Summary
Vi demonstrerar algtoxicitetstestning för svåra ämnen (t.ex. färgade ämnen eller nanomaterial) med hjälp av en uppställning upplyst vertikalt med en LED.
Abstract
Ekotoxicitetsuppgifter är ett krav för förhands- och eftermarknadsregistrering av kemikalier genom europeiska och internationella bestämmelser (t.ex. Reach). Testet av algtoxicitet används ofta vid lagstiftningsriskbedömning av kemikalier. För att uppnå hög tillförlitlighet och reproducerbarhet utvecklingen av standardiserade riktlinjer är avgörande. För testning av algtoxicitet kräver riktlinjerna stabila och enhetliga förhållanden för parametrar som pH, temperatur, koldioxidnivåer och ljusintensitet. Nanomaterial och andra så kallade svåra ämnen kan störa ljus som orsakar en stor variation i erhållna resultat som hämmar deras regelacceptans. För att ta itu med dessa utmaningar har vi utvecklat LEVITATT (LED Vertical Illumination Table for Algal Toxicity Tests). Uppställningen utnyttjar LED-belysningen underifrån som möjliggör en homogen ljusfördelning och temperaturkontroll samtidigt som den minimerar skuggning med hjälp av intraprov. Uppställningen optimerar provvolymen för biomassakvantifiering och säkerställer samtidigt ett tillräckligt inflöde av CO2 för att stödja exponentiell tillväxt av algerna. Dessutom kan materialet i testbehållarna skräddarsys för att minimera adsorption och tidspressning. Vid testning av färgade ämnen eller partikelupphängningar möjliggör användningen av LED-lampor också för att öka ljusintensiteten utan ytterligare värmegenerering. Den kompakta konstruktionen och de minimala utrustningskraven ökar möjligheterna för implementering av LEVITATT i ett brett spektrum av laboratorier. Medan de var förenliga med standardiserade ISO- och OECD-riktlinjer för testning av algtoxicitet, visade LEVITATT också en lägre interprovvariabilitet för två referensämnen (3,5-Dicholorofenol och K2Cr2O7) och tre nanomaterial (ZnO, CeO2, och BaSO4) jämfört med Erlenmeyerkolvar och mikrotiterplattor.
Introduction
Testet av algtoxicitet är ett av endast tre obligatoriska tester som används för att generera de ekotoxicitetsdata som krävs för registrering av kemikalier före och efter marknaden genom europeiska och internationella bestämmelser (t.ex. Reach1 och TSCA (USA)). För detta ändamål har standardiserade riktlinjer för algtest tagits fram av internationella organisationer (t.ex. ISO och OECD). Dessa teststandarder och riktlinjer föreskriver idealiska testförhållanden vad gäller pH, temperatur, koldioxidnivåer och ljusintensitet. Att upprätthålla stabila testförhållanden under algtestning är dock i praktiken svårt och resultaten lider av problem med reproducerbarhet och tillförlitlighet för en rad kemiska ämnen och nanomaterial (ofta kallade "svåra ämnen")2. De flesta av de befintliga uppställningarna för testning av algtoxicitet fungerar med relativt stora volymer (100–250 mL) som ligger på en orbitalskaktör inuti en inkubator. En sådan inställning begränsar antalet testkoncentrationer och replikat uppnåeliga och höga volymer algodling och testmaterial. Dessutom har dessa uppställningar sällan ett enhetligt ljusfält och tillförlitliga ljusförhållanden är dessutom svåra att få tag i i stora kolvar, dels som ljusintensiteten minskar exponentiellt ju längre ljuset färdas och delvis på grund av kolvens geometri. Alternativa uppställningar omfattar mikrotiterav plast 3 plattor som innehåller små provvolymer som inte möjliggör tillräckliga provtagningsvolymer för att mäta pH, ytterligare biomassamätningar, pigmentutdragning eller andra analyser som kräver destruktiv provtagning. En särskild utmaning med hjälp av befintliga uppställningar för algtoxicitet testning av nanomaterial och ämnen som bildar färgade suspensioner är störningar eller blockering av ljuset tillgängliga för algcellerna, ofta kallad "skuggning"4,5. Skuggning kan ske inom injektionsflaska genom testmaterialet och/eller interaktioner mellan testmaterialet och algcellerna, eller skuggning kan förekomma mellan injektionsflaska, på grund av deras positionering i förhållande till varandra och ljuskällan.
Metoden bygger på den småskaliga algtoxicitetstestinställningen som införts av Arensberg et al.6 och som möjliggör provning i överensstämmelse med standarder som OECD 2017, och ISO 86928. Metoden är ytterligare optimerad för att ta itu med de begränsningar som anges ovan genom att: 1) utnyttja LED-ljustekniken för att säkerställa enhetliga ljusförhållanden med minimal värmeutveckling, 2) som ger tillräcklig provvolym för kemisk/biologisk analys med bibehållen konstant pH, CO2-nivåer, och 3) som möjliggör användning av mångsidigt testbehållarematerial för testning av flyktiga ämnen eller ämnen med en hög sorptionspotential.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beskrivning av LEVITATT-uppställningen
- Använd 20 mL scintillation glasflaskor (Figur 1, infoga 1) tillåter ljusgenomföring. Alternativt kan lätta peneerbara plastflaskor användas. Kvantifiera ljusintensiteten med hjälp av en fotometer.
- Använd minst en 4 mL testfjädring i början av testet för att möjliggöra kvantifiering av biomassa och för karakterisering/kvantifiering av nanomaterial under och efter inkubation (figur 1, skär 2).
- Montera scintillationsflaskan på 20 mL med en kapsyl (figur 1, skär 3) där ett litet hål borras (ca 1 mm i diameter) för att möjliggöra CO2-utbyte med atmosfären. Detta utbyte är avgörande för att säkerställa stabila pH- och CO2-nivåer under testningen.
- För flyktiga ämnen, använd en lufttät Teflonbelagd lock för att möjliggöra CO 2-anrikning av headspace med hjälpav en spruta 9 eller helt slutna kolvar utan gasfas i vilken CO2 bibehålls i lösning genom ett anrikat buffertsystem för natriumbikarbonat (NaHCO2 3) buffertsystem10.
- Fäst injektionsflaskan med klämmor monterade på det utvändiga höljet (Bild 1, insats 4).
- Använd en LED-ljuskälla som finns under testflaskan (bild 1, insats 5) som ger en jämn lysrörsbelysning av "cool-vit" eller "dagsljus"-typ och en ljusintensitet i området 60–120 μE∙m-2∙s-1 mätt i det fotosyntetiskt effektiva våglängdsområdet 400 nm till 700 nm. Upplägget sysselsätter justerbar ljusintensitet i intervallet 5–160 μE∙m-2∙s-1 genom att passa en ljusdimmer på källan. Detta möjliggör testning vid högre och lägre ljusintensiteter.
- Montera uppställningen på en orbitalskaktor för att agitera prover under hela testets varaktighet. Detta håller cellerna i fri suspension och underlättar CO2 massöverföring från luft till vatten (Bild 1, infoga 6).
- Placera uppställningen i ett temperaturreglerat rum eller ett termostatskåp för att hålla stabila temperaturer under hela provningen (Bild 1, skär 7).
Bild 1: Bild av LED Vertikal Belysning Tabell för Algtoxicitetstester (LEVITATT). 1) 20 mL glas scintillation injektionsflaskor för inkubering, 2) 4 mL prov för analys, 3) lock med borrat hål för CO2 utbyte, 4) hölje för definierade ljusförhållanden, 5) LED ljuskälla som ligger i mitten av höljet, 6) orbital shaker för agitation under experimentet, och 7) ett termostatskåp. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
2. Beredning av algtillväxtmedium
- Det algtillväxtmedium för ISO 8692 består av fyra olika lagerlösningar. Väg ut lämplig mängd salter och späd i ultrarent vatten enligt tabell 1.
| Aktielösningar | Näringsämne | Koncentration i lagerlösning | Koncentration i testlösning |
| 1: Makronäringsämnen | NH4Cl | 1,5 g/L | 15 mg/L (N: 3,9 mg/L) |
| MgCl2∙6H2O | 1,2 g/L | 12 mg/L (Mg: 2,9 mg/L) | |
| CaCl2∙2H2O | 1,8 g/L | 18 mg/L (Ca: 4,9 mg/L) | |
| MgSO4∙7H2O | 1,5 g/L | 15 mg/L (S: 1,95 mg/L) | |
| KH2PO4 | 0,16 g/L | 1,6 mg/L (P: 0,36 mg/L) | |
| 2: Fe-EDTA | FeCl3∙6H2O | 64 mg/L | 64 μg/L (Fe: 13 μg/L) |
| Na2EDTA∙2H2O | 100 mg/L | 100 μg/L | |
| 3: Spårelement | H3BO3a | 185 mg/L | 185 μg/L (B: 32 μg/L) |
| MnCl2∙4H2O | 415 mg/L | 415 μg/L (Mn: 115 μg/L) | |
| ZnCl2 | 3 mg/L | 3 μg/L (Zn: 1,4 μg/L) | |
| CoCl2∙6H2O | 1,5 mg/L | 1,5 μg/L (Co: 0,37 μg/L) | |
| CuCl2∙2H2O | 0,01 mg/L | 0,01 μg/L (Cu: 3,7 ng/L) | |
| Na2MoO4∙2H2O | 7 mg/L | 7 μg/L (Mo: 2,8 μg/L) | |
| 4: NaHCO3 | NaHCO3 | 50 g/L | 50 mg/L (C: 7,14 mg/L) |
Tabell 1: Koncentrationer av näringsämnen i stamlösningar för algtillväxtmedium
OBS: H3BO3 kan lösas upp genom att tillsätta 0,1 M NaOH. EDTA bör tas bort vid provning av metaller, för att undvika komplexation med metalljoner. Sterilisera stamlösningarna genom membranfiltrering (genomsnittlig pordiameter 0,2 μm) eller genom autoklavering (120 °C, 15 min). Gör ingen autoklav lager lösningar 2 och 4, men sterilisera dem genom membranfiltrering. Förvara lösningarna i mörker vid 4 °C.
- För att producera 1 L av algtillväxtmedel, överför 500 mL steriliserat ultrapure vatten till en 1 L-steriliserad volymetrisk kolv och tillsätt 10 mL stamlösning 1: Makronäringsämnen, 1 mL stamlösning 2: Fe-EDTA, 1 mL stamlösning 3: Spårelement, och 1 mL stamlösning 4: NaHCO3.
- Fyll upp till 1 L med steriliserat ultrarent vatten, proppkolven och skaka ordentligt för att homogenisera algtillväxtmediet.
- Jämviktslösningen före användning genom att den över natten övernattar i kontakt med luft eller genom att bubbla med steril, filtrerad luft i 30 min. Efter jämvikten, justera pH-värdet, om så är nödvändigt, till pH 8,1 ± 0,2, med antingen 1 M HCl eller 1 M NaOH.
3. Ställa in algtestet
OBS: Ett flödesdiagram över algtestförfarandet visas i figur 2.
Bild 2: Flödesdiagram över algtestinställningen. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
- Bered en stamlösning av testföreningen vid den önskade högsta testkoncentrationen i det algtillväxtmedium som bereds enligt steg 2. För beredning av stamlösningar/upphävanden, följ OECD 201 (för lösliga föreningar) eller OECD 318 (för nanomaterial).
- Mät pH-värdet i stamlösningen. Om den avviker mer än en enhet från algtillväxtmediet, justera pH-värdet till 8 med antingen 1 M HCl eller 1 M NaOH.
- Beräkna inokulatvolymen som behövs för att nå en slutlig cellkoncentration på 1 x 104 celler/mL i en 25 mL-testlösning.
OBS: Inokulatet bör komma från en kultur av oförorenat exponentiellt växande Raphidocelis subkapitalitata odlas med levitatt setup. - Beräkna mängden stamlösning att tillsätta i varje 25 mL-volymetrisk kolv för att erhålla önskade testkoncentrationer. Faktorn mellan varje koncentration bör inte överstiga 3,2.
- Märk en 25 mL-volymetrisk kolv för varje vald koncentration och ytterligare 25 mL volymetrisk kolv märkt kontroll.
- Tillsätt den mängd stamlösning av testföreningen som behövs för att nå de önskade koncentrationerna till 25 mL-kolven i volymetrisk typ. Lägg inte till stamlösning i kontrollen.
- Tillsätt mediet till varje 25 mL-volymetrisk kolv för att nå en volym på cirka 20 mL.
- Tillsätt volymen inokulat beräknat i steg 3.3 till varje 25 mL-volymetrisk kolv. Tillsätt mediet till varje 25 mL-volymetrisk kolv till en slutlig total volym på 25 mL.
- Proppa kolvarna och blanda noggrant genom att vrida kolvarna två gånger vertikalt.
- Överför 0,4 mL från varje kolv till enskilda skruvklocksflaskor och tillsätt 1,6 mL aceton (mättat med MgCO3): ett prov för varje testkoncentration och kontrollen. Stäng locken tätt och förvara i mörker i rumstemperatur tills fluorescensmätningar (avsnitt 4).
- Pipet 4 mL av varje testlösning i 20 mL scintillations injektionsflaska (3 replikat per koncentration och 5 replikat för kontrollen). Skruva lock på scintillationsflaskan. Kom ihåg att locken måste ha ett borrat hål (ca 1 mm i diameter) för att möjliggöra CO2-utbyte.
- Efter 24 h, 48 h, och 72 h, pipet 0.4 mL från varje injektionsflaska i skruvlocksflaska och tillsätt 1,6 mL aceton (mättad med MgCO3). Stäng locken tätt och förvara i mörker i rumstemperatur tills fluorescensmätningar (avsnitt 4).
- Efter det att det sista provet har tagits vid 72 h, poola försiktigt de tre replikaten för en given koncentration i en injektionsflaska och mäta pH-värdet. Upprepa för alla koncentrationer och kontrollen. PH-värdet bör inte avvika mer än 1,5 enheter från det initiala pH-värdet för något av de prov som uppmätts.
- Släppa ut de återstående vätskorna i en avfallsbehållare efter dina institutionella regler och föreskrifter.
4. Analysera algtestprover
- Använd en fluorescensspektrofotometer för att mäta algbiomassan (här uttryckt som klorofyll A). Topputsläppet för klorofyll A är 420 nm för excitationsvåglängden och 671 nm för emissionsvåglängden.
- Mät fluorescensen för varje enskilt prov tre gånger och beräkna genomsnittsvärdet för varje prov.
- Använd ekvation 1 för att beräkna tillväxttakten. Den uppmätta fluorescensen (relativa enheter) kan användas direkt som parametern biomassa i ekvation 1.
Ekvation 1: μ = (ln Nt – ln N0) / t
där μ är tillväxttakten (d-1), N0 är den ursprungliga biomassan, Nt är biomassan vid tiden t, och t är längden på testperioden (d). Obs, N0 och Nt ska uttryckas i samma enhet. - Använd en statistisk programvara för att passa en icke-linjär regressionskurva (t.ex. en log-logistic- eller Weibull-funktion) till tillväxthastighetsdatan för att få effektiva koncentrationsvärden vid 10 %, 20 % och 50 % hämning. I den kompletterande informationen ges ett exempel på kod för montering i den statistiska programvaran R med hjälp avDRC-paketet 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett inledande test med referensämne utförs för att bestämma algstammens känslighet. Referensämnen som regelbundet används för R. subkapitalitata är kaliumdikromat och 3,5-Dichlorphenol7,8. Figur 3 och tabell 2 visar ett representativt resultat av ett algtest inklusive kurvpassning och statistiska utdata när Drc-paketet i R tillämpas på tillväxthastigheterna.
Figur 3: Representativ koncentration-responskurva för 72 h exponering av en kemisk förening för alger (R. subcapitata). Den heldragna linjen representerar den log-logistic passformen och den skuggade ytan är 95% konfidensintervall för passformen. De öppna cirklarna representerar den beräknade tillväxttakten för varje replikat. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
| EC10 | EC20 | EC50 | |
| [mg/L] | [mg/L] | [mg/L] | |
| Kemisk förening | 4.6 [1.8-7.5] | 7.4 [4.1-11] | 16.9 [11-22] |
Tabell 2: Representativa effektiva koncentrationer för 10 %, 20 %, och 50 % hämning av tillväxthastigheten för en kemisk förening som använder alger (R. subcapitata). Värdet inom parentes representerar 95% konfidensintervallet för en log-logistic passande.
Ett lyckat test kommer att ha tillväxtsiffror över 0,9 d-1 för att följa OECD:s riktlinje och 1,5 d-1 för att uppfylla ISO 8692 riktlinjen och bör innehålla minst en koncentration mellan 0% och 100% hämning. Låga tillväxthastigheter kan uppstå till följd av olika frågor som bakteriell kontamination eller inokulat inte är i den exponentiella tillväxtfasen i början av testet. Mikroskopisk undersökning av replikaten bör endast uppvisa enhetliga sickleformade grönalger (R. subkapitalitata) med dimensioner på ungefär 2 μm bredd och 8 μm längd. Om en enda replikat är kontaminerad kan den utelämnas och analysen kan utföras utan dessa data. Men om flera replikat är förorenade, upprepa experimentet med oförorminerade exponentiellt växande inokulat. För att utvärdera om inokulat var i den exponentiella tillväxtfasen i början av testet, beräkna tillväxthastigheten för kontrollreplikaten med 24 h intervaller och använd endast det tidsintervall där kontrollens algtillväxt är exponentiell för statistisk analys.
För att testa inställningens robusthet upprepades ett toxicitetstest med hjälp av två referensämnen (K2Cr2O7 och 3,5-Diklorfenol) och tre nanomaterial tre gånger (3,5-Diklorfenol, BaSO4 nanopartiklar (NM-220), och ZnO nanopartiklar (NM-111)) och fyra gånger (K2Cr2O7 och CeO2 nanopartiklar (NM-212)). Resultaten visade en variationskoefficient för DEEG 50-värden mellan 11% och 39%, med den lägsta variationskoefficienten som observerats för ZnO nanopartiklar (NM-111) och den högsta variationskoefficienten för CeO2 nanopartiklar (NM-212) (Tabell 3).
| Sammansatta | # av experiment | Inter-sample variationskoefficient för tillväxttakt % |
EC50 (genomsnitt) mg/L |
Variationskoefficient för EC50-värden % |
| K2Cr2O7 | 4 | 4.5 | 0.73 | 13 |
| 3,5-Diklorfenol | 3 | 3.4 | 1.9 | 21 |
| BaSO4 NP (NM-220) | 3 | 5.6 | 22 | 20 |
| CeO2 NP (NM-212) | 4 | 4.3 | 13 | 39 |
| ZnO NP (NM-111) | 3 | 3.4 | 0.13 | 11 |
Tabell 3: Resultat av ett internt laboratorietoxicitetstest med R. subkapitalatan exponerat för 72 h till två referensämnen och tre nanomaterial från GFC:s förvar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Växtplankton omvandlar solenergi och koldioxid till organiskt material och har därmed en central roll i det akvatiska ekosystemet. Av denna anledning ingår hämningstester av algtillväxthastighet som ett av tre obligatoriska akvatiska toxicitetstester som krävs för en regulatorisk riskbedömning av kemikalier. Förmågan att utföra en tillförlitlig och reproducerbara algtoxicitet test är nyckeln i detta avseende. Testuppställningar med hjälp av Erlenmeyerkolvar introducerar en rad variabilities och olägenheter som beskrivs i inledningen. För att kringgå denna fråga har mikrotiter plattor föreslagits3. Medan mikrotiterplattorna minimerar den volym och det utrymme som krävs för testning, har farhågor tagits upp i litteraturen när det gäller att sådana uppställningar ska uppfylla testgiltighetskriterierna för testriktlinjer6. Till exempel, betydande förlust av semivolatila kemikalier samt cross-over till andra brunnar i mikrotiter plattor vid 37 °C i cellulära tillväxt media (DMEM GluteMAX, Opti-MEM, och Hams F12 GlutaMAX) visades nyligen av Birch et al.12. Testning av flyktiga ämnen kan med framgång ske med LEVITATT-uppställningen med hjälp av 1) slutna injektionsflaska med CO2 anrikad headspace9, 2) direkt genom att göra den flyktiga föreningen genom headspace13 eller i en fylld provflaska10. När det gäller utrymmeskraven tillhandahåller LEVITATT en testuppställning som fyller gapet mellan mikrotiterplattor och Erlenmeyerkolvuppställningar samtidigt som det fortfarande ger fördelar från båda uppställningarna, t.ex.
Variabiliteten mellan prov för LEVITATT-testsystemet varierade mellan 3,4 % (3,5-Diklorfenol och ZnO NP) till 5,6 % (BaSO4 NP). Detta ligger inom kravet på variationskoefficient för den genomsnittliga tillväxten i de replikatkontrollkulturer på 15 procent som anges i OECD 201 riktlinje7 (för LEVITATT inter-sample variabilitet inkluderades också alla exponeringar).
Reproducerbarheten med avseende på EG50-värden för testuppställningen för referensämnena visade en varianskoefficient på 13% för K2Cr2O7 (n = 4) och 21% för 3,5-Diklorfenol (n = 3). Detta är jämförbart med tester som utförs med konventionella 250 mL Erlenmeyerkolvbioassays för referenssubstansen K2Cr2O7 som visar 16,8%14 och 25,4%15 variationskoefficient för EG50-värden. Mikrotiterplattor har visat lägre variationskoefficient för vissa referensämnen (t.ex., K2Cr2O7 (9%14,15), medan högre variationskoefficienter har observerats för fenol (34,9%16) och Diklorfenol (38%17). Begränsad information finns tillgänglig med avseende på reproducerbarhet av studier med nanomaterial. Men om jämförelse av variationskoefficienten mellan urval för ZnO-NPs som använder LEVITATT-systemet (3,4 %) med mikrotiterplattor (67%18) eller Erlenmeyerkolvar (13%19 och 35%20) har den mindre variation. För att ytterligare testa robustheten i LEVITATT-systemet har en rundhakestudie av två testmaterial (ett referensämne och ett svårtestat ämne) inletts.
Att upprätthålla en oförorenad algkultur kan vara svårt om det inte hanteras i sterila förhållanden. Exponentiell algtillväxt är en viktig förutsättning för att utföra riktlinje algtestning. Mätning av tillväxten vid flera tidspunkter (t.ex. 24 h, 48 h, 72 h) kan identifiera om exponentiell tillväxt sker under hela testperioden. Fluktuationer i temperatur och pH kan påverka algtillväxten; således måste dessa parametrar vara stabila under hela testperioden. I små volymer av testprovet uppstår fluktuationer i temperatur och pH snabbare jämfört med större volymer och de praktiska frågorna om att mäta dessa parametrar blir allt svårare med minskande testvolym. Parametrar som pH och temperatur med hjälp av 4 mL-testvolym var stabila under en 72 h testperiod i LEVITATT både i ett temperaturkontrollerat rum vid 20 °C ± 2 °C och i en inkubator vid liknande förhållanden.
Analytiska metoder för kvantifiering av algtillväxt är många: cellräkning i en hemocytometer, coulter counter, eller fluorescens av pigmentextrakt. För svåra ämnen bör man ta hänsyn till den lämpligaste metoden för biomassakvantifiering. För nanopartiklar av metalloxid har fluorescens av pigmentextrakt visat sig prestera bäst på grund av interferens av agglomerater vid räkning av alger genom hemocytometer eller coulter counter21. Däremot fann Farkas och Booth22 att kvantifiering av biomassa genom fluorescens inte var en lämplig metod för ekotoxicitetstestning av kolbaserade nanomaterial på grund av autofluorescens och absorbans av pigment till nanomaterialen. För färgade ämnen kan det också finnas inblandning av färgen med fluorescensemissionssignalen, alltså, vilket kräver ytterligare kontroller eller utspädning till en nivå där denna störning är försumbar.
I vägledningsdokumentet för testning av toxicitet ivattenmiljö av svåra ämnen 2, är en av rekommendationerna för testning av färgade material att öka ljusintensiteten. På samma sätt har ökad ljusintensitet nämnts för att kringgå skuggningsproblem vid testning av nanomaterial23,24. Sådana modifieringar är dock ofta förknippade med ökade temperaturer, alltså, kräver ytterligare kylning eller ventilation av proverna. I LEVITATT-setupen löses detta med hjälp av LED-ljus som ger lite värme jämfört med konventionella glödlampor eller lysrör. Dessutom väljer en LED med en tillräckligt hög ljusintensitet utgång och installation av en dimmer möjliggör ökad ljusintensitet för att testa färgade ämnen eller nanomaterial och vanliga kemikalier utan att ändra den totala inställningen mellan testerna. Vidare möjliggör placeringen av ljuskällan under proven och i separata höljen ett konsekvent och homogent ljusfält.
Sammanfattningsvis ger LEVITATT en kompakt plattform för testning av algtoxicitet av vanliga kemikalier som överensstämmer med internationella standardiserade riktlinjer. Vidare ger uppställningen en robust plattform för testning av svåra ämnen som stör ljuspassagen mot algen, t.ex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades av PATROLS – Advanced Tools for NanoSafety Testing, Grant agreement 760813 under Horizon 2020 forsknings- och innovationsprogram.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Sigma-Aldrich | V179124 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | 254134 | |
| BlueCap bottles (1L) | Buch & Holm A/S | 9072335 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B0394 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 208290 | |
| Clear acrylic sheet (40x40 cm) | |||
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 255599 | |
| Copper(II) chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 307483 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluorescence Spectrophotometer F-7000 | Hitachi | ||
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | |
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| LED light source | Helmholt Elektronik A/S | H35161 | Neutral White, 6500K |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 221279 | |
| Orbital shaker | IKA | 2980200 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Raphidocelis subcapitata | NORCCA | NIVA-CHL1 strain | |
| Scintillation vials (20 mL) | Fisherscientific | 11526325 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| Spring clamp | Frederiksen Scientific A/S | 472002 | |
| Thermostatic cabinet | VWR | WTWA208450 | Alternative: temperature controlled room |
| Ventilation pipe (Ø125 mm) | Silvan | 22605630165 | |
| Volumetric flasks (25 mL) | DWK Life Sciences | 246781455 | |
| Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- European Chemicals Agency. Guidance on Registration. European Chemicals Agency. , Helsinki, Finland. (2016).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2019).
- Blaise, C., Legault, R., Bermingham, N., Van Coillie, R., Vasseur, P. A simple microplate algal assay technique for aquatic toxicity assessment. Toxicity Assessment. 1 (3), 261-281 (1986).
- Hjorth, R., Sorensen, S. N., Olsson, M. E., Baun, A., Hartmann, N. B. A certain shade of green: can algal pigments reveal shading effects of nanoparticles. Integrated Environmental Assessment and Management. 12 (1), 200-202 (2016).
- Chen, F., et al. Algae response to engineered nanoparticles: current understanding{,} mechanisms and implications. Environmental Science: Nano. 6 (4), 1026-1042 (2019).
- Arensberg, P., Hemmingsen, V. H., Nyholm, N. A miniscale algal toxicity test. Chemosphere. 30 (11), 2103-2115 (1995).
- Organisation for Economic Cooperation and Development. Test No. 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test. Organisation for Economic Cooperation and Development. , (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Water Quality - Fresh Water Algal Growth Inhibition Test with Unicellular Green Algae. International Organization for Standardization (ISO). , (2012).
- Halling-Sørensen, B., Nyhohn, N., Baun, A. Algal toxicity tests with volatile and hazardous compounds in air-tight test flasks with CO2 enriched headspace. Chemosphere. 32 (8), 1513-1526 (1996).
- Mayer, P., Nyholm, N., Verbruggen, E. M. J., Hermens, J. L. M., Tolls, J. Algal growth inhibition test in filled, closed bottles for volatile and sorptive materials. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (10), 2551-2556 (2000).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PloS One. 10 (12), 0146021 (2015).
- Birch, H., Kramer, N. I., Mayer, P. Time-resolved freely dissolved concentrations of semivolatile and hydrophobic test chemicals in in vitro assays-measuring high losses and crossover by headspace solid-phase microextraction. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1780-1790 (2019).
- Trac, L. N., Schmidt, S. N., Mayer, P. Headspace passive dosing of volatile hydrophobic chemicals - toxicity testing exactly at the saturation level. Chemosphere. 211, 694-700 (2018).
- Eisentraeger, A., Dott, W., Klein, J., Hahn, S. Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety. 54 (3), 346-354 (2003).
- Paixao, S. M., Silva, L., Fernandes, A., O'Rourke, K., Mendonca, E., Picado, A. Performance of a miniaturized algal bioassay in phytotoxicity screening. Ecotoxicology. 17 (3), 165-171 (2008).
- Thellen, C., Blaise, C., Roy, Y., Hickey, C. Round-robin testing with the selenastrum--capricornutum microplate toxicity assay. Hydrobiologia. 188, 259-268 (1989).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicology and Environmental Safety. 94, 37-44 (2013).
- Lee, W. M., An, Y. J. Effects of zinc oxide and titanium dioxide nanoparticles on green algae under visible, UVA, and UVB irradiations: no evidence of enhanced algal toxicity under UV pre-irradiation. Chemosphere. 91 (4), 536-544 (2013).
- Samei, M., Sarrafzadeh, M. H., Faramarzi, M. A. The impact of morphology and size of zinc oxide nanoparticles on its toxicity to the freshwater microalga, Raphidocelis subcapitata. Environmental Science and Pollution Research. 26 (3), 2409-2420 (2019).
- Neale, P. A., Jaemting, A. K., O'Malley, E., Herrmann, J., Escher, B. I. Behaviour of titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in the presence of wastewater-derived organic matter and implications for algal toxicity. Environmental Science: Nano. 2 (1), 86-93 (2015).
- Hartmann, N. B., et al. The challenges of testing metal and metal oxide nanoparticles in algal bioassays: titanium dioxide and gold nanoparticles as case studies. Nanotoxicology. 7 (6), 1082-1094 (2013).
- Farkas, J., Booth, A. M. Are fluorescence-based chlorophyll quantification methods suitable for algae toxicity assessment of carbon nanomaterials. Nanotoxicology. 11 (4), 569-577 (2017).
- Handy, R. D., et al. Practical considerations for conducting ecotoxicity test methods with manufactured nanomaterials: what have we learnt so far. Ecotoxicology. 21 (4), 933-972 (2012).
- Handy, R. D., et al. Ecotoxicity test methods for engineered nanomaterials: practical experiences and recommendations from the bench. Environmental Toxicology and Chemistry. 31 (1), 15-31 (2012).
