Summary
Dimostriamo test di tossicità delle alghe per sostanze difficili (ad esempio, sostanze colorate o nanomateriali) utilizzando un setup illuminato verticalmente con un LED.
Abstract
I dati sull'ecotossicità sono un requisito per la registrazione pre e post-mercato delle sostanze chimiche da parte delle normative europee e internazionali (ad esempio, REACH). Il test di tossicità delle alghe è spesso utilizzato nella valutazione del rischio normativo delle sostanze chimiche. Al fine di ottenere un'elevata affidabilità e riproducibilità, lo sviluppo di linee guida standardizzate è di vitale importanza. Per i test di tossicità delle alghe, le linee guida richiedono condizioni stabili e uniformi di parametri come pH, temperatura, livelli di anidride carbonica e intensità della luce. I nanomateriali e altre cosiddette sostanze difficili possono interferire con la luce causando una grande variazione nei risultati ottenuti ostacolando la loro accettazione normativa. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). L'installazione utilizza l'illuminazione a LED dal basso, consentendo una distribuzione omogenea della luce e il controllo della temperatura, riducendo al minimo l'ombreggiatura intra-campione. L'installazione ottimizza il volume del campione per la quantificazione della biomassa e allo stesso tempo garantisce un afflusso sufficiente di CO2 per supportare la crescita esponenziale delle alghe. Inoltre, il materiale dei contenitori di prova può essere adattato per ridurre al minimo l'assorbimento e la volatilizzazione. Durante la sperimentazione di sostanze colorate o sospensioni di particelle, l'uso di luci a LED consente anche di aumentare l'intensità della luce senza ulteriore generazione di calore. Il design compatto e i requisiti minimi di equipaggiamento aumentano le possibilità di implementazione del LEVITATT in una vasta gamma di laboratori. Pur essendo conforme alle linee guida standardizzate ISO e OCSE per i test di tossicità delle alghe, LEVITATT ha anche mostrato una minore variabilità tra campioni per due sostanze di riferimento (3,5-Dicholorophenol e K2Cr2O7) e tre nanomateriali (nO, CeO2e BaSO4) rispetto ai flaconi di Erlenmeyer e alle piastre microtitero.
Introduction
Il test di tossicità delle alghe è uno dei soli tre test obbligatori utilizzati per generare i dati di ecotossicità necessari per la registrazione pre e post-mercato di sostanze chimiche da parte delle normative europee e internazionali (ad esempio, REACH1 e TSCA (USA)). A tale scopo, le organizzazioni internazionali hanno sviluppato linee guida standardizzate per i test delle alghe (ad esempio, ISO e OCSE). Questi standard di test e linee guida prescrivono condizioni di prova ideali in termini di pH, temperatura, livelli di anidride carbonica e intensità della luce. Tuttavia, mantenere condizioni di prova stabili durante i test delle alghe è in pratica difficile e i risultati soffrono di problemi di riproducibilità e affidabilità per una serie di sostanze chimiche e nanomateriali (spesso indicati come "sostanze difficili")2. La maggior parte delle configurazioni di test di tossicità delle alghe esistenti operano con volumi relativamente grandi (100-250 mL) situati su uno shaker orbitale all'interno di un'incubatrice. Tale impostazione limita il numero di concentrazioni di prova e replica volumi raggiungibili e elevati di coltura algale e materiale di prova. Inoltre, queste configurazioni raramente hanno un campo di luce uniforme e condizioni di illuminazione affidabili sono inoltre difficili da ottenere in grandi flaconi, in parte come l'intensità della luce diminuisce esponenzialmente più la luce viaggia e in parte a causa della geometria del fiasche. Le configurazioni alternative comprendono microtiter di plastica3 piastre contenenti piccoli volumi di campioni che non consentono volumi di campionamento adeguati per misurare il pH, misurazioni aggiuntive della biomassa, estrazione di pigmenti o altre analisi che richiedono un campionamento distruttivo. Una sfida particolare utilizzando le configurazioni esistenti per il test di tossicità algale di nanomateriali e sostanze che formano sospensioni colorate è l'interferenza o il blocco della luce disponibile per le cellule algali, spesso indicato come "ombreggiatura"4,5. L'ombreggiatura può verificarsi all'interno delle fiale dal materiale di prova e/o dalle interazioni tra il materiale di prova e le cellule algali, o l'ombreggiatura può verificarsi tra le fiale, a causa del loro posizionamento rispetto all'altro e della fonte di luce.
Il metodo si basa sull'impostazione del test di tossicità delle alghe su piccola scala introdotto da Arensberg et al.6 che consente di testare in conformità con standard quali OCSE 2017e ISO 86928. Il metodo è ulteriormente ottimizzato per affrontare le limitazioni sopra indicate da: 1) utilizzando la tecnologia della luce a LED per garantire condizioni di luce uniformi con una generazione minima di calore, 2) fornendo un volume campione adeguato per l'analisi chimico-biologica mantenendo costante il pH, i livelli di CO2 e 3) consentendo l'uso di materiale contenitore di prova versatile per la sperimentazione di sostanze volatili o sostanze con un elevato potenziale di assorbimento.
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Protocol
1. Descrizione dell'impostazione LEVITATT
- Utilizzare fiale di vetro scintillante da 20 mL(Figura 1, inserto 1) che consente la penetrazione della luce. In alternativa, è possibile utilizzare fiale di plastica penetrabili leggere. Quantificare l'intensità della luce utilizzando un fotometro.
- Utilizzare almeno una sospensione di prova di 4 mL all'inizio del test per consentire la quantificazione della biomassa e per la caratterizzazione/quantificazione dei nanomateriali durante e dopo l'incubazione (Figura 1, inserire 2).
- Montare le fiale di scintillazione di 20 mL con un tappo(Figura 1, inserto 3) dove viene forato un piccolo foro (circa 1 mm di diametro) per consentire lo scambio di CO2 con l'atmosfera. Questo scambio è fondamentale per garantire livelli stabili di pH e CO2 durante i test.
- Per le sostanze volatili, utilizzare un tappo rivestito in Teflon a tenuta d'aria per consentire l'arricchimento di CO2 dello spazio della testautilizzando una siringa 9 o flaconi completamente chiusi senza fase di gas in cui la CO2 viene mantenuta in soluzione da un sistema di tampone di sodio arricchito (NaHCO3)10.
- Fissare le fiale con morsetti montati sull'involucro esterno (Figura 1, inserire 4).
- Utilizzare una sorgente luminosa a LED situata sotto le fiale di prova(Figura 1, inserto 5) che fornisca un'illuminazione fluorescente uniforme di tipo "cool-white" o "daylight" e un'intensità di luce nell'intervallo 60-120-E∙m -2∙s-1 misurato nell'intervallo di lunghezza d∙ onda fotosinteticamente efficace di 400 nm a 700 nm. L'installazione impiega un'intensità di luce regolabile nell'intervallo 5∙-E∙m-2∙-1 montando un dimmer leggero alla sorgente. Ciò consente di testare intensità di luce sempre più elevate.
- Montare l'installazione su uno shaker orbitale per agitare i campioni per tutta la durata del test. Ciò mantiene le celle in sospensione libera e facilita il trasferimento di massa di CO2 dall'aria all'acqua(Figura 1, inserto 6).
- Posizionare l'installazione in una stanza a temperatura controllata o in un armadio termostatico per mantenere temperature stabili durante i test(Figura 1, inserire 7).
Figura 1: Immagine della tabella di illuminazione verticale a LED per i test di tossicità delle alghe (LEVITATT). 1) 20 mL di vetro per l'incubazione, 2) campione da 4 mL per l'analisi, 3) coperchio con foro forato per lo scambio di CO2, 4) involucro per condizioni di luce definite, 5) sorgente luminosa a LED situata al centro dell'involucro, 6) agitatore orbitale per l'agitazione durante l'esperimento e 7) un armadio termostatico. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Preparazione del mezzo di crescita delle alghe
- Il mezzo di crescita delle alghe ISO 8692 è costituito da quattro diverse soluzioni azionarie. Pesare la quantità appropriata di sali e diluire in acqua ultrapura secondo la tabella 1.
| Soluzioni stock | Nutriente | Concentrazione nella soluzione stock | Concentrazione nella soluzione di test |
| 1: Macronutrienti | NH4Cl | 1,5 g/L | 15 mg/L (N: 3,9 mg/L) |
| MgCl2∙6H2O | 1,2 g/L | 12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L) | |
| CaCl2∙2H2O | 1,8 g/L | 18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L) | |
| MgSO4∙7H2O | 1,5 g/L | 15 mg/L (S: 1,95 mg/L) | |
| KH2PO4 | 0,16 g/L | 1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L) | |
| 2: Fe-EDTA | FeCl3∙6H2O | 64 mg/L | 64 g/L (Fe: 13 g/L) |
| Na2EDTA∙2H2O | 100 mg/L | 100 g/L | |
| 3: Traccia elementi | H3BO3a | 185 mg/L | 185 g/L (B: 32 g/L) |
| MnCl2∙4H2O | 415 mg/L | 415 g/L (Mn: 115 g/L) | |
| Cl2 | 3 mg/L | 3 g/L (n: 1,4 g/L) | |
| CoCl2∙6H2O | 1,5 mg/L | 1,5 g/L (Co: 0,37 g/L) | |
| CuCl2∙2H2O | 0,01 mg/L | 0,01 g/L (Cu: 3,7 ng/L) | |
| Na2MoO4∙2H2O | 7 mg/L | 7 g/L (Mo: 2,8 g/L) | |
| 4: NaHCO3 | NaHCO3 | 50 g/L | 50 mg/L (C: 7,14 mg/L) |
Tabella 1: Concentrazioni di sostanze nutritive nelle soluzioni di stock per il mezzo di crescita delle alghe
NOTA: H3BO3 può essere disciolto aggiungendo 0,1 M NaOH. L'EDTA deve essere rimosso durante la prova dei metalli, per evitare la complessità con gli ioni metallici. Sterilizzare le soluzioni di stock per filtrazione a membrana (diametro dei pori medio 0,2 m) o mediante autoclaving (120 gradi centigradi, 15 min). Non fare soluzioni di stock autoclave 2 e 4, ma sterilizzarli mediante filtrazione della membrana. Conservare le soluzioni al buio a 4 gradi centigradi.
- Per produrre 1 L di mezzo di crescita algale, trasferire 500 mL di acqua ultrapura sterilizzata in una fiaschetta volumetrica sterilizzata da 1 L e aggiungere 10 mL di soluzione di stock 1: Macronutrienti, 1 mL di soluzione di stock 2: Fe-EDTA, 1 mL di soluzione di stock 3: elementi di traccia e 1 mL di soluzione di stock 4: NaHCO3.
- Riempire fino a 1 L con acqua ultrapura sterilizzata, fermare il pallone e agitare accuratamente per omogeneizzare il mezzo di crescita delle alghe.
- Equilibrare la soluzione prima dell'uso lasciandola durante la notte a contatto con l'aria o gorgogliando con aria sterile e filtrata per 30 min. Dopo l'equilibrio, regolare il pH, se necessario, su pH 8,1 ± 0,2, con 1 M HCl o 1 M NaOH.
3. Impostazione del test algale
NOTA: un diagramma di flusso della procedura di test algale è illustrato nella Figura 2.
Figura 2: diagramma di flusso della configurazione di test algale. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Preparare una soluzione di stock del composto di prova alla concentrazione di prova più elevata desiderata nel mezzo di crescita delle alghe preparato secondo il punto 2. Per la preparazione di soluzioni/sospensioni azionarie, seguire OCSE 201 (per composti solubili) o OCSE 318 (per i nanomateriali).
- Misurare il pH nella soluzione stock. Se si discosta più di un'unità dal mezzo di crescita delle alghe, regolare il pH a 8 con 1 M HCl o 1 M NaOH.
- Calcolare il volume di inoculum necessario per raggiungere una concentrazione finale di cellule di 1 x 104 cellule/mL in una soluzione di prova a 25 mL.
NOTA: L'inoculum dovrebbe provenire da una cultura di Raphidocelis subcapitata in crescita esponenziale incontaminata coltivata utilizzando l'impostazione LEVITATT. - Calcolare la quantità di soluzione di stock da aggiungere a ogni pallone volumetrico da 25 mL per ottenere le concentrazioni di prova desiderate. Il fattore tra ciascuna concentrazione non deve superare il 3,2.
- Contrassegnare una fiaschetta volumetrica da 25 mL per ogni concentrazione scelta e un ulteriore controllo marcato di flacone volumetrico da 25 mL.
- Aggiungere la quantità di soluzione di stock del composto di prova necessaria per raggiungere le concentrazioni desiderate al pallone volumetrico da 25 mL. Non aggiungere la soluzione stock al controllo.
- Aggiungere il supporto ad ogni pallone volumetrico da 25 mL per raggiungere un volume di circa 20 mL.
- Aggiungere il volume di inoculum calcolato al punto 3.3 ad ogni pallone volumetrico da 25 mL. Aggiungere il supporto ad ogni pallone volumetrico da 25 mL ad un volume totale finale di 25 mL.
- Fermare i flaconi e mescolare accuratamente girando i flaconi due volte verticalmente.
- Trasferire 0,4 mL da ogni pallone in singole fiale a vite e aggiungere 1,6 mL di acetone (saturato con MgCO3):un campione per ogni concentrazione di prova e il controllo. Chiudere i coperchi e conservare al buio a temperatura ambiente fino a quando non vengono misurate la fluorescenza (sezione 4).
- Pipetto 4 mL di ogni soluzione di prova in fiale scintillante 20 mL (3 repliche per concentrazione e 5 repliche per il controllo). Coperchi a vite sulle fiale scintillanti. Ricordate che i coperchi devono avere un foro forato (circa 1 mm di diametro) per consentire lo scambio di CO2.
- Dopo 24 h, 48 h e 72 h, pipetto 0,4 mL da ogni fiala in fiale a vite e aggiungere 1,6 mL di acetone (saturo di MgCO3). Chiudere i coperchi e conservare al buio a temperatura ambiente fino a quando non vengono misurate la fluorescenza (sezione 4).
- Dopo che l'ultimo campione è stato prelevato a 72 h, mettere in comune delicatamente le tre repliche per una data concentrazione in una fiala e misurare il pH. Ripetere l'operazione per tutte le concentrazioni e il controllo. Il pH non deve deviare più di 1,5 unità dal pH iniziale per uno dei campioni misurati.
- Scaricare i liquidi rimanenti in un contenitore di rifiuti seguendo le norme e i regolamenti istituzionali.
4. Analisi dei campioni di prova delle alghe
- Utilizzare uno spettrofotometro a fluorescenza per misurare la biomassa algale (qui espressa come clorofilla A). L'emissione di picco per la clorofilla A è di 420 nm per la lunghezza d'onda di eccitazione e di 671 nm per la lunghezza d'onda delle emissioni.
- Misurare la fluorescenza di ogni singolo campione tre volte e calcolare il valore medio per ogni campione.
- Utilizzare l'equazione 1 per calcolare il tasso di crescita. La fluorescenza misurata (unità relative) può essere utilizzata direttamente come parametro della biomassa nell'equazione 1.
Equazione 1: μ (ln Nt – ln N0) / t
dove μ è il tasso di crescita (d-1), N0 è la biomassa iniziale, Nt è la biomassa al tempo t e t è la lunghezza del periodo di prova (d). Si noti che N0 e Nt devono essere espressi nella stessa unità. - Utilizzare un software statistico per adattare una curva di regressione non lineare (ad esempio, una funzione log-logistica o Weibull) ai dati del tasso di crescita per ottenere valori di concentrazione effettivi al 10%, 20% e 50% di inibizione. Nelle informazioni supplementari è fornito un esempio di codice per l'adattamento del software statistico R utilizzando il pacchetto DRC11.
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Representative Results
Viene effettuata una prova iniziale con una sostanza di riferimento per determinare la sensibilità del ceppo algale. Le sostanze di riferimento regolarmente utilizzate per R. subcapitata sono dicromate di potassio e 3,5-Dichlorphenol7,8. La figura 3 e la tabella 2 mostrano un risultato rappresentativo di una prova algale che include il raccordo a curva e i risultati statistici quando il pacchetto RDC in R viene applicato ai tassi di crescita.
Figura 3: Curva rappresentativa di concentrazione-risposta per l'esposizione di 72 h di un composto chimico alle alghe (R. subcapitata). La linea solida rappresenta l'adattamento log-logistico e l'area ombreggiata è l'intervallo di confidenza del 95% per la vestibilità. I cerchi aperti rappresentano il tasso di crescita calcolato per ogni replica. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| EC10 | EC20 | EC50 | |
| [mg/L] | [mg/L] | [mg/L] | |
| Composto chimico | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
Tabella 2: Concentrazioni effettive rappresentative per il 10%, 20% e 50% di inibizione del tasso di crescita per un composto chimico che utilizza alghe (R. subcapitata). Il valore tra parentesi quadre rappresenta l'intervallo di confidenza del 95% di un raccordo log-logistico.
Un test di successo avrà tassi di crescita superiori a 0,9 d-1 per conformarsi alle linee guida dell'OCSE e 1,5 d-1 per conformarsi alle linee guida ISO 8692 e dovrebbe contenere almeno una concentrazione tra lo 0% e il 100% di inibizione. Bassi tassi di crescita possono verificarsi a causa di vari problemi come la contaminazione batterica o inoculum non essere nella fase di crescita esponenziale all'inizio del test. L'analisi microscopica delle repliche dovrebbe mostrare solo alghe verdi uniformi a forma di falce (R. subcapitata) con dimensioni di circa 2 m di larghezza e 8 m di lunghezza. Se una singola replica è contaminata, può essere omessa e l'analisi può essere effettuata senza questi dati. Tuttavia, se più repliche sono contaminate, ripetere l'esperimento con inoculo in crescita esponenziale incontaminato. Per valutare se l'inoculum era nella fase di crescita esponenziale all'inizio del test, calcolare il tasso di crescita del controllo si replica a intervalli di 24 h e utilizzare solo l'intervallo di tempo in cui la crescita algale del controllo è esponenziale per l'analisi statistica.
Per testare la robustezza dell'installazione, è stato ripetuto un test di tossicità utilizzando due sostanze di riferimento (K2Cr2O7 e 3,5-Dichlorophenol) e tre nanomateriali (3,5-Dichlorophenol, BaSO4 nanoparticelle (NM-220) e nanoparticelle di znO (NM-111)) e quattro volte (K2Cr2O7 e CeO2 nanoparticelle (NM-212)). I risultati hanno mostrato un coefficiente di variazione dei valori EC50compresi tra l'11% e il 39%, con il coefficiente di variazione più basso osservato per le nanoparticelle di znO (NM-111) e il coefficiente più elevato di variazione per le nanoparticelle CeO2 (NM-212)(tabella 3).
| Composto | N. di esperimenti | Coefficiente di variazione interse campionaria per il tasso di crescita % |
EC50 (media) mg/L |
Coefficiente di variazione per i valori EC50 % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3,5-Diclorofenolo | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| CeO2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
Tabella 3: Risultati di un test interno di tossicità di laboratorio con R. subcapitata esposto per 72 h a due sostanze di riferimento e tre nanomateriali dal deposito del CCR
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Discussion
Il fitoplancton converte l'energia solare e l'anidride carbonica in materia organica e detiene quindi un ruolo fondamentale nell'ecosistema acquatico. Per questo motivo, i test di inibizione del tasso di crescita delle alghe sono inclusi come uno dei tre test obbligatori di tossicità acquatica necessari per la valutazione del rischio regolamentare delle sostanze chimiche. La capacità di eseguire un test di tossicità algale affidabile e riproducibile è fondamentale a questo proposito. Le configurazioni di prova con flaconi Erlenmeyer introducano una serie di variabilità e inconvenienti, come descritto nell'introduzione. Per aggirare questo problema, sono state proposte piastre di microtiter3. Mentre le piastre di microtiter riducono al minimo il volume e lo spazio necessari per i test, sono state sollevate preoccupazioni in letteratura per quanto riguarda la conformità di tali configurazioni con i criteri di validità del test delle linee guida di prova6. Ad esempio, la perdita significativa di sostanze chimiche semivolanze e cross-over ad altri pozzi in piastre di microtiter a 37 gradi centigradi nei supporti di crescita cellulare (DMEM GluteMAX, Opti-MEM e Hams F12 GlutaMAX) è stata recentemente dimostrata da Birch et al.12. La prova di sostanze volatili può essere condotta con successo con l'installazione leVITATT utilizzando 1) fiale chiuse con CO2 arricchito headspace9, 2) dosando direttamente il composto volatile attraverso lo spaziodi testa 13 o in una fiala di provariempita 10. In termini di requisiti di spazio, LEVITATT fornisce una configurazione di prova che colma il divario tra le piastre del microtitro e le configurazioni della fiaschetta Erlenmeyer, pur fornendo benefici da entrambe le configurazioni, ad esempio, mantenendo un ambiente di test conciso e compatto e un volume di prova sufficiente per il campionamento distruttivo (ad esempio, per la caratterizzazione dei nanomateriali durante il test).
La variabilità tra campioni per il sistema di test LEVITATT variava dal 3,4% (3,5-Dichlorophenol e nO NP) al 5,6% (BaSO4 NP). Ciò rientra nel requisito del coefficiente di variazione della crescita media delle colture di controllo7 replica del 15% indicato dalle linee guida 201 dell'OCSE 201 (per la variabilità intersezzante LEVITATT sono state incluse anche tutte le esposizioni).
La riproducibilità per quanto riguarda i valori EC50dell'impostazione di prova per le sostanze di riferimento ha mostrato un coefficiente di varianza del 13% per K2Cr2O7 (n - 4) e del 21% per 3,5-Dichlorophenol (n - 3). Ciò è paragonabile ai test effettuati con i tradizionali bioassays di flacone Erlenmeyer da 250 mL per la sostanza di riferimento K2Cr2O7 che mostrano il 16,8%14 e il 25,4%15 coefficiente di variazione per i valori EC50. Le piastre di microtitro hanno mostrato un coefficiente di variazione inferiore per alcune sostanze di riferimento (ad esempio, K2Cr2O7 (9%14,15), mentre sono stati osservati coefficienti di variazione più elevati per il fenolo (34,9%16) e il Diclorofenolo (38%17). Informazioni limitate sono disponibili per quanto riguarda la riproducibilità degli studi con nanomateriali. Tuttavia, confrontando il coefficiente di variazione tra campioni per gli NP di NP di NP utilizzando il sistema LEVITATT (3,4%) con piastre di microtiter (67%18) o flaconi Erlenmeyer (13%19 e 35%20) ha meno variazione. Per testare ulteriormente la robustezza del sistema LEVITATT, è stato avviato uno studio round robin di due materiali di prova (una sostanza di riferimento e una di sostanza difficile da testare).
Mantenere una cultura algale incontaminata può essere difficile se non gestito in condizioni sterili. La crescita esponenziale delle alghe è un prerequisito fondamentale per l'esecuzione di test delle alghe guida. Misurare la crescita in più punti di tempo (ad esempio, 24 h, 48 h, 72 h) può identificare se la crescita esponenziale si sta verificando durante il periodo di prova. Le fluttuazioni della temperatura e del pH possono influenzare la crescita delle alghe; pertanto, questi parametri devono essere stabili per tutto il periodo di prova. In piccoli volumi di campione di prova, le fluttuazioni della temperatura e del pH si verificano più rapidamente rispetto a volumi più grandi e le questioni pratiche di misurazione di questi parametri sono sempre più difficili con la diminuzione del volume di prova. Parametri come il pH e la temperatura con volume di prova di 4 mL sono stati stabili durante un periodo di prova di 72 h nel LEVITATT sia in una stanza a temperatura controllata a 20 gradi centigradi ± 2 gradi centigradi che in un'incubatrice ± condizioni simili.
I metodi analitici per la quantificazione della crescita delle alghe sono molti: il conteggio delle cellule in un emocitometro, un contatore di coulter o fluorescenza di estratti di pigmento. Per le sostanze difficili, si dovrebbe fare delle considerazioni per quanto riguarda il metodo più adatto per la quantificazione della biomassa. Per le nanoparticelle di ossido di metallo, la fluorescenza degli estratti di pigmento è stata trovata per eseguire meglio a causa dell'interferenza degli agglomerati quando si contano le alghe per emocitometro o contatore coulter21. Al contrario, Farkas e Booth22 hanno scoperto che la quantificazione della biomassa mediante fluorescenza non era un metodo adatto per il test di ecotossicità dei nanomateriali a base di carbonio a causa dell'autofluorescenza e dell'assorbimento dei pigmenti ai nanomateriali. Per le sostanze colorate, ci può anche essere interferenza del colore con il segnale di emissione di fluorescenza, quindi, che richiede ulteriori controlli o diluizione ad un livello in cui questa interferenza è trascurabile.
Nel documento di orientamento per il test di tossicità acquatica di sostanzedifficili 2, una delle raccomandazioni per testare materiali colorati è quello di aumentare l'intensità della luce. Allo stesso modo, è stata menzionata una maggiore intensità luminosa per aggirare i problemi di ombreggiatura durante il test deinanomateriali 23,24. Tuttavia, tali modifiche sono spesso associate all'aumento delle temperature, quindi, che richiedono ulteriore raffreddamento o ventilazione dei campioni. Nella configurazione leVITATT, questo viene risolto utilizzando la luce a LED che produce poco calore rispetto alle lampadine convenzionali o ai tubi fluorescenti. Inoltre, la scelta di un LED con un'uscita di intensità luminosa sufficientemente elevata e l'installazione di un dimmer consentono di aumentare l'intensità della luce per testare sostanze colorate o nanomateriali e sostanze chimiche regolari senza alterare la configurazione complessiva tra i test. Inoltre, il posizionamento della sorgente luminosa sotto i campioni e in involucri separati consente un campo luminoso coerente e omogeneo.
In conclusione, il LEVITATT fornisce una piattaforma compatta per i test di tossicità delle alghe di sostanze chimiche regolari conformi alle linee guida standardizzate internazionali. Inoltre, l'installazione fornisce una solida piattaforma per testare sostanze difficili che interferiscono con il passaggio della luce verso l'algale, ad esempio i nanomateriali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata finanziata da PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
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