनुमति देता है।
  7. परीक्षण की अवधि के दौरान नमूनों को उत्तेजित करने के लिए एक कक्षीय शेखर पर सेटअप माउंट करें। यह कोशिकाओं को मुक्त निलंबन में रखता है और सीओ2 द्रव्यमान हस्तांतरण को हवा से पानी में लाने की सुविधादेता है (चित्रा 1,6 डालें)।
  8. परीक्षण के दौरान स्थिर तापमान बनाए रखने के लिए एक तापमान नियंत्रित कमरे या थर्मोस्टैटिक कैबिनेट में सेटअप रखें(चित्र 1,7 डालें)।

Figure 1
चित्रा 1: शैवाल विषाक्तता परीक्षणों (LEVITATT) के लिए एलईडी वर्टिकल रोशनी तालिका की तस्वीर। 1) इनक्यूबेशन के लिए 20 एमएल ग्लास प्रस्फुटन शीशियां, 2) विश्लेषण के लिए 4 मिलील नमूना, सीओ2 एक्सचेंज के लिए ड्रिल्ड होल के साथ ढक्कन, 4) परिभाषित प्रकाश स्थितियों के लिए आवरण, 5) आवरण के केंद्र में स्थित एलईडी प्रकाश स्रोत, 6) प्रयोग के दौरान आंदोलन के लिए कक्षीय शेखर, और 7) एक थर्मोस्टेटिक कैबिनेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

2. शैवाल विकास माध्यम की तैयारी

  1. आईएसओ 8692 शैवाल विकास माध्यम में चार अलग-अलग स्टॉक समाधान होते हैं। टेबल 1के अनुसार अल्ट्रापुरे पानी में नमक और पतला की उचित मात्रा का वजन करें ।
स्टॉक समाधान पोषक तत्व स्टॉक समाधान में एकाग्रता परीक्षण समाधान में एकाग्रता
1: मैक्रोन्यूट्रिएंट्स एनएच4सीएल 1.5 ग्राम/एल 15 मिलीग्राम/एल (एन: ३.९ मिलीग्राम/एल)
एमजीसीएल2∙6एच2ओ 1.2 ग्राम/एल 12 मिलीग्राम/एल (मिलीग्राम: 2.9 मिलीग्राम/एल)
CaCl2∙2H2O 1.8 ग्राम/एल 18 मिलीग्राम/एल (सीए: 4.9 मिलीग्राम/एल)
MgSO4∙7H2O 1.5 ग्राम/एल 15 मिलीग्राम/एल (एस: १.९५ मिलीग्राम/एल)
केएच2पीओ4 0.16 ग्राम/एल 1.6 मिलीग्राम/एल (पी: 0,36 मिलीग्राम/एल)
2: Fe-EDTA FeCl3∙6H2O 64 मिलीग्राम/एल ६४ μg/L (Fe: 13 μg/L)
ना 2EDTA∙2H2O 100 मिलीग्राम/एल 100 μg/L
3: तत्वों का पता लगाने एच3बो3ए 185 मिलीग्राम/एल १८५ μg/L (B: ३२ μg/L)
एमएनएल2∙4एच2ओ 415 मिलीग्राम/एल ४१५ μg/L (Mn: ११५ μg/L)
जेडएनसीएल2 3 मिलीग्राम/एल 3 μg/L (Zn: 1.4 μg/L)
CoCl2∙6H2O 1.5 मिलीग्राम/एल 1.5 μg/L (Co: 0.37 μg/L)
CuCl2∙2H2O 0.01 मिलीग्राम/L 0.01 μg/L (Cu: 3.7 एनजी/एल)
ना 2मू4∙2H 2O 7 मिलीग्राम/एल 7 μg/L (मो: २.८ μg/L)
4: NaHCO3 नाहको3 50 ग्राम/एल 50 मिलीग्राम/एल (सी: 7.14 मिलीग्राम/एल)

तालिका 1: शैवाल विकास माध्यम के लिए स्टॉक समाधान में पोषक तत्वों की सांद्रता

नोट: एच3बीओ3 को 0.1 एम नाओएच जोड़कर भंग किया जा सकता है। धातु आयनों के साथ जटिलता से बचने के लिए धातुओं का परीक्षण करते समय EDTA को हटा दिया जाना चाहिए। झिल्ली निस्पंदन (मतलब ताकना व्यास 0.2 माइक्रोन) या ऑटोक्लेविंग (120 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट) द्वारा स्टॉक समाधानों को स्टरलाइज करें। कोई ऑटोक्लेव स्टॉक समाधान 2 और 4 मत करो, लेकिन झिल्ली छानने का काम करके उन्हें निष्फल करें। समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।

  1. शैवाल विकास माध्यम के 1 एल का उत्पादन करने के लिए, 500 एमएल निष्फल अल्ट्रापुरे पानी को 1 एल निष्फल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में स्थानांतरित करें और स्टॉक समाधान के 10 एमएल जोड़ें 1: मैक्रोन्यूट्रिएंट्स, स्टॉक समाधान का 1 एमएल 2: फे-ईडीटीए, स्टॉक समाधान का 1 एमएल 3: ट्रेस तत्व, और समाधान स्टॉक का 1 एम एल स्टॉक 4: NaHCO3।
  2. निष्फल अल्ट्रापुरे पानी के साथ 1 एल तक भरें, फ्लास्क को डाटें और शैवाल विकास माध्यम को समरूप बनाने के लिए अच्छी तरह से हिलाएं।
  3. इसे हवा के संपर्क में रात भर छोड़कर या बाँझ, 30 मिनट के लिए फ़िल्टर हवा के साथ बुदबुदाते हुए उपयोग से पहले समाधान को बराबर करें। संतुलन के बाद, पीएच को समायोजित करें, यदि आवश्यक हो, तो पीएच 8.1 ± 0.2 में, या तो 1 एम एचसीएल या 1 एम नाओएच के साथ।

3. शैवाल परीक्षण की स्थापना

नोट: शैवाल परीक्षण प्रक्रिया का एक प्रवाह आरेख चित्र 2में दिखाया गया है ।

Figure 2
चित्रा 2: शैवाल परीक्षण सेटअप का प्रवाह आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. स्टेप 2 के हिसाब से तैयार शैवाल ग्रोथ मीडियम में इच्छित हाईएस्ट टेस्ट कंसंट्रेशन पर टेस्ट कंपाउंड का स्टॉक सॉल्यूशन तैयार करें। स्टॉक समाधान/निलंबन की तैयारी के लिए, ओईसीडी 201 (घुलनशील यौगिकों के लिए) या ओईसीडी 318 (नैनोमैटेरियल्स के लिए) का पालन करें।
  2. स्टॉक समाधान में पीएच को मापें। यदि यह शैवाल विकास माध्यम से एक से अधिक इकाई को विचलित करता है, तो पीएच को 1 एम एचसीएल या 1 एम नाओएच के साथ 8 में समायोजित करें।
  3. 25 एमएल परीक्षण समाधान में 1 x 104 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम कोशिका एकाग्रता तक पहुंचने के लिए आवश्यक इनोकुलम वॉल्यूम की गणना करें।
    नोट: इनोकुलम को लेविट सेटअप का उपयोग करके उगाए गए अविध तेजी से बढ़ते रैचिडोलिस उपपूज्य की संस्कृति से आना चाहिए।
  4. वांछित परीक्षण सांद्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक 25 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में जोड़ने के लिए स्टॉक समाधान की मात्रा की गणना करें। प्रत्येक एकाग्रता के बीच कारक 3.2 से अधिक नहीं होना चाहिए।
  5. प्रत्येक चुने हुए एकाग्रता के लिए एक 25 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क और एक अतिरिक्त 25 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क चिह्नित नियंत्रण चिह्नित करें।
  6. 25 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में वांछित सांद्रता तक पहुंचने के लिए आवश्यक परीक्षण यौगिक के स्टॉक समाधान की मात्रा जोड़ें। नियंत्रण में स्टॉक समाधान न जोड़ें।
  7. लगभग 20 एमएल की मात्रा तक पहुंचने के लिए प्रत्येक 25 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में माध्यम जोड़ें।
  8. प्रत्येक 25 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में चरण 3.3 में गणना किए गए इनोकुलम की मात्रा जोड़ें। प्रत्येक 25 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में माध्यम को 25 एमएल की अंतिम कुल मात्रा में जोड़ें।
  9. फ्लैक्स को डाटें और दो बार खड़ी फ्लैक्स को मोड़कर अच्छी तरह से मिलाएं।
  10. प्रत्येक फ्लास्क से 0.4 एमएल को व्यक्तिगत स्क्रू कैप शीशियों में स्थानांतरित करें और एसीटोन के 1.6 एमएल जोड़ें (एमजीसीओ3के साथ संतृप्त): प्रत्येक परीक्षण एकाग्रता और नियंत्रण के लिए एक नमूना। ढक्कन को कसकर बंद करें और फ्लोरेसेंस माप (धारा 4) तक कमरे के तापमान पर अंधेरे में स्टोर करें।
  11. 20 एमएल प्रस्फुटन शीशियों में प्रत्येक परीक्षण समाधान के 4 एमएल (3 एकाग्रता प्रति प्रतिकृति और नियंत्रण के लिए 5 प्रतिकृति) । प्रस्फुटन की शीशियों पर पेंच ढक्कन। याद रखें कि ढक्कन में सीओ 2 एक्सचेंज के लिए अनुमति देने के लिए एक ड्रिल छेद (व्यास में लगभग1 मिमी) होना चाहिए।
  12. 24 घंटे, 48 घंटे, और 72 घंटे के बाद, प्रत्येक शीशी से स्क्रू कैप शीशियों में 0.4 एमएल पाइप और एसीटोन के 1.6 एमएल जोड़ें (एमजीको3के साथ संतृप्त)। ढक्कन को कसकर बंद करें और फ्लोरेसेंस माप (धारा 4) तक कमरे के तापमान पर अंधेरे में स्टोर करें।
  13. अंतिम नमूना 72 घंटे पर लिया जाता है, धीरे-धीरे एक शीशी में दिए गए एकाग्रता के लिए तीन प्रतिकृति पूल और पीएच को मापने के बाद। सभी सांद्रता और नियंत्रण के लिए दोहराएं। पीएच मापा नमूनों में से किसी के लिए प्रारंभिक पीएच से १.५ इकाइयों से अधिक विचलित नहीं होना चाहिए ।
  14. अपने संस्थागत नियमों और विनियमों का पालन करते हुए शेष तरल पदार्थों को अपशिष्ट कंटेनर में छोड़ दें।

4. शैवाल परीक्षण नमूनों का विश्लेषण

  1. शैवाल बायोमास (यहां क्लोरोफिल ए के रूप में व्यक्त) को मापने के लिए फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें। क्लोरोफिल ए के लिए पीक एमिशन वेवलेंथ के लिए 420 एनएम और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के लिए 671 एनएम है।
  2. प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के फ्लोरेसेंस को तीन बार मापें और प्रत्येक नमूने के लिए औसत मूल्य की गणना करें।
  3. विकास दर की गणना करने के लिए समीकरण 1 का उपयोग करें। मापा फ्लोरेसेंस (सापेक्ष इकाइयों) समीकरण 1 में बायोमास पैरामीटर के रूप में सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है।
    समीकरण 1: μ = (ln Nt- ln N0)/
    जहां μ विकास दर(डी-1),एन0 प्रारंभिक बायोमास है, एनटी समय टी पर बायोमास है, और टी परीक्षण अवधि (डी) की लंबाई है । नोट, एन0 और एनटी एक ही इकाई में व्यक्त किया जाना चाहिए।
  4. 10%, 20% और 50% अवरोध पर प्रभावी एकाग्रता मूल्यों को प्राप्त करने के लिए विकास दर डेटा के लिए एक गैर-रैखिक प्रतिगमन वक्र (उदाहरण के लिए, एक लॉग-लॉजिस्टिक या वीबुल फ़ंक्शन) फिट करने के लिए एक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। अनुपूरक जानकारी में डीआरसी पैकेज11 का उपयोग करते हुए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर आर में फिटिंग के लिए कोड का एक उदाहरण दिया गया है।

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Representative Results

शैवाल तनाव की संवेदनशीलता को निर्धारित करने के लिए संदर्भ पदार्थ के साथ एक प्रारंभिक परीक्षण किया जाता है। आर उपकैपिटाटा के लिए नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले संदर्भ पदार्थ पोटेशियम डिक्रोमेट और 3,5-डाइक्लोल्फेनॉल7,,8हैं। चित्रा 3 और तालिका 2 में वक्र फिटिंग और सांख्यिकीय आउटपुट सहित एक शैवाल परीक्षण का एक प्रतिनिधि परिणाम दिखाता है जब आर में डीआरसी पैकेज विकास दर पर लागू होता है।

Figure 3
चित्रा 3: शैवाल(आर उपcapitata)के लिए एक रासायनिक यौगिक के ७२ घंटे जोखिम के लिए प्रतिनिधि एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र । ठोस रेखा लॉग-लॉजिस्टिक फिट का प्रतिनिधित्व करता है और छायांकित क्षेत्र फिट के लिए 95% आत्मविश्वास अंतराल है। खुले हलकों प्रत्येक दोहराने के लिए गणना की वृद्धि दर का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ईसी10 ईसी20 EC50
[मिलीग्राम/एल] [मिलीग्राम/एल] [मिलीग्राम/एल]
रासायनिक यौगिक 4.6 [1.8-7.5] 7.4 [4.1-11] 16.9 [11-22]

तालिका 2: शैवाल (आर उपcapitata) का उपयोग कर एक रासायनिक यौगिक के लिए 10%, 20% और विकास दर के 50% अवरोध के लिए प्रतिनिधि प्रभावी सांद्रता। कोष्ठक में मूल्य एक लॉग-लॉजिस्टिक फिटिंग के 95% विश्वास अंतराल का प्रतिनिधित्व करता है।

एक सफल परीक्षण में ओईसीडी दिशानिर्देश का पालन करने के लिए ०.९डी-1 से ऊपर की वृद्धि दर होगी और आईएसओ ८६९२ दिशानिर्देश का पालन करने के लिए१.५ डी-1 और 0% और १००% अवरोध के बीच कम से एक एकाग्रता शामिल होनी चाहिए । परीक्षण की शुरुआत में घातीय विकास चरण में बैक्टीरियल संदूषण या इनोकुलम नहीं होने जैसे विभिन्न मुद्दों के परिणामस्वरूप कम वृद्धि दर हो सकती है। प्रतिकृति की सूक्ष्म जांच केवल लगभग 2μm चौड़ाई और 8 माइक्रोन लंबाई के आयामों के साथ एक समान दरांती के आकार का हरा शैवाल(आर उपcapitata)दिखाना चाहिए । यदि एक भी दोहराने दूषित है, तो इसे छोड़ा जा सकता है और विश्लेषण इस डेटा के बिना किया जा सकता है। हालांकि, यदि कई प्रतिकृति दूषित हैं, तो प्रयोग को अविजित तेजी से बढ़ते इनोकुलम के साथ दोहराएं। यह मूल्यांकन करने के लिए कि क्या परीक्षण की शुरुआत में इनोकुलम घातीय विकास चरण में था, नियंत्रण की वृद्धि दर की गणना 24 घंटे के अंतराल पर दोहराती है और केवल उस समय अंतराल का उपयोग करती है जिस पर नियंत्रण की शैवाल वृद्धि सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए घातीय है।

सेटअप की मजबूती का परीक्षण करने के लिए, दो संदर्भ पदार्थों (K 2 Cr2O7और 3,5-डाइक्लोनोफेनॉल) और तीन नैनोमैटेरियल्स का उपयोग करके एक विषाक्तता परीक्षण तीन बार दोहराया गया (3,5-डाइक्लोरोफेनोल, बासो4 नैनोकण (एनएम-220), और जेडएनओ नैनोकण (एनएम-111)) और चार बार (K2Cr2O7 और सीईओ 2 नैनोकण (एनएम-212)) ।7 2 परिणामों ने 11% और 39% के बीच ईसी50-मूल्यों की भिन्नता का गुणांक दिखाया, जिसमें जेडएनओ नैनोकणों (एनएम-111) के लिए विचरण का सबसे कम गुणांक और सीईओ2 नैनोकणों (एनएम-212)(तालिका 3)के लिए भिन्नता का उच्चतम गुणांक है।

यौगिक # प्रयोगों की विकास दर के लिए भिन्नता का अंतर-नमूना गुणांक
%		 EC50
(औसत)
मिलीग्राम/एल		 EC50 मूल्यों के लिए भिन्नता का गुणांक
%
K2करोड़2O7 4 4.5 0.73 13
3,5-डाइक्लोरोफेनॉल 3 3.4 1.9 21
बासो4 एनपी (एनएम-220) 3 5.6 22 20
सीईओ2 एनपी (एनएम-212) 4 4.3 13 39
ZnO एनपी (एनएम-111) 3 3.4 0.13 11

तालिका 3: आर उपcapitata के साथ एक आंतरिक प्रयोगशाला विषाक्तता परीक्षण के परिणाम ७२ घंटे के लिए दो संदर्भ पदार्थों और जेआरसी भंडार से तीन नैनोमैटेरियल्स के लिए उजागर

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Discussion

फाइटोप्लैंकटन सौर ऊर्जा और कार्बन डाइऑक्साइड को कार्बनिक पदार्थ में परिवर्तित करता है और इस प्रकार जलीय पारिस्थितिकी तंत्र में एक महत्वपूर्ण भूमिका रखता है। इस कारण से, शैवाल विकास दर अवरोध परीक्षणों को रसायनों के नियामक जोखिम आकलन के लिए आवश्यक तीन अनिवार्य जलीय विषाक्तता परीक्षणों में से एक के रूप में शामिल किया गया है । इस संबंध में एक विश्वसनीय और प्रजनन योग्य शैवाल विषाक्तता परीक्षण करने की क्षमता महत्वपूर्ण है। एर्लेनमेयर फ्लास्क का उपयोग करके परीक्षण सेटअप परिचय में वर्णित कई तरह की वेरिबिलिटी और असुविधाओं का परिचय देते हैं। इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए, माइक्रोटिटर प्लेटें3प्रस्तावित किया गया है । जबकि माइक्रोटिटर प्लेटें परीक्षण के लिए आवश्यक मात्रा और स्थान को कम करती हैं, इस तरह के सेटअप के अनुपालन के संबंध में साहित्य में चिंताएं व्यक्त की गई हैं, परीक्षण दिशानिर्देश6के परीक्षण वैधता मानदंडों के साथ । उदाहरण के लिए, सेलुलर ग्रोथ मीडिया (डीएमईएम ग्लूटेमैक्स, ऑप्टी-एमईएम, और हैम्स एफ 12 ग्लूटामैक्स) में माइक्रोटेटर प्लेटों में अन्य कुओं के साथ-साथ सेमीवोल्टाइल रसायनों के साथ-साथ क्रॉस-ओवर का महत्वपूर्ण नुकसान हाल ही में बिर्च एट अल12द्वारा प्रदर्शित किया गया था। अस्थिर पदार्थों का परीक्षण सफलतापूर्वक लेविट सेटअप के साथ किया जा सकता है 1 का उपयोग करके) सीओ 2 समृद्ध हेडस्पेस9,2) के साथ बंद शीशियों को सीधे हेडस्पेस13 के माध्यम से अस्थिर यौगिक को या भरे हुए परीक्षण शीशी10में। अंतरिक्ष आवश्यकताओं के संदर्भ में, लेविट एक परीक्षण सेटअप प्रदान करता है जो माइक्रोटिटर प्लेटों और एर्लेनमेयर फ्लास्क सेटअप के बीच के अंतर को भरता है, उदाहरण के लिए, एक संक्षिप्त और कॉम्पैक्ट परीक्षण वातावरण और विनाशकारी नमूने के लिए पर्याप्त परीक्षण मात्रा (उदाहरण के लिए, परीक्षण के दौरान नैनोमेट्रिल्स के लक्षण वर्णन के लिए)।

लेविट टेस्ट सिस्टम के लिए इंटर-सैंपल वेरिबिलिटी 3.4% (3,5-डाइक्लोफेनॉल और जेडएनओ एनपी) से लेकर 5.6% (बासो4 एनपी) तक थी। यह ओईसीडी 201 दिशानिर्देश7 द्वारा इंगित 15% की नियंत्रण संस्कृतियों को दोहराने में औसत वृद्धि की भिन्नता के गुणांक की आवश्यकता के भीतर है (लेविट अंतर-नमूना परिवर्तनशीलता के लिए सभी एक्सपोजर भी शामिल थे)।

संदर्भ पदार्थों के लिए परीक्षण सेटअप के ईसी50-मूल्यों के संबंध में प्रजनन क्षमता ने K 2Cr2O7 (n = 4) के लिए 13% और 3,5-डिक्लोरोफेनोल (एन = 3) के लिए 21% के विचरण का गुणांक दिखाया। यह संदर्भ पदार्थ के लिए पारंपरिक 250 एमएल एर्लेनमेयर फ्लास्क बायोसेस के साथ किए गए परीक्षणों के बराबर है K2Cr2O7 16.8%14 और 25.4%15 गुणांक ईसी50-मूल्यों के लिए भिन्नता दिखा रहा है। माइक्रोटिटर प्लेटों में कुछ संदर्भ पदार्थों (उदाहरण के लिए, के 2 सीआर2ओ7 (9%14,15)के लिए कम भिन्नता गुणांक दिखाया गयाहै,जबकि फिनॉल (34.9%16)और डिक्लोरोफेनोल (38%17)के लिए भिन्नता के उच्च गुणांक देखे गए हैं। नैनोमैटेरियल्स के साथ अध्ययन की पुनरुत्पादनता के संबंध में सीमित जानकारी उपलब्ध है। हालांकि, लेविट सिस्टम (3.4%) का उपयोग करके जेडएनओ एनपीएस के लिए भिन्नता के अंतर-नमूना गुणांक की तुलना करना माइक्रोटिटर प्लेटों (67%18)या एर्लेनमेयर फ्लास्क (13%19 और 35%20)के साथ इसमें कम भिन्नता है। लेविट सिस्टम की मजबूती को और परखने के लिए दो परीक्षण सामग्रियों (एक संदर्भ पदार्थ और एक पदार्थ का परीक्षण करने में मुश्किल) का राउंड रोबिन अध्ययन शुरू किया गया है ।

एक अदूषित शैवाल संस्कृति को बनाए रखना मुश्किल हो सकता है अगर बाँझ परिस्थितियों में नहीं संभाला । घातीय शैवाल विकास दिशानिर्देश शैवाल परीक्षण प्रदर्शन के लिए एक प्रमुख शर्त है। कई समय बिंदुओं पर वृद्धि को मापने (जैसे, 24 घंटे, ४८ घंटे, ७२ घंटे) की पहचान कर सकते है कि घातीय वृद्धि परीक्षण की अवधि के दौरान होने वाली है । तापमान और पीएच में उतार-चढ़ाव शैवाल विकास को प्रभावित कर सकता है; इस प्रकार, इन मापदंडों को परीक्षण अवधि के दौरान स्थिर होना चाहिए। परीक्षण नमूने की छोटी मात्रा में, तापमान और पीएच में उतार-चढ़ाव बड़ी मात्रा की तुलना में अधिक तेजी से होते हैं और इन मापदंडों को मापने के व्यावहारिक मुद्दे परीक्षण की मात्रा कम होने के साथ तेजी से मुश्किल होते हैं। 4 एमएल परीक्षण की मात्रा का उपयोग करके पीएच और तापमान जैसे पैरामीटर 20 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस पर तापमान नियंत्रित कमरे में और समान परिस्थितियों में इनक्यूबेटर में लेविट में 72 घंटे की परीक्षण अवधि में स्थिर थे।

शैवाल विकास के मात्राकरण के लिए विश्लेषणात्मक तरीके कई हैं: हीमोसाइटोमीटर, कल्टर काउंटर, या वर्णक अर्क के फ्लोरेसेंस में सेल गिनती। कठिन पदार्थों के लिए, बायोमास क्वांटिफिकेशन के लिए सबसे उपयुक्त विधि के संबंध में विचार किए जाने चाहिए। धातु ऑक्साइड नैनोकणों के लिए, हीमोसाइटोमीटर या कूल्टर काउंटर21द्वारा शैवाल की गिनती करते समय समूह के हस्तक्षेप के कारण वर्णक अर्क का फ्लोरेसेंस सबसे अच्छा प्रदर्शन करने के लिए पाया गया है । इसके विपरीत, फारकास और बूथ22 ने पाया कि फ्लोरेसेंस द्वारा बायोमास का मात्राकरण नैनोमैटेरियल्स को ऑटोफ्लोरेरेसेंस और पिगमेंट के अवशोषण के कारण कार्बन आधारित नैनोमैटेरियल्स के पारिस्थितिकीयता परीक्षण के लिए एक उपयुक्त तरीका नहीं था। रंगीन पदार्थों के लिए, फ्लोरेसेंस उत्सर्जन संकेत के साथ रंग का हस्तक्षेप भी हो सकता है, इस प्रकार, अतिरिक्त नियंत्रण या कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है जहां यह हस्तक्षेप नगण्य है।

कठिन पदार्थों के जलीय विषाक्तता परीक्षण के लिए मार्गदर्शन दस्तावेज में2,रंगीन सामग्रियों के परीक्षण के लिए सिफारिशों में से एक प्रकाश तीव्रता को बढ़ाना है। इसी प्रकार, नैनोमैटेरियल्स23 , 24,24का परीक्षण करते समय छायांकन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि का उल्लेख किया गया है । हालांकि, इस तरह के संशोधन अक्सर बढ़े हुए तापमान से जुड़े होते हैं, इस प्रकार, नमूनों के अतिरिक्त शीतलन या वेंटिलेशन की आवश्यकता होती है। लेविट सेटअप में, यह एलईडी लाइट का उपयोग करके हल किया जाता है जो पारंपरिक प्रकाश बल्ब या फ्लोरोसेंट ट्यूबों की तुलना में थोड़ी गर्मी पैदा करता है। इसके अतिरिक्त, पर्याप्त रूप से उच्च प्रकाश तीव्रता उत्पादन के साथ एक एलईडी का चयन करना और एक डिमर की स्थापना परीक्षणों के बीच समग्र सेटअप में फेरबदल किए बिना रंगीन पदार्थों या नैनोमैटेरियल्स और नियमित रसायनों का परीक्षण करने के लिए हल्के तीव्रता को बढ़ाने की अनुमति देती है। इसके अलावा, नमूनों के नीचे और अलग-अलग केसिंग्स में प्रकाश स्रोत का प्लेसमेंट एक सुसंगत और समरूप प्रकाश क्षेत्र के लिए अनुमति देता है।

अंत में, लेविट अंतरराष्ट्रीय मानकीकृत दिशानिर्देशों के अनुरूप नियमित रसायनों के शैवाल विषाक्तता परीक्षण के लिए एक कॉम्पैक्ट मंच प्रदान करता है। इसके अलावा, सेटअप कठिन पदार्थों के परीक्षण के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करता है जो शैवाल की ओर प्रकाश के पारित होने में हस्तक्षेप करते हैं, उदाहरण के लिए, नैनोमैटेरियल्स।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस शोध को गश्ती दल द्वारा वित्त पोषित किया गया था - नैनोसेफ्टी परीक्षण के लिए उन्नत उपकरण, क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम के तहत अनुदान समझौता 760813।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich V179124
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134
BlueCap bottles (1L) Buch & Holm A/S  9072335
Boric acid Sigma-Aldrich B0394
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 208290
Clear acrylic sheet (40x40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 255599
Copper(II) chloride dihydrate Sigma-Aldrich 307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich  E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000 Hitachi
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
Iron(III) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 236489
LED light source Helmholt Elektronik A/S H35161 Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M9272
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 221279
Orbital shaker IKA 2980200
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662
Raphidocelis subcapitata NORCCA NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL) Fisherscientific 11526325
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413
Sodium molybdate dihydrate Sigma-Aldrich 331058 
Spring clamp Frederiksen Scientific A/S 472002
Thermostatic cabinet VWR WTWA208450 Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm) Silvan 22605630165
Volumetric flasks (25 mL) DWK Life Sciences 246781455
Zinc chloride Sigma-Aldrich 208086

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 164 इकोटॉक्सीसिटी विकास अवरोध रंगीन पदार्थ नैनोमैटेरियल्स राफिडोसेलिस उपपूंजिता,ओईसीडी 201 आईएसओ 8692 लेविट
नैनोमैटेरियल्स और अन्य कठिन पदार्थों के शैवाल विषाक्तता परीक्षण के लिए एक छोटे पैमाने पर सेटअप
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Skjolding, L. M., Kruse, S., Sørensen, S. N., Hjorth, R., Baun, A. A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances. J. Vis. Exp. (164), e61209, doi:10.3791/61209 (2020).

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