Summary
Мы демонстрируем тестирование токсичности водорослей на сложные вещества (например, цветные вещества или наноматериалы) с помощью установки, освещенной вертикально со светодиодом.
Abstract
Данные об экотоксичности являются обязательным требованием для предварительной и постпроданной регистрации химических веществ европейскими и международными правилами (например, REACH). Тест на токсичность водорослей часто используется при оценке регулятивного риска химических веществ. Для достижения высокой надежности и воспроизводимости жизненно важно разработать стандартизированные руководящие принципы. Для тестирования токсичности водорослей руководящие принципы требуют стабильных и равномерных условий таких параметров, как рН, температура, уровень двуокиси углерода и интенсивность света. Наноматериалы и другие так называемые сложные вещества могут мешать свету, вызывая большие различия в полученных результатах, препятствующих их регулятивной принятию. Для решения этих проблем мы разработали LEVITATT (LED Vertical Illumination Table для испытаний токсичности водорослей). Установка использует светодиодное освещение снизу, что позволяет однородное распределение света и контроль температуры, а также минимизации внутри образец затенения. Установка оптимизирует объем выборки для количественной оценки биомассы и в то же время обеспечивает достаточный приток CO2 для поддержки экспоненциального роста водорослей. Кроме того, материалы тестовых контейнеров могут быть адаптированы для минимизации adsorption и volatilization. При тестировании цветных веществ или суспензий частиц использование светодиодных фонарей также позволяет увеличить интенсивность света без дополнительной тепловой генерации. Компактный дизайн и минимальные требования к оборудованию увеличивают возможности для внедрения LEVITATT в широком диапазоне лабораторий. В соответствии со стандартизированными руководящими принципами ИСО и ОЭСР по тестированию токсичности водорослей, LEVITATT также показал более низкую межпробную изменчивость для двух эталонных веществ (3,5-dicholorophenol и K2Cr2O7)и трех наноматериалов (NonO, CeO2, и BaSO4) по сравнению с Флябами и микротлорными пластинами Erlenmeyer.
Introduction
Тест на токсичность водорослей является одним из трех обязательных тестов, используемых для получения данных об экотоксичности, необходимых для предварительной и постпродающей регистрации химических веществ европейскими и международными правилами(например, REACH 1 и TSCA (США)). С этой целью международные организации (например, ИСО и ОЭСР) разработали стандартизированные руководящие принципы тестирования на водоросли. Эти стандарты и руководящие принципы тестирования предписывают идеальные условия тестирования с точки зрения рН, температуры, уровня углекислого газа и интенсивности света. Тем не менее, поддержание стабильных условий испытаний во время испытаний водорослей на практике трудно и результаты страдают от проблем с воспроизводимостью и надежностью для целого ряда химических веществ и наноматериалов (часто называют "трудные вещества")2. Большинство существующих установок по тестированию токсичности водорослей работают с относительно большими объемами (100-250 мл), расположенными на орбитальном шейкере внутри инкубатора. Такая установка ограничивает количество тестовых концентраций и воспроизводит достижимые и большие объемы водорослей культуры и испытательного материала. Кроме того, эти установки редко имеют равномерное световое поле и надежные условия освещения, кроме того, трудно получить в больших колбы, отчасти как интенсивность света уменьшается экспоненциально дальше свет путешествует и отчасти из-за геометрии колбы. Альтернативные установки включают пластиковые микротитр3 пластины, содержащие небольшие объемы выборки, которые не позволяют адекватные объемы выборки для измерения рН, дополнительные измерения биомассы, извлечения пигмента или других анализов, требующих разрушительной выборки. Одной из конкретных проблем, использующих существующие установки для тестирования токсичности водорослей наноматериалов и веществ, образующих цветные суспензии является вмешательство или блокирование света, доступного для водорослей клеток, часто называют "затенение"4,5. Затенение может происходить во флаконах испытательным материалом и/или взаимодействиями между испытательным материалом и клетками водорослей, или затенение может происходить между флаконами, из-за их позиционирования относительно друг друга и источника света.
Метод основан на мелкомасштабной установке теста токсичности водорослей, введенной Arensberg et al.6, которая позволяет проводить тестирование в соответствии с такими стандартами, как OECD 2017и ISO 86928. Метод дополнительно оптимизирован для устранения ограничений, о которых говорилось выше: 1) с использованием технологии светодиодного освещения для обеспечения равномерных условий освещения с минимальной теплосысловой, 2) обеспечивая достаточный объем выборки для химического/биологического анализа при сохранении постоянногорН, уровня CO 2 и 3), позволяющего использовать универсальный испытательный контейнерный материал для тестирования летучих веществ или веществ с высоким потенциалом сорбиона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Описание установки LEVITATT
- Используйте 20 мл сцинтилляционных стеклянных флаконов(рисунок 1, вставьте 1), что позволяет проникновение света. Кроме того, можно использовать легкие пластиковые флаконы. Количественная оценка интенсивности света с помощью фотометра.
- Используйте по крайней мере 4 мл тестовой подвески в начале теста, чтобы обеспечить количественную оценку биомассы и для характеристики / количественной оценки наноматериалов во время и после инкубации(рисунок 1, вставьте 2).
- Fit 20 мл сцинтилляционных флаконов с крышкой(рисунок 1, вставьте 3), где небольшое отверстие пробурено (примерно 1 мм в диаметре), чтобы позволить CO2 обмена с атмосферой. Этот обмен имеет решающее значение для обеспечения стабильного уровня рН и CO2 во время тестирования.
- Для летучих веществ, используйте герметичной тефлоновой крышкой, чтобы позволить CO2 обогащения головного пространства с помощьюшприца 9 или полностью закрыты фляг без газовой фазы, в которой CO2 поддерживается в растворе обогащенного бикарбоната натрия (NaHCO3)буферная система 10.
- Закрепите флаконы зажимами, установленными на внешней оболочке(рисунок 1, вставка 4).
- Используйте светодиодный источник света, расположенный нижетестовых флаконов (рисунок 1, вставьте 5), обеспечивающий равномерное флуоресцентное освещение типа «круто-белый» или «дневной свет» и интенсивность света в диапазоне от 60 до 120МКМ -2-1, измеренный в фотосинтетически эффективном диапазоне длин волн от 400 нм до 700 нм. Установка использует регулируемую интенсивность света в диапазоне 5-160МКМ -2-1, при установке света тусклым к источнику. Это позволяет проводить тестирование при все более высокой и низкой интенсивности света.
- Намонтировать установку на орбитальном шейкере, чтобы агитировать образцы в течение всего срока испытания. Это держит клетки в свободной подвеске и облегчаетпередачу массы CO 2 из воздуха в воду(рисунок 1, вставьте 6).
- Поместите установку в комнату с температурным контролем или термостатический шкаф для поддержания стабильных температур на протяжении всеготестирования (рисунок 1, вставьте 7).
Рисунок 1: Изображение светодиодной вертикальной таблицы освещения для испытаний токсичности водорослей (LEVITATT). 1) 20 мл стеклянных сцинтилляционных флаконов для инкубации, 2) 4 мл образца для анализа, 3) крышка с пробуренные отверстия для обмена CO2, 4) корпус для определенных условий освещения, 5) светодиодный источник света, расположенный в центре корпуса, 6) орбитальный шейкер для агитации во время эксперимента, и 7) термостатический шкаф. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
2. Подготовка среды роста водорослей
- Среда роста водорослей ISO 8692 состоит из четырех различных фондовых решений. Взвесить соответствующее количество солей и разбавить в ультрапурной воде в соответствии с таблицей 1.
| Фондовые решения | Питательных веществ | Концентрация в фондовом растворе | Концентрация в тестовом решении |
| 1: Макронутриенты | NH4Cl | 1,5 г/л | 15 мг/л (N: 3,9 мг/л) |
| MgCl2No6H2O | 1,2 г/л | 12 мг/л (Мг: 2,9 мг/л) | |
| CaCl2No2H2O | 1,8 г/л | 18 мг/л (Ca: 4,9 мг/л) | |
| МгСО4No7Ч2O | 1,5 г/л | 15 мг/л (S: 1,95 мг/л) | |
| KH2PO4 | 0,16 г/л | 1,6 мг/л (P: 0,36 мг/л) | |
| 2: Фе-ЭДТА | FeCl3No6H2O | 64 мг/л | 64 мкг/л (Fe: 13 мкг/л) |
| Na2ЭДТА-2Ч2O | 100 мг/л | 100 мкг/л | |
| 3: Элементы трассировки | H3BO3a | 185 мг/л | 185 мкг/л (B: 32 мкг/л) |
| MnCl2No4H2O | 415 мг/л | 415 мкг/л (Mn: 115 мкг/л) | |
| ЗннКл2 | 3 мг/л | 3 мкг/л (Ен: 1,4 мкг/л) | |
| CoCl2No6H2O | 1,5 мг/л | 1,5 мкг/л (Ко: 0,37 мкг/л) | |
| CuCl2No2H2O | 0,01 мг/л | 0,01 мкг/л (Ку: 3,7 нг/л) | |
| Na2Моо 4No2Ч2O | 7 мг/л | 7 мкг/л (Мо: 2,8 мкг/л) | |
| 4: NaHCO3 | НаХКО3 | 50 г/л | 50 мг/л (C: 7,14 мг/л) |
Таблица 1: Концентрация питательных веществ в фондовых растворах для среды роста водорослей
ПРИМЕЧАНИЕ: H3BO3 может быть распущен путем добавления 0.1 M NaOH. EDTA следует удалить при тестировании металлов, чтобы избежать у сложности с ионами металла. Стерилизовать фондовые растворы путем мембранной фильтрации (средний диаметр поры 0,2 мкм) или путем автоклавирования (120 градусов по Цельсию, 15 мин). Не автоклав фондовых растворов 2 и 4, но стерилизовать их путем мембранной фильтрации. Храните растворы в темноте при 4 градусах Цельсия.
- Чтобы произвести 1 л среды роста водорослей, перенесите 500 мл стерилизованной ультрапурной воды в стерилизованную объемную колбу объемом 1 л и добавьте 10 мл раствора бульона 1: Macronutrients, 1 мл биржевого раствора 2: Fe-EDTA, 1 мл запасного раствора 3: элементы trace и 1 мл запасного раствора 4: NaHCO3.
- Заполните до 1 л стерилизованной ультрачистой водой, остановите колбу и тщательно встряхните, чтобы гомогенизировать среду роста водорослей.
- Equilibrate раствор перед использованием, оставив его на ночь в контакте с воздухом или восходящей с стерильным, фильтрованным воздухом в течение 30 минут. После эквилибрации отрегулируйте рН, при необходимости, до рН 8,1 ± 0,2, либо с 1 M HCl или 1 M NaOH.
3. Настройка водорослей тест
ПРИМЕЧАНИЕ: Диаграмма потока процедуры испытания водорослей показана на рисунке 2.
Рисунок 2: Диаграмма потока установки водорослей испытания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Подготовье запасное решение испытательного соединения при желаемой самой высокой тестовой концентрации в среде роста водорослей, подготовленной в соответствии с шагом 2. Для подготовки фондовых решений/приостановки следуйте ОЭСР 201 (для растворимых соединений) или ОЭСР 318 (для наноматериалов).
- Измерьте рН в биржевом растворе. Если он отклоняется более чем на одну единицу от среды роста водорослей, отрегулируйте рН до 8 либо с 1 M HCl или 1 M NaOH.
- Рассчитайте объем инокулума, необходимый для достижения конечной концентрации клеток 1 х10 4 клеток/мл в тестовом растворе 25 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: inoculum должны исходить от культуры незагрязнено экспоненциально растет Raphidocelis subcapitata выросли с использованием установки LEVITATT. - Рассчитайте количество запасов раствора, чтобы добавить к каждому 25 мл объемной колбы, чтобы получить желаемые концентрации теста. Коэффициент между каждой концентрацией не должен превышать 3,2.
- Отметь одну томтрическую колбу объемом 25 мл для каждой выбранной концентрации и дополнительную 25-метровую томтрическую колбу.
- Добавьте количество запасов раствора испытательного соединения, необходимого для достижения желаемых концентраций, в объемную колбу 25 мл. Не добавляйте решение по акциям в элемент управления.
- Добавьте среду к каждой томной колбе объемом 25 мл, чтобы достичь объема около 20 мл.
- Добавьте объем инокулума, рассчитанный в шаге 3,3 к каждой томной колбе 25 мл. Добавьте среду к каждой томной колбе объемом 25 мл до конечного общего объема 25 мл.
- Остановите колбы и тщательно перемешайте, повернув колбы два раза по вертикали.
- Передача 0,4 мл из каждой колбы в отдельные флаконы винт крышка и добавить 1,6 мл ацетона (насыщенный MgCO 3 ):один образецдля каждого испытания концентрации и контроля. Закройте крышки плотно и хранить в темноте при комнатной температуре до измерения флуоресценции (раздел 4).
- Pipet 4 мл каждого тестового раствора в 20 мл сцинтилляционных флаконов (3 репликации на концентрацию и 5 репликаций для управления). Винт крышки на сцинтилляционные флаконы. Помните, что крышки должны иметь просверленное отверстие (примерно 1 мм в диаметре), чтобы обеспечить обмен CO2.
- После 24 ч, 48 ч и 72 ч, пипетка 0,4 мл с каждого флакона в винт колпачок флаконы и добавить 1,6 мл ацетона (насыщенный MgCO3). Закройте крышки плотно и хранить в темноте при комнатной температуре до измерения флуоресценции (раздел 4).
- После того, как последний образец взят на 72 ч, аккуратно объединить три репликации для данной концентрации в одном флаконе и измерить рН. Повторите для всех концентраций и контроля. РН не должен отклоняться более чем на 1,5 единицы от первоначального рН для любого из измеренных образцов.
- Разгрузите оставшиеся жидкости в контейнер для отходов в соответствии с вашими институциональными правилами и правилами.
4. Анализ образцов водорослей
- Используйте флуоресценционный спектрофотометр для измерения биомассы водорослей (здесь выражается как хлорофилл А). Пиковое излучение хлорофилла А составляет 420 нм для возбудимой длины волны и 671 нм для длины волны излучения.
- Измерьте флуоресценцию каждого отдельного образца три раза и вычислите среднее значение для каждого образца.
- Используйте уравнение 1 для расчета темпов роста. Измеренная флуоресценция (относительные единицы) может быть использована непосредственно в качестве параметра биомассы в уравнении 1.
Уравнение 1: μ (ln Nt - ln N0) / t
где μ является скорость роста (d-1), N0 является начальной биомассы, Nт является биомасса на время т, и т является длина испытательного периода (d). Обратите внимание, что N0 и Nt должны быть выражены в одном блоке. - Используйте статистическое программное обеспечение для соответствия нелинейной кривой регрессии (например, функции логистики журнала или Weibull) к данным о темпах роста для получения эффективных значений концентрации на уровне 10%, 20% и 50% ингибирования. В дополнительной информации приводится пример кода для установки в статистическое программное обеспечение R с использованием пакета11 ДРК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для определения чувствительности штамма водорослей проводится первоначальный тест со эталоном вещества. Справочными веществами, регулярно используемыми для R. subcapitata, являются дихромат калия и 3,5-дихлорфенол7,,8. На рисунке 3 и в таблице 2 по показывают репрезентативный результат испытания водорослей, включая установку кривых и статистические результаты, когда пакет ДРК в R применяется к темпам роста.
Рисунок 3: Репрезентативная кривая реакции на концентрацию 72 ч воздействия химического соединения на водоросли(R. subcapitata). Твердая линия представляет собой бревенчато-логистическую подгонку, а затененная область представляет собой 95% интервал доверия для пригонки. Открытые круги представляют собой рассчитанные темпы роста для каждой репликации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| EC10 | EC20 | EC50 | |
| (мг/Л) | (мг/Л) | (мг/Л) | |
| Химическое соединение | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
Таблица 2: Представитель эффективных концентраций для 10%, 20%, и 50% ингибирование темпов роста для химического соединения с использованием водорослей (R. subcapitata). Значение в скобках представляет собой 95%-ный интервал доверия к бревенчатой логистической установке.
Успешное испытание будет иметь темпы роста выше 0,9 d-1 в соответствии с руководящим принципом ОЭСР и 1,5 д-1 в соответствии с руководящим принципом ИСО 8692 и должно содержать по крайней мере одну концентрацию между 0% и 100% торможения. Низкие темпы роста могут возникнуть в результате различных проблем, таких как бактериальное загрязнение или инокулум не в экспоненциальной фазе роста в начале теста. Микроскопическое исследование репликаций должно показывать только однородные серпообразные зеленые водоросли(R. subcapitata) с размерами примерно 2 мкм шириной и длиной 8 мкм. Если одна репликация загрязнена, она может быть опущена и анализ может быть проведен без этих данных. Однако, если несколько репликаций загрязнены, повторите эксперимент с незагрязнено экспоненциально растущим инокулем. Чтобы оценить, находится ли инокулум в фазе экспоненциального роста в начале теста, рассчитайте темпы роста контроля, реплицируемые с интервалом 24 ч, и используйте только интервал времени, с которым рост водорослей управления экспоненциальный для статистического анализа.
Чтобы проверить надежность установки, тест токсичности с использованием двух эталонных веществ (K2Cr2O7 и 3,5-дихлорфенол) и трех наноматериалов повторялся три раза (3,5-дихлорофефол, Наночастицы BaSO4 (NM-220) и наночастицы ЗНО (NM-111)) и четыре раза (K2Cr2O7 и CeO2 наночастицы (NM-212)). Результаты показали коэффициент вариации50-значений ЕС между11% и 39%, с самым низким коэффициентом вариации наблюдается для наночастиц ЗНО (NM-111) и самым высоким коэффициентом вариациидля наночастиц CeO 2 (NM-212)(таблица 3).
| Составной | Эксперименты | Меж выборочных коэффициентов изменения темпов роста % |
EC50 (в среднем) мг/л |
Коэффициент вариации значений EC50 % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3,5-дихлорфенол | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| CeO2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| NNO NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
Таблица 3: Результаты внутреннего лабораторного теста токсичности с R. subcapitata подвергаются воздействию 72 ч до двух эталонных веществ и трех наноматериалов из репозитория JRC
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Фитопланктон преобразует солнечную энергию и углекислый газ в органическое вещество и, таким образом, играет ключевую роль в водной экосистеме. По этой причине тесты на ингибирование водорослей включаются в качестве одного из трех обязательных испытаний на водную токсичность, необходимых для регулятивной оценки риска химических веществ. Способность выполнять надежный и воспроизводимый тест токсичности водорослей является ключевым в этом отношении. Тестовые установки с использованием колб Erlenmeyer вводят ряд отклонений и неудобств, описанных во введении. Чтобы обойти этот вопрос, микротитровые пластины были предложены3. В то время как пластины микротитр сводят к минимуму объем и пространство, необходимые для тестирования, в литературе были подняты опасения в отношении соблюдения таких установок критериями обоснованности тестов6. Например, недавно Береза и др. продемонстрировали значительные потери полуволатиловых химических веществ, а также перекрещение к другим скважинам в пластинах микротитров при 37 градусов по Цельсию в средствах массовой информацииклеточного роста(DMEM GluteMAX, Opti-MEM и Hams F12 GlutaMAX). Тестирование летучих веществ может быть успешно проведено с установкой LEVITATT с использованием 1) закрытых флаконов с CO2 обогащеннымпространством головы 9,2) непосредственно досируя летучие соединения черезголовное пространство 13 или в заполненной пробнойфлаконе 10. С точки зрения требований к пространству, LEVITATT обеспечивает тестовую установку, которая заполняет разрыв между пластинами микротитр и установками колбы Erlenmeyer, обеспечивая при этом преимущества от обеих установок, например, поддержание краткой и компактной тестовой среды и достаточного объема испытаний для разрушительной выборки (например, для характеристики наноматериалов во время испытания).
Меж выборка изменчивости для тестовой системы LEVITATT варьировалась от 3,4% (3,5-дихлорфенол и НП НСН) до 5,6% (BaSO4 NP). Это входит в требование коэффициента изменения среднего роста в культурах контроля репликации в размере 15%, указанного в руководстве ОЭСР 2017 (для меж выборочных изменчивостей LEVITATT были также включены все воздействия).
Воспроизводимостьв отношении EC 50-значенийтестовой установки для эталонных веществ показала коэффициент дисперсии 13% для K2Cr2O7 (n No 4) и 21% для 3,5-дихлорофефола (n No 3). Это сопоставимо с испытаниями, проведенными с обычными биоанализами колбы 250 мл Эрленмайера для эталонного вещества K2Cr2O7, показывающими 16,8%14 и 25,4%15 коэффициента вариации для EC50-значений. Микротитровые пластины показали более низкий коэффициент изменения для некоторых эталонных веществ(например,K2Cr 2 O7 (9%14,15), в то время как более высокие коэффициенты изменения наблюдались для фенола (34,9%16)и дихлорофефола (38%17). Имеется ограниченная информация о воспроизводимости исследований с использованием наноматериалов. Тем не менее, сравнивая меж выборочных коэффициентов вариации для NPS ЗНО с использованием системы LEVITATT (3,4%) с пластинами микротитр (67%18)или Флягами Erlenmeyer (13%19 и 35%20) он имеет меньше вариаций. Для дальнейшего проверки надежности системы ЛЕВИТАТ было начато круговое исследование двух испытательных материалов (одно справочное вещество и одно трудное для испытания вещества).
Поддержание незагрязненные водорослей культуры может быть трудно, если не обрабатываются в стерильных условиях. Экспоненциальный рост водорослей является ключевым условием для выполнения руководящих испытаний водорослей. Измерение роста в нескольких точках времени (например, 24 ч, 48 ч, 72 ч) может определить, происходит ли экспоненциальный рост на протяжении всего испытательного периода. Колебания температуры и рН могут влиять на рост водорослей; таким образом, эти параметры должны быть стабильными на протяжении всего испытательного периода. В небольших объемах испытательной выборки колебания температуры и рН происходят быстрее по сравнению с более крупными объемами, и практические вопросы измерения этих параметров становятся все более сложными при уменьшении объема испытаний. Параметры, такие как рН и температура с использованием объема теста 4 мл, были стабильными в течение 72 ч испытательного периода в LEVITATT как в контролируемом температурой помещении при температуре 20 градусов по Цельсию ± 2 градусов по Цельсию, так и в инкубаторе в аналогичных условиях.
Аналитических методов количественной оценки роста водорослей много: подсчет клеток в гемоцитометре, счетчик коултера или флуоресценция пигментных экстрактов. Что касается сложных веществ, то следует рассмотреть наиболее подходящий метод количественной оценки биомассы. Для наночастиц оксида металла, флуоресценция пигментных экстрактов было установлено, чтобы работать лучше всего из-за вмешательства агломератов при подсчете водорослей гемоцитометром или coulter счетчик21. В отличие от этого, Фаркаси Бут 22 обнаружили, что количественная оценка биомассы по флуоресценции не является подходящим методом для экологического тестирования углеродных наноматериалов из-за аутофторесценции и поглощения пигментов в наноматериалы. Для цветных веществ, может также быть вмешательство цвета с сигналом выброса флуоресценции, таким образом, требующих дополнительного контроля или разбавления до уровня, когда это вмешательство является незначительным.
В руководстве документа по водной токсичности тестирования сложныхвеществ 2, одна из рекомендаций для тестирования цветных материалов является увеличение интенсивности света. Аналогичным образом, повышенная интенсивность света была упомянута, чтобы обойти проблемы затенения при тестированиинаноматериалов 23,24. Однако такие изменения часто связаны с повышением температуры, что требует дополнительного охлаждения или вентиляции образцов. В установке LEVITATT, это решается с помощью светодиодного света, который производит мало тепла по сравнению с обычными лампочками или люминесцентными трубками. Кроме того, выбор светодиода с достаточно высокой интенсивностью света и установка диммера позволяют увеличить интенсивность света для тестирования цветных веществ или наноматериалов и обычных химических веществ без изменения общей установки между испытаниями. Кроме того, размещение источника света под образцами и в отдельных корпусах обеспечивает последовательное и однородное световое поле.
В заключение, LEVITATT предоставляет компактную платформу для тестирования токсичности водорослей обычных химических веществ в соответствии с международными стандартизированными руководящими принципами. Кроме того, установка обеспечивает надежную платформу для тестирования сложных веществ, которые мешают прохождению света к водорослям, например, наноматериалам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано PATROLS - Расширенные инструменты для тестирования NanoSafety, Грант соглашение 760813 в рамках Horizon 2020 научно-исследовательской и инновационной программы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
