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Environment

Una configuración a pequeña escala para pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y otras sustancias difíciles

Published: October 10, 2020 doi: 10.3791/61209

Summary

Demostramos pruebas de toxicidad algas para sustancias difíciles (por ejemplo, sustancias de color o nanomateriales) utilizando una configuración iluminada verticalmente con un LED.

Abstract

Los datos de ecotoxicidad son un requisito para el registro previo y posterior al mercado de productos químicos por normativa europea e internacional (por ejemplo, REACH). El ensayo de toxicidad de algas se utiliza con frecuencia en la evaluación del riesgo reglamentario de los productos químicos. Con el fin de lograr una alta fiabilidad y reproducibilidad, el desarrollo de directrices estandarizadas es vital. Para las pruebas de toxicidad de algas, las directrices requieren condiciones estables y uniformes de parámetros como el pH, la temperatura, los niveles de dióxido de carbono y la intensidad de la luz. Los nanomateriales y otras sustancias llamadas difíciles pueden interferir con la luz causando una gran variación en los resultados obtenidos que obstaculiza su aceptación regulatoria. Para hacer frente a estos desafíos, hemos desarrollado LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). La configuración utiliza iluminación LED desde abajo, lo que permite una distribución homogénea de la luz y un control de temperatura, al mismo tiempo que minimiza el sombreado intramuestra. La configuración optimiza el volumen de la muestra para la cuantificación de la biomasa y garantiza al mismo tiempo una afluencia suficiente deCO2 para apoyar el crecimiento exponencial de las algas. Además, el material de los contenedores de prueba se puede adaptar para minimizar la adsorción y la volatilización. Al probar sustancias de color o suspensiones de partículas, el uso de luces LED también permite aumentar la intensidad de la luz sin generación de calor adicional. El diseño compacto y los requisitos mínimos de equipamiento aumentan las posibilidades de implementación del LEVITATT en una amplia gama de laboratorios. Si bien cumplió con las directrices estandarizadas de ISO y la OCDE para las pruebas de toxicidad de algas, LEVITATT también mostró una menor variabilidad entre muestras para dos sustancias de referencia (3,5-Dicholorophenol y K2Cr2O7)y tres nanomateriales (ZnO, CeO2y BaSO4)en comparación con los matraces y las placas de microtíter Erlenmeyer.

Introduction

El ensayo de toxicidad por algas es uno de los tres únicos ensayos obligatorios utilizados para generar los datos de ecotoxicidad necesarios para el registro antes y después del mercado de productos químicos por normativas europeas e internacionales (por ejemplo, REACH1 y TSCA (EE.UU.)). Para ello, las organizaciones internacionales han elaborado directrices estandarizadas de pruebas de algas (por ejemplo, ISO y OCDE). Estas normas y directrices de prueba prescriben condiciones de prueba ideales en términos de pH, temperatura, niveles de dióxido de carbono e intensidad de la luz. Sin embargo, mantener condiciones de ensayo estables durante las pruebas de algas es en la práctica difícil y los resultados sufren problemas de reproducibilidad y fiabilidad para una serie de sustancias químicas y nanomateriales (a menudo denominados "sustancias difíciles")2. La mayoría de las configuraciones de pruebas de toxicidad de algas existentes funcionan con volúmenes relativamente grandes (100-250 ml) situados en un agitador orbital dentro de una incubadora. Tal configuración limita el número de concentraciones de prueba y replica volúmenes alcanzables y altos de cultivo de algas y material de prueba. Además, estas configuraciones rara vez tienen un campo de luz uniforme y las condiciones de iluminación fiables son además difíciles de obtener en frascos grandes, en parte como la intensidad de la luz disminuye exponencialmente cuanto más viaja la luz y en parte debido a la geometría del matraz. Las configuraciones alternativas comprenden microtíteres de plástico3 placas que contienen pequeños volúmenes de muestra que no permiten volúmenes de muestreo adecuados para medir el pH, mediciones adicionales de biomasa, extracción de pigmentos u otros análisis que requieren muestreo destructivo. Un desafío particular utilizando las configuraciones existentes para las pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y sustancias que forman suspensiones de color es la interferencia o el bloqueo de la luz disponible para las células de algas, a menudo denominada "sombreado"4,,5. El sombreado puede ocurrir dentro de los viales por el material de prueba y/o interacciones entre el material de ensayo y las células de algas, o el sombreado puede ocurrir entre viales, debido a su posicionamiento en relación entre sí y la fuente de luz.

El método se basa en la configuración de la prueba de toxicidad de algas a pequeña escala introducida por Arensberg et al.6 que permite realizar pruebas de conformidad con normas como la OCDE 2017e ISO 86928. El método se optimiza aún más para abordar las limitaciones mencionadas anteriormente por: 1) utilizando la tecnología de luz LED para garantizar condiciones de luz uniformes con una generación de calor mínima, 2) proporcionando un volumen de muestra adecuado para el análisis químico/biológico manteniendo un pH constante, niveles deCO2 y 3) lo que permite el uso de material contenedor de ensayo versátil para pruebas de sustancias volátiles o sustancias con un alto potencial de sorción.

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Protocol

1. Descripción de la configuración de LEVITATT

  1. Utilice viales de vidrio de centelleo de 20 ml(Figura 1, inserto 1) permitiendo la penetración de la luz. Alternativamente, se pueden utilizar viales de plástico penetrables ligeros. Cuantifique la intensidad de la luz utilizando un fotómetro.
  2. Utilice al menos una suspensión de prueba de 4 ml al comienzo de la prueba para permitir la cuantificación de la biomasa y la caracterización/cuantificación de nanomateriales durante y después de la incubación (Figura 1, inserto 2).
  3. Coloque los viales de centelleo de 20 ml con una tapa(Figura 1, inserto 3) donde se perfore un pequeño orificio (aproximadamente 1 mm de diámetro) para permitir el intercambio deCO2 con la atmósfera. Este intercambio es crucial para garantizar niveles estables de pH y CO2 durante las pruebas.
  4. Para sustancias volátiles, utilice una tapa recubierta de teflón hermética para permitir el enriquecimiento de CO2 del espacio de la cabeza utilizando una jeringa9 o matraces completamente cerrados sin fase gaseosa en la que el CO2 se mantenga en solución mediante un sistema tampón de bicarbonato de sodio enriquecido (NaHCO3)10.
  5. Fije los viales con abrazaderas montadas en la carcasa exterior(Figura 1, inserto 4).
  6. Utilice una fuente de luz LED situada debajo de los viales de prueba(Figura 1, inserción 5) que proporcione una iluminación fluorescente uniforme de tipo "blanco frío" o "luz diurna" y una intensidad de luz en el rango de 60–120 á-M-2s -1 medido en el rango de longitud de onda fotosintéticamente eficaz de 400 nm a 700 nm. La configuración emplea una intensidad de luz ajustable en el rango de 5–160 m-2s-1 mediante el ajuste de un atenuador de luz a la fuente. Esto permite realizar pruebas a intensidades de luz más altas y más bajas.
  7. Monte la configuración en un agitador orbital para agitar muestras durante toda la prueba. Esto mantiene las células en suspensión libre y facilita la transferencia de masa deCO2 del aire al agua(Figura 1, inserto 6).
  8. Coloque la configuración en una sala de temperatura controlada o en un gabinete termostático para mantener temperaturas estables durante las pruebas(Figura 1, inserto 7).

Figure 1
Figura 1: Imagen de la tabla de iluminación vertical LED para pruebas de toxicidad de algas (LEVITATT). 1) Viales de centelleo de vidrio de 20 ml para incubación, 2) 4 ml de muestra para análisis, 3) tapa con orificio perforado para intercambio deCO2, 4) carcasa para condiciones de luz definidas, 5) fuente de luz LED situada en el centro de la carcasa, 6) agitador orbital para agitación durante el experimento, y 7) un gabinete termostático. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparación del medio de crecimiento de algas

  1. El medio de crecimiento de algas ISO 8692 consta de cuatro soluciones de stock diferentes. Pesar la cantidad adecuada de sales y diluir en agua ultrapura según la Tabla 1.
Soluciones de stock Nutrientes Concentración en solución de stock Concentración en la solución de ensayo
1: Macronutrientes NH4Cl 1,5 g/L 15 mg/L (N: 3,9 mg/L)
MgCl2a 6H2O 1.2 g/L 12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L)
CaCl2a 2H2O 1,8 g/L 18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L)
MgSO4a 7h2O 1,5 g/L 15 mg/L (S: 1,95 mg/L)
KH2PO4 0,16 g/L 1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L)
2: Fe-EDTA FeCl3a 6H2O 64 mg/L 64 g/L (Fe: 13 g/L)
Na2EDTA-2H2O 100 mg/L 100 g/L
3: Elementos de seguimiento H3BO3a 185 mg/L 185 g/L (B: 32 g/L)
MnCl2a 4H2O 415 mg/L 415 g/L (Mn: 115 g/L)
ZnCl2 3 mg/L 3 g/L (Zn: 1,4 g/L)
CoCl2a 6H2O 1,5 mg/L 1.5 g/L (Co: 0,37 g/L)
CuCl2a 2H2O 0,01 mg/L 0.01 g/L (Cu: 3,7 ng/L)
Na2MoO4a 2H2O 7 mg/L 7 g/L (Mo: 2,8 g/L)
4: NaHCO3 NaHCO3 50 g/L 50 mg/L (C: 7,14 mg/L)

Tabla 1: Concentraciones de nutrientes en soluciones de stock para medio de crecimiento de algas

NOTA: H3BO3 se puede disolver añadiendo 0,1 M NaOH. EDTA debe retirarse al probar metales, para evitar la complejidad con iones metálicos. Esterilice las soluciones de stock por filtración por membrana (diámetro medio del poro 0,2 m) o mediante autoclavación (120 oC, 15 min). No realice las soluciones de material de autoclave 2 y 4, pero esterilícelas mediante filtración por membrana. Almacene las soluciones en la oscuridad a 4 oC.

  1. Para producir 1 L de medio de crecimiento de algas, transfiera 500 ml de agua ultrapura esterilizada a un matraz volumétrico esterilizado de 1 L y añada 10 ml de solución de stock 1: Macronutrientes, 1 ml de solución de stock 2: Fe-EDTA, 1 mL de solución de stock 3: Elementos de traza y 1 ml de solución de stock 4: NaHCO3.
  2. Llene hasta 1 L con agua ultrapura esterilizada, detenga el matraz y agite bien para homogeneizar el medio de crecimiento de algas.
  3. Equilibrar la solución antes de su uso dejándola durante la noche en contacto con el aire o burbujeando con aire estéril filtrado durante 30 min. Después del equilibrio, ajuste el pH, si es necesario, a pH 8,1 ± 0,2, con 1 M HCl o 1 M NaOH.

3. Configuración de la prueba de algas

NOTA: En la Figura 2se muestra un diagrama de flujo del procedimiento de prueba de algas.

Figure 2
Figura 2: Diagrama de flujo de la configuración de la prueba de algas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Preparar una solución de stock del compuesto de ensayo en la concentración de ensayo más alta deseada en el medio de crecimiento de algas preparado de acuerdo con el paso 2. Para la preparación de soluciones/suspensiones de stock, siga la OCDE 201 (para compuestos solubles) o la OCDE 318 (para nanomateriales).
  2. Mida el pH en la solución en stock. Si se desvían más de una unidad del medio de crecimiento de algas, ajuste el pH a 8 con 1 M HCl o 1 M NaOH.
  3. Calcular el volumen de inóculo necesario para alcanzar una concentración celular final de 1 x 104 células/ml en una solución de prueba de 25 ml.
    NOTA: El inóculo debe provenir de una cultura de raphidocelis subcapitata de crecimiento exponencial no contaminado cultivada con la configuración LEVITATT.
  4. Calcular la cantidad de solución de stock para añadir a cada matraz volumétrico de 25 ml para obtener las concentraciones de ensayo deseadas. El factor entre cada concentración no debe exceder de 3,2.
  5. Marque un matraz volumétrico de 25 ml para cada concentración elegida y un control marcado de matraz volumétrico adicional de 25 ml.
  6. Añadir la cantidad de solución de stock del compuesto de ensayo necesario para alcanzar las concentraciones deseadas al matraz volumétrico de 25 ml. No agregue una solución de stock al control.
  7. Añadir el medio a cada matraz volumétrico de 25 ml para alcanzar un volumen de aproximadamente 20 ml.
  8. Añadir el volumen de inóculo calculado en el paso 3.3 a cada matraz volumétrico de 25 ml. Añadir el medio a cada matraz volumétrico de 25 ml a un volumen total final de 25 ml.
  9. Tape los matraces y mezcle bien girando los matraces dos veces verticalmente.
  10. Transfiera 0,4 ml de cada matraz a viales de tapones de tornillo individuales y añada 1,6 ml de acetona (saturada con MgCO3):una muestra para cada concentración de ensayo y el control. Cierre bien las tapas y guárdelas en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que las mediciones de fluorescencia (sección 4).
  11. Pipet 4 ml de cada solución de ensayo en viales de centelleo de 20 ml (3 réplicas por concentración y 5 réplicas para el control). Tapa de tornillo en los viales de centelleo. Recuerde que las tapas deben tener un orificio perforado (aproximadamente 1 mm de diámetro) para permitir el intercambio deCO2.
  12. Después de 24 h, 48 h y 72 h, pipetear 0,4 ml de cada vial en viales de tapón de tornillo y añadir 1,6 ml de acetona (saturado con MgCO3). Cierre bien las tapas y guárdelas en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que las mediciones de fluorescencia (sección 4).
  13. Después de tomar la última muestra a 72 h, aduique suavemente las tres réplicas para una concentración dada en un vial y mida el pH. Repita el proceso para todas las concentraciones y el control. El pH no debe desviarse más de 1,5 unidades del pH inicial para cualquiera de las muestras medidas.
  14. Descargue los líquidos restantes en un contenedor de residuos siguiendo sus normas y reglamentos institucionales.

4. Análisis de muestras de pruebas de algas

  1. Utilice un espectrofotómetro de fluorescencia para medir la biomasa de algas (aquí expresada como clorofila A). La emisión máxima de clorofila A es de 420 nm para la longitud de onda de excitación y de 671 nm para la longitud de onda de emisión.
  2. Mida la fluorescencia de cada muestra individual tres veces y calcule el valor medio de cada muestra.
  3. Utilice la ecuación 1 para calcular la tasa de crecimiento. La fluorescencia medida (unidades relativas) se puede utilizar directamente como parámetro de biomasa en la ecuación 1.
    Ecuación 1: μ (ln Nt – ln N0) / t
    donde μ es la tasa de crecimiento (d-1), N0 es la biomasa inicial, Nt es la biomasa en el momento t, y t es la duración del período de prueba (d). Nota, N0 y Nt deben expresarse en la misma unidad.
  4. Utilice un software estadístico para ajustar una curva de regresión no lineal (por ejemplo, una función log-logística o Weibull) a los datos de la tasa de crecimiento para obtener valores de concentración efectivos en una inhibición del 10%, 20% y 50%. En la información complementaria se proporciona un ejemplo de código para el ajuste en el software estadístico R utilizando el paqueteDRC 11.

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Representative Results

Se lleva a cabo un ensayo inicial con una sustancia de referencia para determinar la sensibilidad de la cepa de algas. Las sustancias de referencia utilizadas regularmente para R. subcapitata son el dicromato de potasio y 3,5-Diclorfenol7,8. La Figura 3 y la Tabla 2 muestran un resultado representativo de una prueba de algas que incluye ajuste de curva y resultados estadísticos cuando el paquete de la RDC en R se aplica a las tasas de crecimiento.

Figure 3
Figura 3: Curva de concentración-respuesta representativa para la exposición de 72 h de un compuesto químico a las algas (R. subcapitata). La línea sólida representa el ajuste log-logistic y el área sombreada es el intervalo de confianza del 95% para el ajuste. Los círculos abiertos representan la tasa de crecimiento calculada para cada réplica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

EC10 EC20 EC50
[mg/L] [mg/L] [mg/L]
Compuesto químico 4.6 [1.8-7.5] 7.4 [4.1-11] 16.9 [11-22]

Tabla 2: Concentraciones efectivas representativas para la inhibición del 10%, 20% y 50% de la tasa de crecimiento de un compuesto químico que utiliza algas (R. subcapitata). El valor entre corchetes representa el intervalo de confianza del 95% de un accesorio log-logistic.

Una prueba exitosa tendrá tasas de crecimiento superiores a 0,9d-1 para cumplir con la directriz de la OCDE y 1,5d-1 para cumplir con la directriz ISO 8692 y debe contener al menos una concentración entre 0% y 100% inhibición. Las bajas tasas de crecimiento pueden ocurrir como resultado de varios problemas como la contaminación bacteriana o el inóculo que no está en la fase de crecimiento exponencial al comienzo de la prueba. La investigación microscópica de las réplicas sólo debe mostrar algas verdes en forma de hoz uniforme (R. subcapitata) con dimensiones de aproximadamente 2 m de ancho y 8 m de longitud. Si una sola réplica está contaminada, se puede omitir y el análisis se puede llevar a cabo sin estos datos. Sin embargo, si hay varias réplicas contaminadas, repita el experimento con inóculo de crecimiento exponencial no contaminado. Para evaluar si el inóculo estaba en la fase de crecimiento exponencial al comienzo de la prueba, calcule la tasa de crecimiento de las réplicas del control a intervalos de 24 h y utilice solo el intervalo de tiempo en el que el crecimiento de algas del control es exponencial para el análisis estadístico.

Para probar la robustez de la configuración, se repitió tres veces un ensayo de toxicidad con dos sustancias de referencia (K2Cr2O7 y 3,5-Diclorofenol) y tres nanomateriales (3,5-Diclorofenol, BaSO4 nanopartículas (NM-220), y nanopartículas ZnO (NM-111)) y cuatro veces (K2Cr2O7 y CeO2 nanopartículas (NM-212)). Los resultados mostraron un coeficiente de variación de los valores DE50CE entre el 11% y el 39%, con el coeficiente de variación más bajo observado para las nanopartículas ZnO (NM-111) y el coeficiente de variación más alto para las nanopartículas CeO2 (NM-212) (Tabla 3).

Compuesto No de experimentos Coeficiente de variación entre muestras para la tasa de crecimiento
%
EC50
(promedio)
mg/L
Coeficiente de variación para los valores EC50
%
K2Cr2O7 4 4.5 0.73 13
3,5-Diclorophenol 3 3.4 1.9 21
BasO4 NP (NM-220) 3 5.6 22 20
Ceo2 NP (NM-212) 4 4.3 13 39
ZnO NP (NM-111) 3 3.4 0.13 11

Tabla 3: Resultados de un ensayo interno de toxicidad de laboratorio con R. subcapitata expuesta durante 72 h a dos sustancias de referencia y tres nanomateriales del repositorio del CCI

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Discussion

El fitoplancton convierte la energía solar y el dióxido de carbono en materia orgánica y, por lo tanto, desempeña un papel fundamental en el ecosistema acuático. Por esta razón, las pruebas de inhibición de la tasa de crecimiento de algas se incluyen como una de las tres pruebas de toxicidad acuática obligatorias necesarias para la evaluación del riesgo reglamentario de los productos químicos. La capacidad de realizar un ensayo de toxicidad de algas fiable y reproducible es clave a este respecto. Las configuraciones de prueba con matraces Erlenmeyer introducen una gama de variedades e inconvenientes como se describe en la introducción. Para eludir esta cuestión, se han propuesto placas de microtíter3. Si bien las placas de microtíter minimizan el volumen y el espacio necesarios para las pruebas, se han planteado preocupaciones en la literatura con respecto al cumplimiento de dichas configuraciones con los criterios de validez de las pruebas de las directrices de ensayo6. Por ejemplo, la pérdida significativa de productos químicos semivolátiles, así como el cruce de otros pozos en placas de microtíter a 37 oC en medios de crecimiento celular (DMEM GluteMAX, Opti-MEM y Hams F12 GlutaMAX) fue demostrado recientemente por Birch et al.12. El ensayo de sustancias volátiles puede realizarse con éxito con la configuración de LEVITATT utilizando 1) viales cerrados con espacio de cabeza enriquecido con CO2 9, 2) dosificando directamente el compuesto volátil a través del espacio de la cabeza13 o en un vial de ensayo lleno10. En términos de requisitos de espacio, LEVITATT proporciona una configuración de prueba que llena el espacio entre las placas de microtíter y las configuraciones del matraz Erlenmeyer mientras sigue proporcionando beneficios de ambas configuraciones, por ejemplo, manteniendo un entorno de prueba conciso y compacto y suficiente volumen de prueba para el muestreo destructivo (por ejemplo, para la caracterización de nanomateriales durante la prueba).

La variabilidad entre muestras para el sistema de ensayo LEVITATT osciló entre el 3,4% (3,5-Diclorofenol y ZnO NP) y el 5,6% (BaSO4 NP). Esto está dentro del requisito del coeficiente de variación del crecimiento medio en cultivos de control de réplicas del 15% indicado por la directriz7 de la OCDE 201 (para la variabilidad de la muestra entre muestras LEVITATT también se incluyeron todas las exposiciones).

La reproducibilidad con respecto a los valores CE50de la configuración del ensayo para las sustancias de referencia mostró un coeficiente de varianza del 13 % para K2Cr2O7 (n a 4) y del 21 % para 3,5-Diclorofeno (n a 3). Esto es comparable a los ensayos realizados con bioensayos de matraz Erlenmeyer de 250 ml convencionales para la sustancia de referencia K2Cr2O7 que muestran 16,8%14 y 25,4%15 coeficiente de variación para los valores EC50-. Las placas de microtíteres han mostrado un coeficiente de variación más bajo para algunas sustancias de referencia (por ejemplo, K2Cr2O7 (9%14,15),mientras que se han observado coeficientes de variación más altos para el fenol (34,9%16) y diclorofenol (38%17). Se dispone de información limitada con respecto a la reproducibilidad de estudios con nanomateriales. Sin embargo, comparando el coeficiente de variación entre muestras para los NPs ZnO utilizando el sistema LEVITATT (3,4%) con placas de microtíter (67%18)o matraces Erlenmeyer (13%19 y 35%20) tiene menos variación. Para probar aún más la robustez del sistema LEVITATT, se ha iniciado un estudio round-robin de dos materiales de ensayo (una sustancia de referencia y otra difícil de probar).

Mantener un cultivo de algas no contaminados puede ser difícil si no se maneja en condiciones estériles. El crecimiento exponencial de algas es un requisito previo clave para realizar pruebas de algas orientaciones. La medición del crecimiento en varios puntos de tiempo (por ejemplo, 24 h, 48 h, 72 h) puede identificar si se está produciendo un crecimiento exponencial durante el período de prueba. Las fluctuaciones en la temperatura y el pH pueden influir en el crecimiento de algas; por lo tanto, estos parámetros deben ser estables durante todo el período de prueba. En pequeños volúmenes de muestra de prueba, las fluctuaciones de temperatura y pH se producen más rápidamente en comparación con volúmenes más grandes y los problemas prácticos de medición de estos parámetros son cada vez más difíciles con la disminución del volumen de prueba. Parámetros como el pH y la temperatura utilizando un volumen de prueba de 4 ml se estabilizaron durante un período de prueba de 72 horas en el LEVITATT, tanto en una sala de temperatura controlada a 20 oC ± 2 oC como en una incubadora en condiciones similares.

Los métodos analíticos para la cuantificación del crecimiento de algas son muchos: conteo celular en un hemocitociómetro, contador de coulter o fluorescencia de extractos de pigmentos. En el caso de las sustancias difíciles, deben tenerse en cuenta el método más adecuado para la cuantificación de la biomasa. Para nanopartículas de óxido metálico, se ha encontrado que la fluorescencia de extractos de pigmentos funciona mejor debido a la interferencia de los aglomerados al contar las algas mediante hemocitoómetro o coulter contador21. Por el contrario, Farkas y Booth22 encontraron que la cuantificación de la biomasa por fluorescencia no era un método adecuado para las pruebas de ecotoxicidad de nanomateriales a base de carbono debido a la autofluorescencia y la absorbancia de pigmentos para los nanomateriales. En el caso de las sustancias de color, también puede haber interferencia del color con la señal de emisión de fluorescencia, por lo tanto, que requiere controles adicionales o dilución a un nivel en el que esta interferencia sea insignificante.

En el documento de orientación para las pruebas de toxicidad acuática de sustancias difíciles2, una de las recomendaciones para el ensayo de materiales de color es aumentar la intensidad de la luz. Del mismo modo, se ha mencionado una mayor intensidad de la luz para eludir las cuestiones de sombreado al probar los nanomateriales23,24. Sin embargo, tales modificaciones se asocian a menudo con el aumento de las temperaturas, por lo tanto, que requiere refrigeración adicional o ventilación de las muestras. En la configuración LEVITATT, esto se resuelve utilizando luz LED que produce poco calor en comparación con las bombillas convencionales o tubos fluorescentes. Además, la elección de un LED con una salida de intensidad de luz suficientemente alta y la instalación de un atenuador permiten aumentar la intensidad de la luz para probar sustancias de color o nanomateriales y productos químicos regulares sin alterar la configuración general entre las pruebas. Además, la colocación de la fuente de luz por debajo de las muestras y en carcasas separadas permite un campo de luz consistente y homogéneo.

En conclusión, el LEVITATT proporciona una plataforma compacta para pruebas de toxicidad de algas de productos químicos regulares que cumplen con las directrices internacionales estandarizadas. Además, la configuración proporciona una plataforma robusta para el ensayo de sustancias difíciles que interfieren con el paso de la luz hacia el algas, por ejemplo, nanomateriales.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta investigación fue financiada por PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, acuerdo de subvención 760813 bajo el programa de investigación e innovación Horizonte 2020.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Sigma-Aldrich V179124
Ammonium chloride Sigma-Aldrich 254134
BlueCap bottles (1L) Buch & Holm A/S  9072335
Boric acid Sigma-Aldrich B0394
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich 208290
Clear acrylic sheet (40x40 cm)
Cobalt(II) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 255599
Copper(II) chloride dihydrate Sigma-Aldrich 307483
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich  E5134
Fluorescence Spectrophotometer F-7000 Hitachi
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148
Iron(III) chloride hexahydrate Sigma-Aldrich 236489
LED light source Helmholt Elektronik A/S H35161 Neutral White, 6500K
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M9272
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Manganese(II) chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich 221279
Orbital shaker IKA 2980200
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662
Raphidocelis subcapitata NORCCA NIVA-CHL1 strain
Scintillation vials (20 mL) Fisherscientific 11526325
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6014
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413
Sodium molybdate dihydrate Sigma-Aldrich 331058 
Spring clamp Frederiksen Scientific A/S 472002
Thermostatic cabinet VWR WTWA208450 Alternative: temperature controlled room
Ventilation pipe (Ø125 mm) Silvan 22605630165
Volumetric flasks (25 mL) DWK Life Sciences 246781455
Zinc chloride Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ciencias Ambientales Número 164 ecotoxicidad inhibición del crecimiento sustancias coloreadas nanomateriales Raphidocelis subcapitata OCDE 201 ISO 8692 LEVITATT
Una configuración a pequeña escala para pruebas de toxicidad de algas de nanomateriales y otras sustancias difíciles
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Skjolding, L. M., Kruse, S., Sørensen, S. N., Hjorth, R., Baun, A. A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances. J. Vis. Exp. (164), e61209, doi:10.3791/61209 (2020).

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