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Biology

Un modèle épithélial bronchique d’interface air-liquide pour l’exposition réaliste et répétée par inhalation aux particules aéroportées pour l’essai de toxicité

Published: May 13, 2020 doi: 10.3791/61210
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1National Institute for Public Health and the Environment (RIVM), 2Institute for Risk Assessment Sciences (IRAS)

Summary

Décrit est la culture cellulaire et la méthode d’exposition d’un modèle bronchique in vitro pour l’exposition réaliste et répétée par inhalation aux particules pour l’essai de toxicité.

Abstract

Pour les tests de toxicité des particules en suspension dans l’air, des systèmes d’exposition à l’interface air-liquide (ALI) ont été mis au point pour des tests in vitro afin d’imiter des conditions d’exposition réalistes. Cela impose des exigences spécifiques aux modèles de culture cellulaire. De nombreux types de cellules sont affectés négativement par l’exposition à l’air (p. ex., assèchement) et ne restent viables que pendant quelques jours. Cela limite les conditions d’exposition qui peuvent être utilisées dans ces modèles : des concentrations généralement relativement élevées sont appliquées sous forme de nuage (c.-à-d. gouttelettes contenant des particules, qui se déposent rapidement) dans un court laps de temps. De telles conditions expérimentales ne reflètent pas une exposition réaliste à long terme à de faibles concentrations de particules. Pour surmonter ces limitations l’utilisation d’une lignée cellulaire épithéliale bronchique humaine, Calu-3 a été étudié. Ces cellules peuvent être cultivés à des conditions ALI pendant plusieurs semaines tout en conservant une morphologie saine et un monocouche stable avec des jonctions serrées. En outre, ce modèle bronchique est adapté pour tester les effets des expositions répétées à de faibles concentrations réalistes de particules en suspension dans l’air à l’aide d’un système d’exposition ALI. Ce système utilise un flux d’air continu contrairement à d’autres systèmes d’exposition ALI qui utilisent une seule nébulisation produisant un nuage. Par conséquent, le système de flux continu convient à une exposition répétée et prolongée aux particules en suspension dans l’air tout en surveillant en permanence les caractéristiques des particules, la concentration d’exposition et la dose administrée. Pris ensemble, ce modèle bronchique, en combinaison avec le système d’exposition continue au débit, est capable d’imiter des conditions réalistes et répétées d’exposition par inhalation qui peuvent être utilisées pour des tests de toxicité.

Introduction

Les poumons sont vulnérables à l’exposition par inhalation aux particules en suspension dans l’air. Afin d’évaluer la toxicité potentielle des particules en suspension dans l’air, des progrès ont été réalisés dans le développement de systèmes d’exposition à l’interface air-liquide (ALI)1,2,3,4,5. Les systèmes d’exposition ALI permettent des modèles d’exposition plus pertinents et réalistes par rapport à l’exposition immergée traditionnelle par l’intermédiaire d’un milieu de culture qui modifie les caractéristiques et lacinétique des particules 6. Les systèmes d’exposition ALI mentent des exigences spécifiques sur les modèles de culture cellulaire, car les modèles manquent de milieu de culture et donc de nutriments sur le côté apical. De nombreux modèles cellulaires sont affectés négativement par la culture et l’exposition à l’air (p. ex., séchage) et ne demeurent viables que pendant quelques jours. Cela limite les conditions d’exposition qui peuvent être utilisées dans ces modèles : des concentrations généralement relativement élevées sont appliquées dans un court laps de temps comme nuage (c.-à-d. gouttelettes contenant des particules, qui se déposent rapidement). De telles conditions expérimentales ne reflètent pas une exposition réaliste à long terme à de faibles concentrations de particules; ainsi, la pertinence des résultats peut être remise en question. Pour surmonter ces limitations, le protocole de culture et d’exposition pour un modèle bronchique composé de la lignée cellulaire épithéliale bronchique humaine Calu-37 a été optimisé.

La plupart des modèles pulmonaires in vitro utilisés pour l’exposition ali contiennent d’autres lignées cellulaires telles que A549, BEAS-2B, et 16HBE14o- (16HBE) ou cellules primaires comme base8. Ces lignées cellulaires ont l’inconvénient qu’elles ne restent viables que pendant quelques jours lorsqu’elles sont cultivés à l’ALI. En outre, certaines de ces lignées cellulaires surcroissance lorsqu’elles sont cultivés pendant une période de plus de 5 jours. Enfin, les cellules A549 manquent les jonctions étroites fonctionnelles et ne peuvent donc pas former une barrière serrée qui est nécessaire pour imiter lespoumons 9,10. Les cellules épithéliales primaires pourraient être une bonne option pour l’exposition ali car elles peuvent être cultivés à l’ALI pendant des semaines. Cependant, les cellules primaires diffèrent d’un lot à l’autre, sont plus difficiles à entretenir et sont plus coûteuses que les lignées cellulaires, ce qui les rend moins adaptées aux tests de toxicité et au dépistage. Lorsque l’on compare différentes lignées cellulaires épithéliales bronchiques humaines (16HBE, Calu-3, H292 et BEAS-2B), seules les cellules Calu-3 remplissent tous les critères nécessaires à une exposition ali réaliste et répétée : elles restent viables pendant des semaines pendant leur culture à l’ALI, fournissent une intégrité de barrière élevée, ne surcroîtent pas et sont faciles à culture et à entretenir. Les cellules Calu-3 proviennent d’un adénocarcinome et sont capables de produire du mucus11,12. Il ya des incohérences quant à savoir si les cellules peuvent développer des cils11,13. Les cellules Calu-3 sont également un modèle approprié pour étudier les infections par le virus respiratoire syncytial (VRS) qui infectent les cellules épithéliales ciliées des voies respiratoires14.

Outre le modèle cellulaire, un système d’exposition automatisé (AES) est utilisé pour l’exposition air-liquide aux aérosols15,16. L’AES a l’avantage d’utiliser un flux d’air continu pour exposer le modèle cellulaire aux aérosols. Cela contraste avec d’autres systèmes d’exposition air-liquide qui utilisent habituellement des concentrations relativement élevées dans un court laps de temps comme nuage (c.-à-d. gouttelettes contenant des particules qui s’installentrapidement) 17,18,19. Ces systèmes cloud ne reflètent pas une exposition réaliste à long terme à de faibles concentrations de particules. En appliquant un flux d’air continu à l’aide de l’AES, le modèle cellulaire peut être exposé à une faible concentration de particules sur une plus longue période, reflétant des conditions d’exposition réalistes. Un autre avantage par rapport aux systèmes cloud est que l’AES a la possibilité de connecter les instruments de caractérisation des particules, permettant de mesurer la taille des particules, la concentration de nombres et la masse au fil du temps. Une limitation de l’AES est qu’il utilise des débits d’air relativement élevés entre 10 mL/min et 100 mL/min.

Protocol

1. Préparation du milieu de culture cellulaire (CCM)

  1. Préparer une bouteille de 500 ml de milieu minimum essentiel (MEM) complétée par de la glutamine.
  2. Ajouter 5 mL de pénicilline-streptomycine (c.-à-d. 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine).
  3. Ajouter 5 mL de solution d’acides aminés non essentiels (NEAA).
  4. Ajouter 10 mL d’amphotericine B (facultatif).
  5. Ajouter 50 mL de FBS (chaleur inactivée, veuillez suivre le protocole ATCC pour l’inactivation thermique; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/AnimCellCulture_Guide.ashx, page 19)).

2. Subcultation des cellules Calu-3

REMARQUE : Les cellules Calu-3 sont cultivés dans des flacons de culture cellulaire T75 ou T175 à 37 °C et 5 % en CO2. Les cellules sont passage à 60-80% confluency tous les 7 jours avec renouvellement de CCM tous les 2-3 jours. CCM est versé et ccm frais (T25 = 5 mL, T75 = 15 mL, et T175 = 25 mL) est pipetted dans le flacon et le flacon est remis dans l’incubateur. Les cellules doivent être passages au moins 2 fois après la décongélation, avant d’être utilisé dans des expériences, ou avant de geler, et elles ne doivent pas être passages plus de 25 x au total.

  1. Confirmez si le flacon est confluent à 60-80 % en vérifiant au microscope léger.
  2. Verser le CCM du flacon.
  3. Lavez les cellules 2x avec 5 mL de solution de sel équilibré (HBSS) de Hanks 1x sans calcium et sans magnésium. Jetez le HBSS après chaque lavage. HBSS enlève le sérum, qui inhibe la trypsine.
  4. Ajouter 3 mL de trypsine-EDTA pour un T75 (4 mL pour un T175) et remettre le flacon dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 10 à 15 min. Vérifiez après 10 min, en vous assurant que les cellules se sont détachées de la surface du flacon. Dans le cas où les cellules sont cultivées à >80% confluency, ils ne se détacheront pas en utilisant la trypsine 0,05% et trypsine 0,25% pourrait être utilisé.
  5. Ajouter 6 mL (c.-à-d. doubler le volume trypsine-EDTA ajouté à l’origine) de CCM au flacon et bercer doucement les flacons pour assurer un bon mélange. Il s’agit de s’assurer que la trypsine a été neutralisée par le FBS dans le CCM et son activité sur les cellules arrêtées. Si la trypsine est autorisée à rester en contact avec les cellules trop longtemps, ils ne se rattachent pas lorsqu’ils sont mis dans un nouveau flacon de culture cellulaire.
  6. Verser le contenu complet du flacon dans un tube de centrifugeuse de 50 mL.
  7. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 130 x g,en veillant à ce que la centrifugeuse soit correctement équilibrée.
  8. Retourner le flacon contenant les cellules dans des conditions aseptiques et retirer le supernatant doucement, sans déranger la pastille. Le supernatant peut être versé et le reste a été coupé, ce qui garantit que la pastille n’est pas dérangée.
  9. Resuspendez la pastille cellulaire dans 1 mL de CCM en évadant de haut en bas jusqu’à ce que toutes les cellules soient suspendues (c.-à-d. qu’aucun granulé ou aggloméates cellulaire n’est observé). CCM supplémentaire peut être ajouté pour diluer la suspension cellulaire.
  10. Comptez les cellules, mortes et vivantes, dans 1 mL de CCM à l’aide d’un hémocytomètre. Si nécessaire pour un bon comptage, diluer les cellules en 3 ou 4 mL.
  11. Suspendre les cellules dans le volume de CCM requis et ajouter la suspension cellulaire dans chaque flacon. Pour atteindre environ 80% de confluence en une semaine, graine 2 x 106 cellules dans un T75 ou 6 x 106 cellules dans un T175.
  12. Secouez doucement le flacon, puis placez-le de nouveau dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.
  13. Remplacer par ccm frais tous les 2-3 jours et la sous-culture lorsque les cellules atteignent 60-80% confluence.

3. Ensemencement des cellules Calu-3 sur des inserts de culture

REMARQUE : Les inserts sont disponibles avec différentes tailles de pores. Les petites tailles de pores (p. ex., 0,4 μm) ont l’avantage que les cellules se développent plus facilement et peuvent atteindre une bonne barrière déjà après 5 jours de culte dans des conditions submergées, tel que mesuré par trans résistance électrique épithéliale (TEER). Cependant, lorsqu’ils s’intéressent à la translocation des particules, ces pores sont trop petits et emprisonnent les particules. Par conséquent, des pores plus grands (p. ex., 3 μm) sont habituellement choisis pour tester les particules. Lors de l’utilisation d’une plus grande taille de pore, les cellules ont besoin de plus longues périodes de temps (par exemple, 7-10 jours de culture dans des conditions submergées) pour atteindre un bon TEER.

  1. Préparer la suspension cellulaire avec une concentration connue après les étapes 2.1-2.10.
  2. Diluer les cellules à une concentration de 5 x10 5 cellules/mL dans le CCM préchauré pour 6 inserts de puits ou 2,5 x 105 cellules/mL pour 12 inserts de puits.
  3. Prenez une plaque de culture cellulaire avec des inserts et placez-les dans des conditions aseptiques.
  4. Remplissez le côté basolateral de 2 mL de CCM préchauré pour 6 inserts de puits, ou de 1 mL pour 12 inserts de puits. Tout en ajoutant le milieu de culture, sortez l’insert à l’aide d’une pince à épiler.
  5. Mélanger délicatement la suspension cellulaire en descendant de haut en bas. Pipette 1,0 mL pour 6 inserts de puits et 500 μL pour 12 inserts de puits (équivalent à 100 000 cellules/cm2)sur le dessus de la membrane dans l’insert de culture cellulaire avec des pores de 0,4 μm. Pour les pores de 3,0 μm, augmenter la densité cellulaire à 128 000 cellules/cm2.
  6. Couvrir la plaque de culture cellulaire et incuber à 37 °C et 5 % de CO2.
  7. Changez le CCM tous les 2-3 jours.
  8. Laissez les cellules devenir confluentes pendant 7 jours dans des conditions submergées avant de continuer à la culture à l’ALI.
  9. Mesurez TEER.
    1. Prenez un Voltohmmeter épithélial complété par Chopstick Electrode Set et chargez le système de batterie pendant la nuit.
    2. Déconnecter le Voltohmmètre du chargeur et connecter l’électrode baguette.
    3. Nettoyez l’électrode avec 70% d’éthanol.
    4. Placez l’électrode dans le CCM en mettant l’électrode plus longue dans le média de culture externe jusqu’à ce qu’elle touche le fond du plat et en mettant l’électrode plus courte dans les médias sans toucher la membrane.
    5. Commencez par un insert vide sans cellules. Attendez que la mesure se stabilise et notez la résistance dans Ohms. Cette mesure est la résistance de la membrane d’insertion sans cellules (c.-à-d. résistance vierge).
    6. Répétez la mesure pour chaque insert et soustrayez la résistance vierge pour obtenir la vraie résistance.
    7. Pour l’analyse des données, multipliez les valeurs de résistance par la surface de l’insert Ω x cm2. Pour un insert de 6 puits, la surface est de 4,67 cm2. Ainsi, si une résistance de 600 Ohm est mesurée et que le fond est de 120 Ohm, la résistance est de 480 Ohm, qui est ensuite multipliée par la surface de 4,67 cm2 pour un total de 2 241,6 Ohm x cm2. Le TEER devrait être >1,000 Ω x cm2 pour continuer.
  10. Retirez le CCM du côté apical des inserts.
  11. Ajouter 2 mL de CCM préchauré pour 6 puits et 1 mL pour 12 inserts de puits sur le côté basolateral du puits (c.-à-d. sous l’insert de culture cellulaire). Le CCM doit toucher la membrane par le bas, mais ne pas fuir sur le dessus de l’insert.
  12. À ce stade, les cellules sont exposées de façon apique à l’air, ce qu’on appelle la culture à l’ALI.
  13. Cellules de culture à l’ALI dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 7 jours avant l’exposition.
  14. Changez le CCM basolateral tous les 2-3 jours. Les cellules peuvent être utilisées à l’ALI pendant 6 semaines.

4. Préparation de la configuration d’exposition

REMARQUE : Les sections 5 à 7 décrivent les préparatifs d’exposition aux particules à l’aide d’une station d’exposition automatisée (AES, voir tableau des matériaux). La configuration de la nébulisation et de la caractérisation des particules est également compatible avec d’autres systèmes d’exposition ALI d’autres fabricants. À titre d’exemple, l’exposition aux particules est décrite ci-dessous. Ces systèmes peuvent également être utilisés pour d’autres expositions, telles que les sensibilisants, la fumée de cigarette et les gaz d’échappement diesel. La figure 1 montre l’AES et un module d’exposition. La figure 2 montre une représentation schématique de la configuration de l’exposition, y compris tous les autres instruments.

  1. Avant de commencer une exposition à l’aide de l’AES, connectez le système à plusieurs instruments pour mesurer les caractéristiques des aérosols; ceux-ci sont mesurés dans un cours d’eau latéral juste avant que les aérosols entrent dans l’armoire.
    REMARQUE : Un séparant d’écoulement est utilisé pour connecter le flux latéral à l’équipement de caractérisation de l’exposition. En général, l’équipement suivant est utilisé : tailleur de particules de mobilité à balayage (SMPS), sizer optique de particules (OPS), compteur de particules de condensation (CPC), microbalance oscillante d’élément conique (TEOM). Les mesures SMPS et OPS sont effectuées 1x par heure et utilisent le même tube à partir du séparable d’écoulement. Le CPC et TEOM effectuent des mesures continues et les données des deux sont enregistrées sur un enregistreur de données squirrel modèle 2020. En outre, la concentration gravimétrique de masse est déterminée à l’aide d’un microbalance dans l’humidité relative contrôlée (40-70%) température (21-23 °C). Les filtres à téflon sont pesés avant et après chaque exposition pour confirmer la concentration d’exposition. Pour capturer l’échappement, un filtre HEPA est utilisé. La configuration, y compris les suspensions nanomatériaux d’ingénierie (ENM) et le nébuliseur sont tous placés dans un coffret d’écoulement pour empêcher toute exposition aux personnes. L’AES peut être utilisé pour tester de nombreux types d’ENM, y compris les métaux et les oxydes métalliques.
  2. Préparer une suspension nanomatérial peu de temps avant l’exposition. Habituellement, une suspension de 1% est préparée comme une solution d’actions. Par exemple, suspendre 100 mg de nanomatériau dans 10 mL d’eau pure.
    REMARQUE : Pour l’exposition au DQ12, 300 mg est utilisé pour atteindre environ 2 μg/cm2. Cette quantité peut être utilisée dans une seule exposition ou divisée sur des expositions répétées (par exemple, 300 mg est suspendu en 30 mL pour une seule exposition ou 21,5 mg est suspendu en 2,15 mL fraîchement tous les jours pendant 3 semaines d’exposition répétée). La suspension est fraîchement préparée chaque jour d’exposition. La suspension de particule est sonique pendant 16 min utilisant la sonication de sonde. Le volume de la solution de stock de 1% est ajusté à un volume total de 100 mL en ajoutant de l’eau pure.
  3. Mettez la suspension ENM dans une petite bouteille avec un bouchon et un agitateur magnétique pour éviter le tassement des particules. Connectez la bouteille à une pompe périssaltique via un petit tube et ajustez le débit à 25 mL/h.
  4. Connectez la pompe périssaltique à une buse de pulvérisation et ajustez les réglages pour permettre une aérosolisation continue.
  5. La buse de pulvérisation est montée sur un tube en aluminium de 60 cm de long (chambre à mélanger, diamètre 15 cm, chauffée à 60 °C). La configuration est reliée à l’AES via un tube de cuivre de 1,5 mètre de long (diamètre 15 cm). Au-dessus de l’AES, un impacteur enlève tous les aérosols de plus de 2,5 μm.
  6. Connectez la buse de pulvérisation à 3 barres d’air comprimé à travers deux contrôleurs de débit de masse (MFC) pour permettre la nébulisation des suspensions. Un débit de 14 L/min est utilisé pour la buse de pulvérisation, l’autre MFC pour le mélange de l’air dans le tube.
  7. La veille du début de l’exposition, allumez l’AES pour permettre à l’armoire d’atteindre une température de 37 °C.
  8. Allumez le flux d’air et l’humidité dans l’armoire 2 h avant le début de l’exposition, pour atteindre 85% d’humidité. Allumez le chauffage des chambres d’exposition dans lesquelles les inserts avec les cellules seront placés.
  9. Activez le microbalance de quartz (QCM) et réglez la valeur initiale à 0 à l’aide du logiciel. Commencez à vous connecter. Tous les 10 s, la masse est mesurée et exprimée en ng/cm2.
  10. Réchauffer le média de culture cellulaire à 37 °C dans un bain d’eau (~20-30 min).

5. Préparation des cellules Calu-3 pour l’exposition

REMARQUE : Pour une exposition ali typique à l’aide de l’AES, 15-20 inserts avec une couche cellulaire confluente sont nécessaires. Il s’agit de 3 commandes d’air pur, 3 commandes d’incubateur qui seront traitées de la même manière que les autres inserts sans exposition dans l’AES, 6-8 inserts pour l’exposition aux aérosols (selon l’utilisation de 0, 1 ou 2 microbalances), 1-3 inserts pour les mesures de contrôle (comme la libération maximale de LDH), et 3 inserts de rechange au cas où le TEER de certains des inserts n’est pas suffisant. Les cellules devraient avoir un TEER de >1,000 Ω x cm2 pour continuer.

  1. Le premier jour d’exposition, laver les cellules 1x avec CCM, vérifier la morphologie cellulaire, et mesurer le TEER du modèle cellulaire à l’aide d’un Voltohmmeter. Les cellules doivent former une monomouche serrée sans lacunes.
  2. Mettez 2 mL/1 mL de CCM tamponné HEPES sans FCS sur le côté basolateral de 6 plaques de puits/12 puits et transférez les inserts de culture avec des cellules aux nouvelles plaques.
    REMARQUE : Pendant l’exposition, aucun CO2 n’est présent dans l’AES. Par conséquent, le milieu de culture tamponné HEPES (25 mM HEPES) est utilisé pendant le transport et l’exposition. Ce milieu est utilisé à la fois pour les cellules exposées de l’AES ainsi que pour les cellules de contrôle de l’incubateur.
  3. Dans le cas où le temps de transporter les cultures cellulaires à l’AES est de plus de 5 min, mettre les cellules dans un incubateur portable de 37 °C pendant le transport.

6. Manipulation de l’AES lors d’une exposition

  1. À l’AES, remplissez les modules d’exposition avec du CCM tamponné HEPES sans sérum fœtal de veau (FCS). La quantité de CCM dépend de l’unité utilisée, et du type d’insertion de culture cellulaire. Gardez à l’esprit que pour garder les cellules à l’ALI, le milieu doit atteindre le fond de la membrane, mais ne doit pas fuir sur le dessus de la membrane. Lorsque vous utilisez 6 inserts de puits, ajoutez 6 mL de CCM tamponné HEPES aux modules d’exposition.
  2. Transférez les inserts avec des cellules des plaques aux modules d’exposition à l’aide d’une pince stérile. Vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air sur le côté basolateral des cellules et retirez tout CCM sur le côté apical des inserts. Dans le cas où il ya quelques bulles d’air sur le côté basolateral, tourner doucement les inserts à l’aide de la pince stérile jusqu’à ce qu’ils soient enlevés. Conservez les plaques contenant du CCM dans un incubateur pour le transfert après une exposition.
  3. Utilisez l’écran tactile pour choisir la durée d’exposition, le débit d’air et l’amélioration des dépôts électrostatiques. L’écran peut également être utilisé pour vérifier l’humidité et la température. Habituellement, une durée d’exposition de 4 h est choisie, avec un débit de 50 mL/min sur les inserts à 37 °C et 85 % d’humidité.
    REMARQUE : Les modules du premier niveau ( figure1) sont utilisés pour l’exposition à l’air pur; inserts dans ce niveau sont utilisés comme contrôles d’exposition à l’air pur. Les autres modules des deuxième et troisième niveaux peuvent être utilisés pour l’exposition aux aérosols, y compris deux modules pour les microbalances de cristal de quartz (QCM) pour mesurer les dépôts en ligne.
  4. Le test de fuite doit être effectué avant de commencer l’exposition. La fuite doit être inférieure à 5 mL/min. Suivez les instructions sur l’écran AES. Lorsque le test de fuite est terminé, l’exposition peut être commencée. En cas de fuite, le tube doit être vérifié.
  5. À la fin de l’exposition, ouvrez la porte d’un module AES, ouvrez les modules d’exposition, placez les inserts de culture cellulaire dans les plaques de culture cellulaire et transférez les plaques à l’incubateur portatif.
  6. Recueillir les supports des modules (c.-à-d. des échantillons exposés) et des plaques (c.-à-d. les commandes de l’incubateur) pour une analyse ultérieure, comme la mesure de la déshydrogénase lactate (LDH).
  7. De retour au laboratoire de culture cellulaire, transférez les inserts de culture cellulaire dans des assiettes remplies de CCM standard frais. Mettez les plaques de culture cellulaire dans l’incubateur jusqu’à la prochaine exposition ou jusqu’à l’analyse.
  8. Après le dernier jour d’exposition, placez les inserts dans l’incubateur jusqu’au lendemain.
  9. Le lendemain de l’exposition finale, ajouter le CCM au côté apical pour mesurer teer à l’aide d’un Voltohmmeter. Recueillir à la fois le CCM apical et basolateral séparément pour l’analyse des cytokines.
  10. Enlevez tout CCM et effectuez un test de viabilité cellulaire en ajoutant, par exemple, un réaccente de prolifération au côté apical.

7. Nettoyage de l’AES

  1. Remplissez les modules d’exposition avec de l’eau, attendez 1 min et retirez l’eau. Ensuite, remplissez les modules avec 70% d’éthanol, laissez-le pendant 10 min, et retirez l’éthanol. Nettoyez également les trompettes d’exposition avec 70 % d’éthanol.
  2. Arrêtez le contrôle de l’humidité de 85%, mais laissez la température de l’armoire à 37 °C pour la prochaine expérience.

Representative Results

Cet article fournit une méthode pour la culture et l’exposition des cellules épithéliales bronchiques humaines à l’ALI qui imite réaliste, conditions répétées d’exposition par inhalation qui peuvent être utilisés pour les tests de toxicité. Les caractéristiques du modèle cellulaire et du système d’exposition sont essentielles à la réalisation d’un modèle réaliste d’exposition par inhalation qui peut être utilisé pour des expositions répétées. Les résultats sur ces caractéristiques sont indiqués ci-dessous.

Exigences et sélection des modèles cellulaires

Lors de la sélection d’un modèle cellulaire approprié, les caractéristiques suivantes doivent être prises en compte :

  1. Le modèle cellulaire devrait être capable de former un monocouche confluent avec des jonctions serrées fonctionnelles pour imiter la barrière pulmonaire.
  2. Le modèle cellulaire doit afficher des performances optimales lorsqu’il est exposé à plusieurs reprises à l’air conditionné (température et humidité).
  3. Le modèle cellulaire doit répondre à une exposition.

Cette étude a commencé avec quatre lignées cellulaires épithéliales bronchiques humaines différentes : 16HBE, Calu-3, H292, et BEAS-2B. Ils sont tous largement utilisés pour les tests de toxicité des nanomatériaux et des produits chimiques. Des quatre lignées cellulaires, seules les cellules Calu-3 remplissaient toutes les exigences ci-dessus. Les cellules formaient une monocouche avec des jonctions serrées (figure 3) qui est restée une barrière stable au fil du temps mesurée par TEER, tandis que les autres lignées cellulaires n’ont pas formé de barrière ou ont montré une baisse de la fonction de barrière lorsqu’elles ont été cultivés à l’ALI (Figure 4). En outre, H292 et BEAS-2B avaient tendance à dépasser en plusieurs couches cellulaires lorsqu’ils étaient cultivés pendant une plus longue période de temps. La culture traditionnelle de cellules submergées et la culture d’ALI différaient considérablement, parce qu’aux éléments nutritifs d’ALI étaient seulement disponibles du côté basolateral et les cellules ont été exposées aux conditions sèches au côté apical. Ces conditions peuvent causer du stress aux modèles cellulaires, qui pourraient être observés en mesurant la viabilité cellulaire au fil du temps. Les lignées cellulaires 16HBE, H292 et BEAS-2B ont toutes montré une libération accrue de LDH lorsqu’elles ont été cultivés à l’ALI, tandis que les cellules Calu-3 n’ont montré qu’une légère libération de LDH (figure 5).

Ensuite, la réponse du modèle Calu-3 aux substances a été testée. En tant que substance de contrôle positive, LPS a été administré par nébulisation du côté apical du modèle. La dose déposée était de 0,25 μg/cm2. Les cellules Calu-3 ont montré une réaction à la lipopolysaccharide (LPS) par une augmentation de la libération de LDH et dans la libération de facteur alpha de nécrose de tumeur (TNF-α) (figure 6).

Enfin, le monocouche Calu-3 a été exposé aux nanomatériaux de silice de quartz (DQ12) (OIM, Édimbourg). La silice cristalline peut induire une silicose et peut également causer des tumeurs pulmonaires. Par conséquent, le Centre international de recherche sur le cancer (CIRC) a classé la silice cristalline comme cancérogène pour l’homme dugroupe I 20. Le mécanisme d’action de la silice cristalline est pensé pour être par l’induction de l’inflammation persistante provoquée par sa surfaceréactive 21,22,23. Plusieurs études in vivo chez les rats et les souris rapportent l’induction des changements d’inflammation et d’histopathologie, y compris des tumeurs et la fibrose, après exposition d’inhalation à la silice cristalline24,25,26,27,28,29. Ces effets sont tous observés après une exposition répétée et/ou un suivi à long terme. Le modèle Calu-3 a été utilisé pour étudier si les observations des études in vivo pouvaient être imitées à l’aide d’un modèle in vitro qui pourrait être exposé à plusieurs reprises à l’ALI.

Les cellules Calu-3 ont été exposées pendant 3 semaines consécutives, 5 jours par semaine, 4 h par jour à DQ12. La dose déposée a été mesurée à l’aide d’un QCM. La dose moyenne déposée était de 120 ng/cm2 par jour, avec une dose cumulative de 1,6 μg/cm2,semblable aux doses induisant un effet in vivo. D’autres caractéristiques des particules sont indiquées dans le tableau 1. Après 3 semaines d’exposition, le DQ12 n’a induit aucun effet significatif dans teer, viabilité cellulaire, et protéine chimioattractante monocyte 1 (MCP-1) libération, par rapport aux contrôles de l’air pur (Figure 7). Comme on s’attendait à une toxicité accrue du DQ12 sur la base des données in vivo, la réactivité des particules a été vérifiée à l’aide d’un test acellulaire selon le protocole optimisé dans le cadre du projet DE L’UE GRACIOUS (livrable 5.3). La réactivité du lot DQ12 a été plus faible que prévu (figure 8), les ordres de grandeur inférieurs par rapport aux particules de contrôle positif noir de carbone (CB). Ce manque de réactivité pourrait expliquer l’absence d’une réponse de toxicité dans le modèle Calu-3.

Figure 1
Figure 1 : La station d’exposition automatisée (AES).
La figure gauche montre l’extérieur de l’armoire avec le panneau tactile. L’AES a trois niveaux avec des modules d’exposition: le niveau supérieur pour les expositions à l’air pur, et le niveau moyen et inférieur pour les expositions aux aérosols. La bonne figure montre le module d’exposition dans lequel des inserts avec des cellules sont placés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Représentation schématique de la configuration de l’exposition.
De gauche à droite : 1) la suspension ENM reliée à la buse de pulvérisation par une pompe périssaltique; 2) À l’aide d’air comprimé, la buse de pulvérisation nébulise la suspension ENM et, par l’intermédiaire d’une chambre de mélange, les aérosols sont conduits à l’AES; 3) Juste avant d’entrer dans l’AES, les instruments de caractérisation des aérosols sont connectés : SMPS, OPS, CPC et TEOM. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Image représentative des cellules Calu-3 après la culture à l’interface air-liquide (ALI) pendant 10 jours.
Image de microscopie de fluorescence des cellules de Calu-3 après culturation à l’ALI pendant 10 jours. La protéine de jonction serrée ZO-1 est tachée de vert, les noyaux des cellules sont tachés de bleu. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Résistance électrique transepithelial (TEER) de quatre lignées cellulaires différentes au cours d’une période de culture de 21 jours.
Valeurs TEER de 16HBE, Calu-3, H292 et BEAS-2B lorsqu’elles sont cultivés pendant 21 jours : les 7 premiers jours immergés, suivis de 14 jours à l’ALI. Les valeurs TEER ont été corrigées pour la résistance de fond de l’insert et multipliées par la surface de l’insert. Les symboles et les barres d’erreur représentent la valeur moyenne et l’écart type de six inserts. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Libération par LDH de quatre lignées cellulaires différentes au cours d’une période de culture de 21 jours.
Libération LDH de 16HBE, Calu-3, H292, et BEAS-2B lorsqu’il est cultivé pendant 21 jours: 7 jours submergés, suivie de 14 jours à l’ALI. Les valeurs LDH indiquées sont par rapport à la libération maximale de LDH par type de cellule. Les symboles et les barres d’erreur représentent la valeur moyenne et l’écart type de cinq inserts. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Effets cellulaires dans les cellules Calu-3 exposées au LPS.
Les cellules calu-3 ont été exposées par nébulisation des nuages à 0,25 μg/cm2 LPS. (A) La conversion WST-1. (B) Libération LDH. (C) TNF-α après l’exposition au LPS. Les symboles et les barres d’erreur représentent des valeurs moyennes et des écarts types de trois inserts. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Effets cellulaires dans les cellules Calu-3 exposées aux nanomatériaux DQ12.
Les cellules Calu-3 ont été exposées pendant 3 semaines (4 h par jour, 5 jours par semaine) aux nanomatériaux DQ12, environ 120 ng/cm2 par jour, dose cumulative de 1,6 μg/cm2. (A) valeurs TEER. (B) Libération LDH. (C) version MCP-1 après l’exposition au DQ12. Tous les symboles et barres d’erreur représentent des valeurs moyennes et des écarts types de trois inserts pour les commandes et de six inserts pour l’exposition DQ12. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Réactivité acellulaire du DQ12.
DQ12 a été incubé avec une sonde de diacétate de dichlorofluoréscéine (DCFH-DA) de 2,7 °C pour détecter sa réactivité de surface. En tant que contrôle positif, des particules noires de carbone (CB) ont été incluses. Par rapport à CB, DQ12 a une réactivité de surface très faible. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Masse de particules (μg/m3) Numéro de particule (#/cm3) Taille des particules de mobilité (nm) Déviation type géométrique Taille optique des particules (μm)
2969 (418) 83983 (10215) 66.6 2.5 1.1 (1.3)

Tableau 1 : Caractéristiques d’exposition au DQ12. Les valeurs sont indiquées comme moyennes avec écart type entre parenthèses.

Discussion

Cet article décrit une méthode pour la culture des cellules épithéliales bronchiques humaines sous ALI et l’exposition de ce modèle bronchique aux aérosols ou aux gaz. L’avantage de l’utilisation des cellules Calu-3 est qu’elles forment des jonctions serrées, restent monocouches, sont capables de résister au flux d’air, et peuvent être cultivés pendant des semaines à l’ALI, contrairement à beaucoup d’autres types de cellules (par exemple, 16HBE, H292, et BEAS-2B). L’utilisation de la stationd’exposition automatisée vitrocell ® (AES) a l’avantage que les cellules peuvent être exposées dans des conditions réalistes et pertinentes car de faibles concentrations peuvent être appliquées à l’aide d’un flux d’air continu.

Les systèmes de flux continus, tels que l’AES, ont des avantages par rapport à l’utilisation des systèmes cloud3,32, qui utilisent une seule nébulisation d’une suspension. Le débit continu est plus réaliste et de nombreuses variables comme le débit, l’humidité et la température sont contrôlées. En outre, le dépôt peut être amélioré à l’aide d’un champ électrique. Enfin, les caractéristiques des aérosols comme la taille, la concentration des nombres et la masse sont surveillées en ligne. Un inconvénient est que les systèmes de flux continus sont plus complexes par rapport aux systèmes cloud. Par conséquent, il est important de faire des expériences préparatoires qui mettent l’accent sur les caractéristiques des particules de l’aérosol et la dose livrée sur l’insert. La concentration initiale de départ des particules et les paramètres AES peuvent ensuite être ajustés pour atteindre la dose désirée sur les cellules33. Selon le type de particules testées, la méthode de génération d’aérosols peut différer. L’utilisation de dépôts électrostatiques dépend du type de particule et fonctionne le mieux pour les particules métalliques. Pour les particules dont la charge de surface est positive, un champ électrostatique négatif doit être appliqué et vice versa.

La sélection des concentrations d’exposition peut être difficile pour toute expérience d’exposition air-liquide. Pour les expositions au DQ12, l’objectif était d’atteindre une dose cumulative totale de 1 μg/cm2 après 3 semaines d’exposition, 5 jours par semaine, 4 h par jour. Cette dose est similaire aux doses qui ont induit un effet in vivo21,25,27,32,33. Lors de l’exécution des expositions, il y avait une certaine variation entre les différents jours d’exposition. Bien que la dose réelle déposée de 1,6 μg/cm2 soit supérieure à celle de 1 μg/cm2 prévue, la dose aurait pu être trop faible pour observer les effets du modèle Calu-3. Seules des différences mineures dans la réponse teer, viabilité et cytokine ont été observées entre l’exposition à l’air pur et l’exposition au DQ12, et ces différences n’étaient pas statistiquement significatives. Une explication pour l’observation que l’exposition de DQ12 pendant 3 semaines n’a pas induit des effets significatifs dans les cellules de Calu-3 est que les macrophages manquaient du modèle de Calu-3. Peut-être, après dq12 macrophages absorption produire des cytokines pro-inflammatoires qui peuvent affecter les cellules Calu-3. Une autre explication est que le lot DQ12 qui a été utilisé pour les expériences n’était pas aussi réactif que prévu. Lors de l’utilisation du LPS comme substance de contrôle positif, Calu-3 montre une réponse, mesurée par une augmentation de la libération de LDH et une augmentation de la libération de TNF-α. Cela indique que le modèle peut détecter la toxicité.

Le modèle cellulaire Calu-3 présente de nombreux avantages, comme nous l’avons vu dans la section résultats. En outre, lorsqu’elles sont cultivés pendant une plus longue période à l’ALI, les cellules Calu-3 peuvent développer des structures cils/cils13 et produire du mucus11,12,13. Malgré ces avantages, le modèle a des limites en ce qui concerne sa pertinence physiologique. Les lignées cellulaires Calu-3 proviennent d’un adénocarcinome, tandis que 16HBE et BEAS-2B proviennent de tissus sains. Malheureusement, ces deux derniers ne conviennent pas à l’exposition répétée à l’ALI car ils ne restent pas un monocouche stable au fil du temps. Une autre limitation du modèle Calu-3 est qu’il ne représente qu’un seul type de cellule. Dans le poumon humain, plusieurs types de cellules qui interagissent et réagissent différemment à l’exposition sont présents. Les particules inhalées se déposent dans différentes régions des poumons en fonction de leur taille aérodynamique. C’est là que les particules contactent la barrière cellulaire épithéliale, comme l’imite le modèle Calu-3. Dans le poumon humain, les macrophages alvéolaires sont attirés par les particules, les engloutissent et les dégagent des poumons. Les macrophages jouent également un rôle essentiel dans la réponse de l’inflammation à l’exposition aux particules. Par conséquent, des efforts sont faits pour étendre le modèle Calu-3 en ajoutant des macrophages primaires pour imiter la barrière pulmonaire de plus près. L’inconvénient des macrophages est qu’ils restent viables seulement pendant environ 7 jours lorsqu’ils sont cultivés au-dessus des cellules Calu-3 à l’ALI. Par conséquent, les macrophages doivent être lus chaque semaine pour transformer le modèle calu-3 actuel en modèle de coculture. L’optimisation du protocole de coculture est en cours.

Compte tenu de ce qui précède, le modèle bronchique Calu-3 est un modèle approprié pour l’exposition répétée aux aérosols de substances partiellement solubles telles que les produits chimiques de la fumée de cigarette et le LPS. Ces substances solubles induisent des augmentations significatives des réponses cytokine dans les cellules Calu-3. Pour tester les particules insolubles telles que les gaz d’échappement diesel et le DQ12, un modèle de coculture est nécessaire, car les macrophages jouent un rôle crucial dans l’induction des effets par exposition aux particules.

Pour les expositions décrites, des membranes d’insertion avec des pores de 3,0 μm ont été utilisées. La raison principale du choix de ce type d’insert est qu’il est possible de tester la translocation des nanomatériaux. Lorsqu’ils utilisent de plus petits pores de 0,4 μm, les aggloméates de particules ne pourront pas traverser la membrane d’insertion. L’inconvénient d’utiliser une grande taille de pore est que les cellules ont besoin d’un temps plus long pour se développer confluent et qu’il est plus difficile de visualiser la morphologie des cellules à l’aide de microscopie légère. Pour vérifier que les cellules ne forment un monocouche confluent, le TEER doit être >1000 Ω x cm2 avant de commencer une exposition.

Pris ensemble, le modèle bronchique Calu-3 présenté ici est adapté à l’utilisation pour une exposition répétée aux aérosols, au moins jusqu’à 3 semaines. Le modèle peut résister à être cultivé et exposé par un flux d’air continu et est capable de détecter la toxicité de l’épithélium bronchique.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux sont financés par le projet PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) et le ministère néerlandais de la Santé, du Bien-être social et du Sport (projet V/050012). Nous tenons à remercier Mme Yvonne Staal et le Dr Jan van Benthem d’avoir examiné de façon critique le manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M NaOH Sigma Aldrich S5881
0.1M (x10) PBS Gibco 14200-059
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) Sigma Aldrich D6883
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) Abcam ab141525
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific Inc. 15290
Automated exposure station Vitrocell
Cell proliferation reagent WST-1 Roche 11644807001
Centrifuge Eppendorf
CPC TSI inc., St Paul MN, USA 3022
Cytotoxicity detection kit LDH Roche 11644793001
DQ12 IOM nanomaterials
ELISA Ready-SET-Go Fischer Scientific 88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2 World Precision Instruments Inc., FL, USA EVOM2-STX2
FBS Greiner bio-one 758093
Flow splitter TSI inc., St Paul MN, USA model 3708
Fluorescein diacetate (F-DA) Sigma Aldrich F7378
HBSS Thermo Fisher Scientific Inc. 14175
Light microscope Olympus CKX41
Mass flow controllers MFC, Bronkhorst, the Netherlands
Methanol (analytical grade) Sigma Aldrich 34860
Microbalance Sartorius, Goettingen, Germany ME-5
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific Inc. 41090
NEAA Thermo Fisher Scientific Inc. 11140
OPS TSI inc., St Paul MN, USA 3339
Pen/Strep Thermo Fisher Scientific Inc. 15140
Phenol red free MEM Gibco 10500-064
Pure water Merck MilliQ
SMPS TSI inc., St Paul MN, USA 3936
Spray nozzle Schlick, Coburg, Germany
Teflon filters Pall R2PJ46
TEOM Rupprecht & Patashnick NY, USA series 1400
Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific Inc. 690175, 658175, 660175
Transwell inserts Corning 3460, 3462
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific Inc. 25300
Tryptan Blue Sigma Aldrich T8154

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Un modèle épithélial bronchique d’interface air-liquide pour l’exposition réaliste et répétée par inhalation aux particules aéroportées pour l’essai de toxicité
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