Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

نموذج ظهاري لواجهة هوائية-سائلة لتعرض واقعي ومكرر للاستنشاق للجسيمات المحمولة جواً لاختبار السمية

doi: 10.3791/61210 Published: May 13, 2020

Summary

وصفها هو ثقافة الخلية وطريقة التعرض لنموذج القصبات الهوائية في المختبر واقعية، والتعرض المتكرر للجسيمات لاختبار السمية.

Abstract

وفيما يتعلق باختبار السمية للجسيمات المحمولة جوا، تم تطوير نظم للتعرض للواجهة البينية الهوائية السائلة (ALI) من أجل الاختبارات المختبرية من أجل محاكاة ظروف التعرض الواقعية. وهذا يضع مطالب محددة على نماذج ثقافة الخلية. تتأثر أنواع كثيرة من الخلايا سلباً بالتعرض للهواء (على سبيل المثال، الجفاف) ولا تبقى قابلة للحياة إلا لبضعة أيام. وهذا يحد من حالات التعرض التي يمكن استخدامها في هذه النماذج: وعادة ما يتم تطبيق تركيزات عالية نسبيا كسحابة (أي قطرات تحتوي على جسيمات، والتي تستقر بسرعة) في غضون فترة قصيرة من الزمن. ولا تعكس هذه الظروف التجريبية التعرض الواقعي الطويل الأجل لتركيزات منخفضة من الجسيمات. للتغلب على هذه القيود استخدام خط الخلايا الظهارية القصبية بشرية، تم التحقيق في Calu-3. هذه الخلايا يمكن أن تكون مثقفة في ظروف ALI لعدة أسابيع مع الاحتفاظ مورفولوجيا صحية و أحادية مستقرة مع تقاطعات ضيقة. وبالإضافة إلى ذلك، هذا النموذج الشعب الهوائية هو مناسبة لاختبار آثار التعرض المتكرر لتركيزات منخفضة وواقعية من الجسيمات المحمولة جوا باستخدام نظام التعرض ALI. يستخدم هذا النظام تدفق الهواء المستمر على عكس أنظمة التعرض ALI الأخرى التي تستخدم البخاخة واحدة تنتج سحابة. ولذلك، فإن نظام التدفق المستمر مناسب للتعرض المتكرر والمطول للجسيمات المحمولة جواً مع الرصد المستمر لخصائص الجسيمات وتركيز التعرض والجرعة التي يتم تسليمها. معا, هذا النموذج الشعب الهوائية, في تركيبة مع نظام التعرض للتدفق المستمر, قادر على محاكاة واقعية, ظروف التعرض للاستنشاق المتكررة التي يمكن استخدامها لاختبار السمية.

Introduction

الرئتان عرضة للتعرض للاستنشاق للجسيمات المحمولة جواً. لتقييم السمية المحتملة للجسيمات المحمولة جوا، وقد أحرز تقدم لتطوير واجهة الهواء والسائل (ALI) نظم التعرض5. وتتيح نظم التعرض لـ ALI نماذج تعرض أكثر صلة وواقعية مقارنة بالتعرض المغمور التقليدي عبر الوسط الثقافي الذي يغير خصائص وحركيات الجسيمات6. تضع أنظمة التعرض لـ ALI مطالب محددة على نماذج ثقافة الخلية ، حيث تفتقر النماذج إلى الثقافة المتوسطة وبالتالي العناصر الغذائية في الجانب المحمول. تتأثر العديد من نماذج الخلايا سلبًا بزرعها وفضحها في الهواء (على سبيل المثال، الجفاف) وتظل قابلة للحياة لبضعة أيام فقط. وهذا يحد من ظروف التعرض التي يمكن استخدامها في هذه النماذج: وعادة ما يتم تطبيق تركيزات عالية نسبيا في غضون فترة قصيرة من الزمن كسحابة (أي قطرات تحتوي على جسيمات، والتي تستقر بسرعة). ولا تعكس هذه الظروف التجريبية التعرض الواقعي الطويل الأجل لتركيزات منخفضة من الجسيمات؛ وبالتالي، يمكن أن تكون مسألة أهمية النتائج موضع تساؤل. للتغلب على هذه القيود، تم تحسين الثقافة والتعرض بروتوكول لنموذج الشعب الهوائية التي تتكون من خط الخلية الظهارية الشعب الهوائية الإنسان Calu-37.

معظم نماذج الرئة في المختبر المستخدمة في التعرض ALI تحتوي على خطوط الخلية الأخرى مثل A549، BEAS-2B، و 16HBE14o-(16HBE) أو الخلايا الأولية كأساس8. هذه الخطوط الخلوية لها عيب أنها تبقى قابلة للحياة لبضعة أيام فقط عندما مثقف في ALI. بالإضافة إلى ذلك، بعض هذه خطوط الخلية فوق النمو عند مثقف لفترة أطول من 5 أيام. وأخيرا، الخلايا A549 يغيب عن تقاطعات ضيقة وظيفية، وبالتالي لا يمكن أن تشكل حاجز ضيق اللازمة لتقليد الرئتين9،10. الخلايا الظهارية الأولية قد يكون خيارا جيدا للتعرض ALI كما أنها يمكن أن تكون مثقفة في ALI لأسابيع. ومع ذلك، تختلف الخلايا الأولية من دفعة إلى أخرى، وأكثر صعوبة للحفاظ عليها، وأكثر تكلفة مقارنة بخطوط الخلايا، مما يجعلها أقل ملاءمة لاختبار السمية والفرز. عند مقارنة مختلف خطوط الخلايا الظهارية القصبية البشرية (16HBE، Calu-3، H292، وPIAS-2B)، فقط الخلايا Calu-3 تلبية جميع المعايير اللازمة للتعرض واقعية، ALI المتكررة: أنها تبقى قابلة للحياة لأسابيع في حين مثقف في ALI، وتوفير سلامة حاجز عال، لا الإفراط في النمو، وسهلة الثقافة والحفاظ عليها. الخلايا Calu-3 تنشأ من غدية و هي قادرة على إنتاج المخاط11,12. هناك تناقضات حول ما إذا كان يمكن تطوير الخلايا أهداب11,13. Calu-3 الخلايا هي أيضا نموذج مناسب لدراسة التهابات فيروس متزامن الجهاز التنفسي (RSV) التي تصيب الخلايا الظهارية مجرى الهواءciliated 14.

وإلى جانب نموذج الخلية، يتم استخدام نظام التعرض الآلي (AES) للتعرض للهواء السائل للهباء الجوي15،16. لدى AES ميزة أنه يستخدم تدفق الهواء المستمر لتعرض نموذج الخلية للهباء الجوي. وهذا على النقيض من غيرها من أنظمة التعرض للهواء والسائلة التي عادة ما تستخدم تركيزات عالية نسبيا في غضون فترة قصيرة من الزمن كسحابة (أي، قطرات تحتوي على الجسيمات التي تستقر بسرعة)17،18،19. ولا تعكس هذه النظم السحابية التعرض الواقعي على المدى الطويل لتركيزات منخفضة من الجسيمات. من خلال تطبيق تدفق الهواء المستمر باستخدام AES، يمكن أن يتعرض نموذج الخلية لتركيز منخفض من الجسيمات على مدى فترة زمنية أطول، مما يعكس ظروف التعرض واقعية. ميزة أخرى على أنظمة السحب هو أن AES لديه الخيار لربط أجهزة توصيف الجسيمات، مما يسمح بقياس حجم الجسيمات، وتركيز العدد، والكتلة مع مرور الوقت. وهناك قيد من AES هو أنه يستخدم تدفق الهواء عالية نسبيا بين 10 مل / دقيقة و 100 مل / دقيقة.

Protocol

1. إعداد خلية ثقافة المتوسطة (CCM)

  1. إعداد زجاجة من 500 مل من الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية (MEM) تكملها الجلوتامين.
  2. إضافة 5 مل من البنسلين-ستربتوميسين (أي 100 U/mL البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين).
  3. إضافة 5 مل من الأحماض الأمينية غير الضرورية (NEAA) حل.
  4. إضافة 10 مل من أمفوتيريسين B (اختياري).
  5. إضافة 50 مل من FBS (تنشيط الحرارة، يرجى اتباع بروتوكول ATCC ل تعطيل الحرارة؛ (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture٪20Guides/AnimCellCulture_Guide.ashx، الصفحة 19)).

2. subcturing من الخلايا Calu-3

ملاحظة: خلايا Calu-3 هي مثقفة في T75 أو T175 خلية قارورة ثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. يتم تمرير الخلايا في 60-80٪ التقاء كل 7 أيام مع تجديد CCM كل 2-3 أيام. يتم سكب CCM قبالة وCCM الطازجة (T25 = 5 مل، T75 = 15 مل، و T175 = 25 مل) هو pipetted في القارورة ويتم وضع القارورة مرة أخرى إلى الحاضنة. الخلايا يجب أن يتم تمريرها على الأقل 2x بعد ذوبان الجليد، قبل استخدامها في التجارب، أو قبل تجميد، وينبغي أن يتم تمريرها لا يزيد عن 25x في المجموع.

  1. تأكد من وجود قارورة بنسبة 60-80٪ من خلال التحقق من المجهر الخفيف.
  2. صب قبالة CCM من القارورة.
  3. اغسل الخلايا 2x مع 5 مل من 1x هانكس 'حل الملح المتوازن (HBSS) دون الكالسيوم ودون المغنيسيوم. تخلص من HBSS بعد كل غسل. HBSS يزيل المصل، الذي يمنع التربسين.
  4. أضف 3 مل من التربسين-EDTA لـ T75 (4 مل لـ T175) ثم ضع القارورة مرة أخرى في الحاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ CO2 لمدة 10-15 دقيقة. تحقق بعد 10 دقيقة، وضمان الخلايا أصبحت منفصلة عن سطح قارورة. في حالة نمو الخلايا إلى > 80٪ التقاء, أنها لن تنفصل باستخدام التربسين 0.05٪ والتبسين 0.25٪ يمكن استخدامها.
  5. إضافة 6 مل (أي، ضعف حجم التربسين-EDTA وأضاف أصلا) من CCM إلى القارورة وروك بلطف القارورة لضمان خلط السليم. هذا هو لضمان تم تحييد التربسين من قبل FBS في CCM وتوقف نشاطها على الخلايا. إذا تم السماح التربسين بالبقاء على اتصال مع الخلايا لفترة طويلة جداً فإنها لن إعادة إرفاق عند وضعها في قارورة ثقافة خلية جديدة.
  6. صب محتويات كاملة من قارورة في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 مل.
  7. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقيقة في 130 × ز،وضمان أن جهاز الطرد المركزي متوازن بشكل صحيح.
  8. عودة القارورة التي تحتوي على الخلايا مرة أخرى إلى الظروف العقيمة وإزالة افرنح بلطف، دون إزعاج بيليه. يمكن سكب supernatant قبالة والباقي pipetted قبالة، وضمان لا يتم إزعاج بيليه.
  9. Resuspend بيليه الخلية في 1 مل من CCM عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا حتى يتم تعليق جميع الخلايا (أي، لا توجد بيليه أو يتم ملاحظة جغلومرت الخلية). يمكن إضافة CCM إضافية لتخفيف تعليق الخلية.
  10. عد الخلايا، سواء القتلى أو على قيد الحياة، في 1 مل من CCM باستخدام قياس الهيموزيت. إذا لزم الأمر للعد السليم، وتمييع الخلايا في 3 أو 4 مل.
  11. قم بإيقاف الخلايا في وحدة التخزين المطلوبة CCM وإضافة تعليق الخلية في كل قارورة. لتحقيق حوالي 80٪ التقاء في الأسبوع، بذور 2 × 106 الخلايا في T75 أو 6 × 106 الخلايا في T175.
  12. صخرة بلطف قارورة ومن ثم وضعه مرة أخرى في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  13. استبدل بـ CCM الطازجة كل 2-3 أيام والثقافة الفرعية عندما تصل الخلايا إلى 60-80٪ من الالتقاء.

3. بذور Calu-3 الخلايا على إدراج الثقافة

ملاحظة: تتوفر عمليات الإدراج بأحجام مسام مختلفة. أحجام المسام الصغيرة (على سبيل المثال، 0.4 ميكرومتر) لديها ميزة أن الخلايا تنمو بسهولة أكبر ويمكن أن تحقق حاجزا جيدا بالفعل بعد 5 أيام من زراعة تحت ظروف مغمورة، كما تقاس عبر مقاومة كهربائية الظهارية (TEER). ومع ذلك، عندما تكون مهتمة في نقل الجسيمات، وهذه المسام صغيرة جدا وسوف فخ الجسيمات. ولذلك، عادة ما يتم اختيار أحجام المسام الأكبر (مثل 3 ميكرومتر) لاختبار الجسيمات. عند استخدام حجم المسام الأكبر، تحتاج الخلايا إلى فترات زمنية أطول (على سبيل المثال، 7-10 أيام من الاستزراع في ظروف مغمورة) لتحقيق TEER جيد.

  1. قم بإعداد تعليق الخلية مع التركيز المعروف باتباع الخطوات 2.1-2.10.
  2. تخفيف الخلايا إلى تركيز 5 × 105 خلايا / مل في CCM مسبقة الالدفء لمدة 6 إدراجات جيدا أو 2.5 × 105 خلايا / مل ل12 إدراج جيدا.
  3. تأخذ لوحة ثقافة الخلية مع إدراج ووضعها في ظل ظروف معقمة.
  4. ملء الجانب القاعدي مع 2 مل من CCM مسبقة السخان لمدة 6 إدراج جيدا، أو 1 مل ل 12 إدراج جيدا. أثناء إضافة الوسط الثقافة، تأخذ إدراج بها باستخدام ملاقط.
  5. خلط بعناية تعليق الخلية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. الماصات 1.0 مل ل6 إدراجات جيدا و 500 ميكرولتر ل 12 آبار إدراج (ما يعادل 100،000 الخلايا / سم2)على الجزء العلوي من الغشاء في الخلية في ثقافة إدراج مع 0.4 ميكرومتر المسام. بالنسبة لمسام 3.0 ميكرومتر، قم بزيادة كثافة الخلايا إلى 128,000 خلية/سم2.
  6. تغطية لوحة الخلية ثقافة واحتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  7. تغيير CCM كل 2-3 أيام.
  8. اسمحوا الخلايا تصبح التقاء لمدة 7 أيام تحت ظروف مغمورة قبل الاستمرار في الثقافة في ALI.
  9. قياس TEER.
    1. خذ مقياس Voltohmmeter الظهاري المكمل مع مجموعة أقطاب عيدان التحكم وشحن نظام البطارية بين عشية وضحاها.
    2. افصل مقياس Voltohmmeter عن الشاحن وقم بتوصيل قطب عيدان الطعام.
    3. تنظيف القطب مع 70٪ الإيثانول.
    4. وضع القطب في CCM عن طريق وضع القطب الأطول في وسائل الإعلام الثقافة الخارجية حتى اللمسات على الجزء السفلي من الطبق ووضع القطب أقصر في وسائل الإعلام دون لمس الغشاء.
    5. ابدأ بإدراج فارغ بدون خلايا. انتظر حتى يستقر القياس وتدوين المقاومة في أوم. هذا القياس هو مقاومة غشاء إدراج دون أي خلايا (أي، مقاومة فارغة).
    6. كرر القياس لكل إدراج وطرح المقاومة فارغة للحصول على المقاومة الحقيقية.
    7. لتحليل البيانات، قم بضرب قيم المقاومة في المساحة السطحية للإدخال في Ω × سم2. بالنسبة لـ 6 آبار، تبلغ مساحة السطح 4.67 سم2. وهكذا، إذا تم قياس مقاومة 600 أوم والخلفية هي 120 أوم، فإن المقاومة هي 480 أوم، ثم تتضاعف بمساحة السطح 4.67 سم2 بإجمالي 2241.6 أوم × سم2. يجب أن يكون TEER >1,000 Ω × سم2 للمتابعة.
  10. إزالة CCM من الجانب apical من إدراج.
  11. إضافة 2 مل من CCM مسبقة السخان لمدة 6 جيدا و 1 مل ل12 إدراج جيدا إلى الجانب القاعدي من البئر (أي، تحت إدراج ثقافة الخلية). وينبغي أن تلمس CCM الغشاء من أسفل, ولكن ليس تسرب على الجزء العلوي من إدراج.
  12. عند هذه النقطة تتعرض الخلايا إلى الهواء، والذي يشار إليه باسم زراعة في ALI.
  13. خلايا الثقافة في ALI في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 7 أيام قبل التعرض.
  14. تغيير CCM القاعدي كل 2-3 أيام. يمكن استخدام الخلايا في ALI لمدة 6 أسابيع.

4. إعداد الإعداد التعرض

ملاحظة: تصف الأقسام 5-7 الاستعدادات للتعرض للجسيمات باستخدام محطة تعرض آلية (AES، انظر جدول المواد). كما أن إعداد عملية ابخس الجسيمات وتوصيفها متوافق أيضاً مع نظم التعرض الأخرى لـ ALI من الشركات المصنعة الأخرى. وكمثال على ذلك، يرد أدناه وصف للتعرض للجسيمات. ويمكن أيضاً استخدام هذه النظم في التعرضات الأخرى، مثل أجهزة التوعية ودخان السجائر وعوادم الديزل. ويبين الشكل 1 وحدة AES ووحدة التعرض. ويبين الشكل 2 تمثيلاً تخطيطياً لإعداد التعرض بما في ذلك جميع الأدوات الأخرى.

  1. قبل البدء في التعرض باستخدام AES، قم بتوصيل النظام بعدة أدوات لقياس خصائص الهباء الجوي؛ يتم قياس هذه في تيار الجانب فقط قبل دخول الهباء الجوي مجلس الوزراء.
    ملاحظة: يتم استخدام مقسم تدفق لتوصيل الدفق الجانبي بمعدات توصيف التعريض الضوئي. عموما، يتم استخدام المعدات التالية: المسح الضوئي حجم الجسيمات التنقل (SMPS)، حجم الجسيمات البصرية (OPS)، مضادة لجسيمات التكثيف (CPC)، عنصر مدبب يتذبذب ميكروزاننس (TEOM). يتم إجراء قياسات SMPS وOPS 1x في الساعة وتستخدم نفس الأنابيب من مقسم التدفق. يقوم CPC و TEOM بإجراء قياس مستمر ويتم تسجيل البيانات من كليهما على مسجل بيانات طراز سنجاب 2020. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد تركيز الكتلة gravimetric باستخدام الثقل الدقيق في الرطوبة النسبية الخاضعة للرقابة (40-70٪) ودرجة الحرارة (21-23 درجة مئوية) الظروف. يتم وزن مرشحات تفلون قبل وبعد كل التعرض لتأكيد تركيز التعرض. لالتقاط العادم، يتم استخدام مرشح HEPA. يتم وضع الإعداد بما في ذلك تعليق المواد النانوية (ENM) المهندسة والبخاخات في خزانة التدفق لمنع أي تعرض للأشخاص. يمكن استخدام AES لاختبار العديد من أنواع مختلفة من ENMs، بما في ذلك المعادن وأكاسيد المعادن.
  2. إعداد تعليق المواد النانوية قبل وقت قصير من التعرض. عادة ما يتم إعداد تعليق 1٪ كحل الأسهم. على سبيل المثال، تعليق 100 ملغ من المواد النانوية في 10 مل من الماء النقي.
    ملاحظة: بالنسبة للتعرض DQ12، يتم استخدام 300 ملغ لتحقيق حوالي 2 ميكروغرام/سم2. ويمكن استخدام هذا المبلغ في التعرض واحد أو تقسيمها على التعرض المتكرر (على سبيل المثال، يتم تعليق 300 ملغ في 30 مل لتعرض واحد أو 21.5 ملغ علقت في 2.15 مل حديثا كل يوم لمدة 3 أسابيع من التعرض المتكرر). يتم إعداد التعليق حديثًا في كل يوم تعرض. هو sonicated تعليق الجسيمات لمدة 16 دقيقة باستخدام سونيكيشن التحقيق. يتم ضبط حجم المحلول 1٪ للمخزون إلى حجم إجمالي قدره 100 مل عن طريق إضافة المياه النقية.
  3. وضع تعليق ENM في زجاجة صغيرة مع قبعة وستيرر مغناطيسي لمنع استقرار الجسيمات. قم بتوصيل الزجاجة بمضخة مُتدلّة عبر أنبوب صغير، ثم اضبط التدفق إلى 25 مل/ساعة.
  4. قم بتوصيل المضخة المتحضية إلى فوهة رذاذ وضبط الإعدادات للسماح بالهباء الجوي المستمر.
  5. يتم تركيب فوهة الرش على أنبوب ألمنيوم طوله 60 سم (غرفة خلط، قطرها 15 سم، ساخنة إلى 60 درجة مئوية). يتم توصيل الإعداد إلى AES عبر أنبوب نحاسي بطول 1.5 متر (قطر 15 سم). على رأس AES أداة التأثير يزيل جميع الهباء الجوي أكبر من 2.5 μm.
  6. قم بتوصيل فوهة الرش بـ 3 بار مضغوط من خلال اثنين من وحدات التحكم في التدفق الجماعي (MFC) للسماح بخنق التعليقات. يتم استخدام تدفق واحد من 14 لتر / دقيقة ل فوهة رذاذ، و MFC الأخرى لخلط الهواء في الأنبوب.
  7. في اليوم السابق لبدء التعرض، بدوره على AES للسماح لمجلس الوزراء للوصول إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  8. تشغيل تدفق الهواء والرطوبة في مجلس الوزراء 2 ح قبل بدء التعرض، لتصل إلى رطوبة 85٪. تشغيل التدفئة من غرف التعرض الذي سيتم وضع إدراج مع الخلايا.
  9. تشغيل microbalance الكوارتز (QCM) وتعيين القيمة الأولية في 0 باستخدام البرنامج. بدء التسجيل. كل 10 s يتم قياس الكتلة والتعبير عنها على أنها نانوغرام / سم2.
  10. تدفئة وسائل الإعلام ثقافة الخلية إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي (~ 20-30 دقيقة).

5- إعداد خلايا Calu-3 للتعرض لها

ملاحظة: للحصول على التعرض النموذجي لـ ALI باستخدام AES، يلزم إدخال 15-20 مع طبقة خلية التقاء. وتتألف هذه الضوابط من 3 ضوابط الهواء النظيف، 3 حاضنة التي سيتم التعامل معها على نحو مماثل لإدراج أخرى دون التعرض في AES، 6-8 إدراج للتعرض للهباء الجوي (اعتمادا على استخدام 0، 1، أو 2 microbalances)، 1-3 إدراج لقياسات التحكم (مثل الحد الأقصى لإطلاق LDH)، و 3 إدراج الغيار في حالة TEER من بعض إدراج غير كافية. يجب أن يكون لدى الخلايا TEER من > 1,000 Ω × سم2 للمتابعة.

  1. في اليوم الأول من التعرض، وغسل الخلايا 1x مع CCM، والتحقق من مورفولوجيا الخلية، وقياس TEER من نموذج الخلية باستخدام مقياس فولتوهمميت. الخلايا يجب أن تشكل أحادية ضيقة دون ثغرات.
  2. وضع 2 مل/1 مل من هيبس المخزنة CCM دون FCS إلى الجانب القاعدي من 6 لوحات جيدا /12 ونقل إدراج الثقافة مع الخلايا إلى لوحات جديدة.
    ملاحظة: أثناء التعرض، لايوجد أي ثاني أكسيد الكربون في AES. ولذلك، يتم استخدام الاستزراع العازل من HEPES (25 mM HEPES) أثناء النقل والتعرض. ويستخدم هذا المتوسط لكل من الخلايا المكشوفة في AES وكذلك خلايا التحكم الحاضنة.
  3. في حالة الوقت لنقل الثقافات الخلية إلى AES أكثر من 5 دقائق، ووضع الخلايا في حاضنة المحمولة من 37 درجة مئوية أثناء النقل.

6. التعامل مع AES أثناء التعرض

  1. في AES، تعبئة وحدات التعرض مع CCM HEPES المخزنة دون مصل عجل الجنين (FCS). يعتمد مقدار CCM على الوحدة المستخدمة، ونوع الخلية الثقافة إدراج. نضع في اعتبارنا أن للحفاظ على الخلايا في ALI، يجب أن تصل إلى أسفل الغشاء، ولكن لا ينبغي أن تسرب على رأس الغشاء. عند استخدام 6 إدراجات جيدا، إضافة 6 مل من الـ HEPES المخزنة مؤقتا CCM إلى وحدات التعرض.
  2. نقل إدراج مع الخلايا من لوحات إلى وحدات التعرض باستخدام ملاقط معقمة. تأكد من عدم وجود فقاعات هوائية في الجانب القاعدي للخلايا وإزالة أي CCM على الجانب apical من إدراج. في حالة وجود بعض فقاعات الهواء في الجانب القاعدي، بدوره بلطف إدراج باستخدام ملاقط معقمة حتى تتم إزالتها. الاحتفاظ باللوحات التي تحتوي على CCM في حاضنة لنقلها بعد التعرض.
  3. استخدم شاشة اللمس لاختيار مدة التعريض، ومعدل تدفق الهواء، وتحسين الترسبات الكهربائية الساكنة. كما يمكن استخدام الشاشة للتحقق من الرطوبة ودرجة الحرارة. عادة، يتم اختيار مدة التعرض من 4 ح، مع معدل تدفق 50 مل / دقيقة على إدراج في 37 درجة مئوية والرطوبة 85٪.
    ملاحظة: تستخدم الوحدات في المستوى الأول(الشكل 1)للتعرض للهواء النقي؛ وتستخدم إدراجات في هذا المستوى كضوابط التعرض الهواء النظيف. ويمكن استخدام الوحدات الأخرى في المستوى الثاني والثالث للتعرض للهباء الجوي، بما في ذلك وحدتان للتوازنات الدقيقة للكريستال الكوارتز (QCM) لقياس الترسب عبر الإنترنت.
  4. وينبغي إجراء اختبار التسرب قبل بدء التعرض. يجب أن يكون التسرب أقل من 5 مل/دقيقة. اتبع الإرشادات الموجودة على شاشة AES. عند انتهاء اختبار التسرب، يمكن بدء التعرض. في حالة حدوث تسرب، يجب فحص الأنابيب.
  5. في نهاية التعرض ، وفتح باب وحدة AES ، وفتح وحدات التعرض ، ووضع خلية ثقافة إدراج مرة أخرى إلى لوحات ثقافة الخلية ، ونقل لوحات إلى الحاضنة المحمولة.
  6. جمع وسائل الإعلام من وحدات (أي، عينات المكشوفة) ومن لوحات (أي، ضوابط الحاضنة) لتحليلها في وقت لاحق، مثل قياس dehydrogenase اللاكتات (LDH).
  7. مرة أخرى في مختبر ثقافة الخلية، نقل إدراج ثقافة الخلية إلى لوحات مليئة CCM القياسية الطازجة. وضع لوحات ثقافة الخلية في الحاضنة حتى التعرض المقبل أو حتى التحليل.
  8. بعد يوم التعرض النهائي، ضع الإدراج في الحاضنة حتى اليوم التالي.
  9. في اليوم التالي للتعرض النهائي، إضافة CCM إلى الجانب apical لقياس TEER باستخدام Voltohmmeter. جمع كل من apical وCCM القاعدية بشكل منفصل لتحليل السيتوكينات.
  10. إزالة جميع CCM وإجراء اختبار صلاحية الخلية بإضافة، على سبيل المثال، كاشف انتشار إلى الجانب apical.

7. تنظيف AES

  1. ملء وحدات التعرض بالماء، والانتظار لمدة 1 دقيقة، وإزالة الماء. بعد ذلك، تعبئة وحدات مع 70٪ الإيثانول، وتركها لمدة 10 دقيقة، وإزالة الإيثانول. تنظيف الابواق التعرض أيضا مع 70٪ الإيثانول.
  2. وقف السيطرة على الرطوبة 85٪ ، ولكن ترك درجة حرارة مجلس الوزراء في 37 درجة مئوية للتجربة المقبلة.

Representative Results

توفر هذه المقالة طريقة استزراع وفضح الخلايا الظهارية القصبية البشرية في ALI التي تحاكي ظروف التعرض للاستنشاق الواقعية المتكررة التي يمكن استخدامها لاختبار السمية. 10- إن خصائص كل من نموذج الخلية ونظام التعرض لها ضرورية لتحقيق نموذج واقعي للتعرض للاستنشاق يمكن استخدامه في حالات التعرض المتكررة. وترد أدناه النتائج المتعلقة بهذه الخصائص.

متطلبات نموذج الخلية والتحديد

عند اختيار نموذج خلية مناسب، يجب أن تؤخذ الخصائص التالية في الاعتبار:

  1. يجب أن يكون نموذج الخلية قادرًا على تشكيل أحادية الالتقاء مع تقاطعات ضيقة تعمل لمحاكاة حاجز الرئة.
  2. يجب أن يظهر نموذج الخلية الأداء الأمثل عندما يتعرض بشكل متكرر للهواء مكيف (درجة الحرارة والرطوبة).
  3. يجب أن يستجيب نموذج الخلية إلى التعرض.

بدأت هذه الدراسة مع أربعة خطوط الخلايا الظهارية القصبية البشرية المختلفة: 16HBE، Calu-3، H292، وPIAS-2B. وتستخدم جميع هذه على نطاق واسع لاختبار سمية المواد النانوية والمواد الكيميائية. ومن بين خطوط الخلايا الأربعة، لم تفِ إلا خلايا Calu-3 بجميع المتطلبات المذكورة أعلاه. شكلت الخلايا أحادية الطبقات مع تقاطعات ضيقة (الشكل 3) التي ظلت حاجزًا ثابتًا بمرور الوقت كما تم قياسه بواسطة TEER ، في حين أن خطوط الخلايا الأخرى إما لم تشكل حاجزًا أو أظهرت انخفاضًا في وظيفة الحاجز عند استزراعها في ALI (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، يميل H292 و BEAS-2B إلى النمو المفرط في طبقات خلايا متعددة عندما تكون مثقفة لفترة زمنية أطول. اختلف زراعة الخلايا المغمورة التقليدية واستزراع ALI بشكل كبير ، لأنه في المغذيات ALI كانت متوفرة فقط من الجانب القاعدي وتتعرض الخلايا لظروف جافة في الجانب apical. يمكن أن تسبب هذه الحالات الإجهاد لنماذج الخلية، والتي يمكن ملاحظتها من خلال قياس صلاحية الخلية بمرور الوقت. خطوط الخلية 16HBE، H292، و BEAS-2B أظهرت جميع الافراج عن زيادة LDH عندما مثقف في ALI، في حين أظهرت الخلايا Calu-3 فقط طفيف LDH الإفراج(الشكل 5).

وبعد ذلك، تم اختبار استجابة نموذج Calu-3 للمواد. كمادة مراقبة إيجابية، تم إعطاء LPS عن طريق البخ إلى الجانب apical من النموذج. وكانت الجرعة المودعة 0.25 ميكروغرام/سم2. وأظهرت الخلايا Calu-3 رد فعل على lipopolysaccharide (LPS) عن طريق زيادة في الافراج عن LDH وفي عامل نخر الورم ألفا (TNF-α) الإفراج(الشكل 6).

وأخيراً، تعرضت الطبقة الأحادية Calu-3 للمواد النانوية الكوارتز (DQ12) (IOM, Edinburgh). السيليكا البلورية يمكن أن تحفز السيلكوسية وقد تسبب أيضا أورام الرئة. ولذلك، فإن الوكالة الدولية لبحوث السرطان (IARC) قد صنفت السيليكا البلورية باعتبارها المجموعة الأولى الإنسان المسرطنة20. ويعتقد أن آلية عمل السيليكا البلورية أن يكون عن طريق تحريض التهاب مستمر الناجم عن سطحه التفاعلي21,22,23. عدة في دراسات في الجسم الحي في كل من الفئران والجرذان تقرير التعريفي من الالتهابات والتغيرات في علم الأنسجة, بما في ذلك الأورام والتليف, بعد التعرض استنشاق السيليكاالبلورية 24,25,26,27,28,29. وقد لوحظت جميع هذه الآثار بعد التعرض المتكرر و/أو المتابعة الطويلة الأجل. تم استخدام نموذج Calu-3 للتحقيق فيما إذا كان يمكن محاكاة الملاحظات من الدراسات الحية باستخدام نموذج في المختبر يمكن أن يتعرض بشكل متكرر في ALI.

تعرضت خلايا Calu-3 لمدة 3 أسابيع متتالية ، 5 أيام في الأسبوع ، 4 ساعات في اليوم إلى DQ12. وقد قيست الجرعة المودعة باستخدام نظام QCM. وكان متوسط الجرعة المودعة 120 نانوغرام/سم2 في اليوم، مع جرعة تراكمية قدرها 1.6 ميكروغرام/سمعلى غرار الجرعات التي تحفز على التأثير في الجسم الحي. وتظهر خصائص الجسيمات الأخرى في الجدول 1. بعد 3 أسابيع من التعرض، تسبب DQ12 أي آثار كبيرة في TEER، الخلية، والبروتين وحيد الخلايا الكيماوية 1 (MCP-1) الإفراج، مقارنة بضوابط الهواء النظيف (الشكل 7). وبما أن المزيد من السمية لـ DQ12 كان متوقعاً استناداً إلى بيانات الحي في، تم فحص تفاعل الجسيمات باستخدام مقايسة غير خلايا وفقاً للبروتوكول الأمثل في إطار مشروع الاتحاد الأوروبي (المُنجز 5.3). وكان التفاعل من الدفعة DQ12 أقل مما كان متوقعا(الشكل 8)،أوامر من المقادير أقل مقارنة مع جزيئات التحكم الإيجابية الكربون الأسود (CB). وقد يفسر عدم التفاعل هذا عدم وجود استجابة للسمية في نموذج Calu-3.

Figure 1
الشكل 1: محطة التعرض الآلي (AES).
يظهر الشكل الأيسر خارج الخزانة مع لوحة اللمس. وللايس AES ثلاثة مستويات مع وحدات التعرض: المستوى الأعلى للتعرض للهواء النظيف، والمستوى الأوسط والسفلي للتعرض للهباء الجوي. يظهر الشكل الصحيح وحدة التعرض التي يتم وضعها مع إدراج الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التمثيل التخطيطي لإعداد التعرض.
من اليسار إلى اليمين: 1) تعليق ENM المتصلة فوهة رذاذ عن طريق مضخة ال peristaltic; 2) باستخدام الهواء المضغوط في فوهة رذاذ يشوش تعليق ENM وعبر غرفة خلط الهباء الجوي يؤدي إلى AES؛ 3) قبل الدخول إلى AES، ترتبط أدوات توصيف الهباء الجوي: SMPS، مكتب خدمات المشاريع، CPC، وTEOM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صورة تمثيلية لخلايا Calu-3 بعد الاستزراع في واجهة الهواء السائل (ALI) لمدة 10 أيام.
صورة المجهر الفلوري لخلايا Calu-3 بعد الاستزراع في ALI لمدة 10 أيام. ضيق تقاطع البروتين ZO-1 ملطخة باللون الأخضر، نوى من الخلايا ملطخة باللون الأزرق. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: المقاومة الكهربائية عبر الثانية (TEER) لأربعة خطوط خلايا مختلفة خلال فترة 21 يوماً من الاستزراع.
قيم TEER من 16HBE، Calu-3، H292، و BEAS-2B عندما مثقف لمدة 21 يوما: أول 7 أيام مغمورة، تليها 14 يوما في ALI. تم تصحيح قيم TEER لمقاومة الخلفية من إدراج وضربها في مساحة السطح من إدراج. تمثل الرموز وأشرطة الخطأ متوسط القيمة والانحراف المعياري من إدراج ستة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: إطلاق سراح أربعة خطوط خلية مختلفة خلال فترة 21 يوماً من الثقافة.
LDH الإفراج عن 16HBE، Calu-3، H292، و BEAS-2B عندما مثقف لمدة 21 يوما: 7 أيام مغمورة، تليها 14 يوما في ALI. قيم LDH المعروضة نسبية إلى الحد الأقصى للإطلاق LDH لكل نوع خلية. تمثل الرموز وأشرطة الخطأ متوسط القيمة والانحراف المعياري من خمسة إدراجات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التأثيرات الخلوية في الخلايا Calu-3 المعرضة لـ LPS.
تم الكشف عن خلايا Calu-3 عن طريق الحجب السحابي إلى 0.25 ميكروغرام/سم2 LPS. (أ) تحويل WST-1. (B) LDH الإفراج. (C) TNF-α الافراج بعد التعرض LPS. تمثل الرموز وأشرطة الخطأ قيم متوسطة وانحرافات معيارية من ثلاثة إدراجات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: التأثيرات الخلوية في الخلايا Calu-3 المعرضة للمواد النانوية DQ12.
تعرضت خلايا Calu-3 لمدة 3 أسابيع (4 ساعات في اليوم، 5 أيام في الأسبوع) للمواد النانوية DQ12، حوالي 120 نانوغرام/سم2 في اليوم، جرعة تراكمية من 1.6 ميكروغرام/سم2. (A) قيم TEER. (B) LDH الإفراج. (C) إطلاق MCP-1 بعد التعرض DQ12. تمثل جميع الرموز وأشرطة الخطأ متوسط القيم والانحرافات المعيارية من ثلاثة إدراج لعناصر التحكم و إدراج ستة للتعرض DQ12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: التفاعل الخلوي لـ DQ12.
تم احتضان DQ12 بمسبار ثنائي الكلورو لووريسسين Diacetate (DCFH-DA) 2,7-Dichlorofluorescein (DCFH-DA) للكشف عن تفاعله السطحي. وكتحكم إيجابي، تم تضمين جزيئات الكربون السوداء (CB). مقارنة بـ CB، DQ12 لديها تفاعل سطحي منخفض جداً. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كتلة الجسيمات (ميكروغرام / م3) عدد الجسيمات (#/سم3) حجم جسيمات التنقل (نانومتر) الانحراف المعياري الهندسي حجم الجسيمات البصرية (μm)
2969 (418) 83983 (10215) 66.6 2.5 1.1 (1.3)

الجدول 1: خصائص التعرض DQ12. يتم عرض القيم كمتوسط مع الانحراف المعياري بين قوسين.

Discussion

هذه الورقة تصف طريقة استزراع الخلايا الظهارية القصبية البشرية تحت ALI وتعريض هذا النموذج الشعب الهوائية للهباء الجوي أو الغازات. وميزة استخدام الخلايا Calu-3 هي أنها تشكل تقاطعات ضيقة، وتظل أحادية الطبقة، وقادرة على تحمل تدفق الهواء، ويمكن أن تكون مثقفة لأسابيع في ALI، على عكس العديد من أنواع الخلايا الأخرى (على سبيل المثال، 16HBE، H292، و BEAS-2B). باستخدام محطة التعرض الآلي® VITROCELL (AES) لديه ميزة أن الخلايا يمكن أن تتعرض في ظروف واقعية و ذات صلة حيث يمكن تطبيق تركيزات منخفضة باستخدام تدفق الهواء المستمر.

نظم التدفق المستمر، مثل AES، لها مزايا مقارنة باستخدام أنظمة السحابة3،32، والتي تستخدم حجب واحد من تعليق. التدفق المستمر هو أكثر واقعية ويتم التحكم في العديد من المتغيرات مثل معدل التدفق والرطوبة ودرجة الحرارة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تعزيز ترسب باستخدام حقل كهربائي. وأخيراً، يتم رصد خصائص الهباء الجوي مثل الحجم وتركيز العدد والكتلة عبر الإنترنت. ومن المساوئ أن نظم التدفق المستمرة أكثر تعقيدا مقارنة بالنظم السحابية. ولذلك، من المهم إجراء تجارب تحضيرية تركز على خصائص الجسيمات في الهباء الجوي والجرعة التي يتم تسليمها في الإدراج. ويمكن بعد ذلك ضبط التركيز الأولي للجسيمات و AES من أجل تحقيق الجرعة المطلوبة على الخلايا33. اعتمادا على نوع الجسيمات التي يجري اختبارها، يمكن أن تختلف طريقة توليد الهباء الجوي. يعتمد استخدام الترسيب الكهربائي على نوع الجسيمات ويعمل بشكل أفضل للجسيمات المعدنية. بالنسبة للجسيمات ذات الشحنة السطحية الموجبة، ينبغي تطبيق حقل كهرباءً سالبًا والعكس بالعكس.

قد يكون اختيار تركيزات التعرض صعبًا لأي تجربة تعرض للهواء والسائل. وبالنسبة للتعرض للضّرّ، كان الهدف هو تحقيق جرعة تراكمية إجماليّة قدرها 1 ميكروغرام/سم2 بعد التعرّض لمدة 3 أسابيع، و5 أيام في الأسبوع، و4 ساعات في اليوم. هذه الجرعة هي مماثلة للجرعات التي تسبب تأثير في الجسم الحي21,25,27,32,33. وعند تنفيذ التعرض، كان هناك بعض التباين بين أيام التعرض المختلفة. ورغم أن الجرعة المودعة الفعلية التي تبلغ 1.6 ميكروغرام/سم2 أعلى من الجرعة التي كانت موجهة إلى 1 ميكروغرام/سم فإن الجرعة ربما كانت منخفضة جداً بحيث لا تسمح بملاحظة الآثار في نموذج Calu-3. ولم تلاحظ سوى اختلافات طفيفة في استجابة الـ تير، والقابلية للبقاء، والسيتوكين بين التعرض للهواء النظيف والتعرض لـ DQ12، ولم تكن هذه الاختلافات ذات دلالة إحصائية. تفسير الملاحظة التي تعرض DQ12 لمدة 3 أسابيع لم تستحث آثار كبيرة في الخلايا Calu-3 هو أن الضامة كانت تفتقر إلى نموذج Calu-3. ربما, بعد DQ12 امتصاص الضامة إنتاج السيتوكينات proinflammatory التي قد تؤثر على الخلايا Calu-3. تفسير آخر هو أن الدفعة DQ12 التي استخدمت للتجارب لم تكن رد الفعل كما هو متوقع. عند استخدام LPS كمادة مراقبة إيجابية، لا تظهر استجابة Calu-3، كما تقاس بزيادة في إطلاق LDH وزيادة في إطلاق TNF-α. وهذا يشير إلى أن النموذج يمكن الكشف عن سمية.

نموذج الخلية Calu-3 لديه العديد من المزايا، كما نوقش في قسم النتائج. وعلاوة على ذلك، عندما مثقف لفترة أطول في ALI، يمكن أن تنمو الخلايا Calu-3 أهداب / أهداب تشبه الهياكل13 وإنتاج المخاط11،12،13. على الرغم من هذه المزايا ، فإن النموذج له قيود فيما يتعلق بأهميته الفسيولوجية. تنشأ خطوط الخلايا Calu-3 من غدية، في حين أن 16HBE و BEAS-2B ينشأان من الأنسجة السليمة. لسوء الحظ، فإن الأخيرين ليست مناسبة للتعرض ALI المتكرر لأنها لا تبقى أحادية مستقرة مع مرور الوقت. وثمة قيد آخر من نموذج Calu-3 هو أنه يمثل فقط نوع خلية واحدة. في الرئة البشرية، توجد أنواع خلايا متعددة تتفاعل وتستجيب بشكل مختلف للتعرض. سوف تترسب الجسيمات المستنشقة في مناطق مختلفة من الرئتين اعتمادا على حجمها الأيرودينامية. هذا هو المكان الذي تتصل الجسيمات حاجز الخلية الظهارية، كما تحاكيها نموذج Calu-3. في الرئة البشرية، تنجذب الضامة السنخية إلى الجسيمات، وتغمرها، وتمسحها من الرئتين. كما تلعب الضامة دورًا أساسيًا في استجابة الالتهابات للتعرض للجسيمات. ولذلك، تبذل جهود لتوسيع نموذج Calu-3 عن طريق إضافة الضامة الأولية لتقليد حاجز الرئة عن كثب. وعيب الضامة هو أنها تبقى قابلة للحياة فقط لمدة 7 أيام فقط عندما مثقف على رأس الخلايا Calu-3 في ALI. لذلك، يجب قراءة الضامة أسبوعياً لتحويل نموذج Calu-3 الحالي إلى نموذج لزراعة تعايشية. ويجري حاليا تحسين بروتوكول الزراعة التكُنّية.

وبالنظر إلى ما سبق، فإن نموذج الشعب الهوائية Calu-3 هو نموذج مناسب للتعرض المتكرر للهباء الجوي من المواد القابلة للذوبان جزئيا مثل المواد الكيميائية من دخان السجائر و LPS. هذه المواد القابلة للذوبان تحفز زيادات كبيرة في ردود السيتوكين في الخلايا Calu-3. لاختبار الجسيمات غير القابلة للذوبان مثل عادم الديزل وDQ12، هناك حاجة إلى نموذج الزراعة المشتركة، لأن الضامة تلعب دورا حاسما في تحريض الآثار عن طريق التعرض للجسيمات.

وبالنسبة للتعرض الموصوف، تم استخدام أغشية إدخال بمسام 3.0 ميكرومتر. والسبب الرئيسي لاختيار هذا النوع من إدراج هو أنه من الممكن لاختبار نقل المواد النانوية. عند استخدام أصغر حجم المسام 0.4 μm، agglomerates الجسيمات لن تكون قادرة على عبور غشاء إدراج. عيب استخدام حجم المسام الكبيرة هو أن الخلايا تحتاج إلى وقت أطول لتنمو التقاء وأنه من الصعب أكثر تصور مورفولوجيا الخلايا باستخدام المجهر الخفيف. للتحقق من أن الخلايا تشكل طبقة أحادية التقاء، يجب أن يكون TEER > 1000 Ω × سم2 قبل بدء التعرض.

معا، ونموذج الشعب الهوائية Calu-3 المعروضة هنا هو مناسبة للاستخدام للتعرض المتكرر للهباء الجوي، على الأقل تصل إلى 3 أسابيع. النموذج يمكن أن تصمد أمام كونها مثقفة وتتعرض عبر تدفق الهواء المستمر وقادرة على الكشف عن سمية ظهارة الشعب الهوائية.

Disclosures

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويمول هذا العمل من قبل دورية مشروع الاتحاد الأوروبي (أدوات ذات أساس فسيولوجي من أجل المخاطر النانوية الواقعية) ووزارة الصحة والرفاه والرياضة الهولندية (المشروع V/050012). نود أن نشكر الدكتورة إيفون ستال والدكتور يان فان بنثم على مراجعة المخطوطة بشكل نقدي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M NaOH Sigma Aldrich S5881
0.1M (x10) PBS Gibco 14200-059
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) Sigma Aldrich D6883
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) Abcam ab141525
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific Inc. 15290
Automated exposure station Vitrocell
Cell proliferation reagent WST-1 Roche 11644807001
Centrifuge Eppendorf
CPC TSI inc., St Paul MN, USA 3022
Cytotoxicity detection kit LDH Roche 11644793001
DQ12 IOM nanomaterials
ELISA Ready-SET-Go Fischer Scientific 88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2 World Precision Instruments Inc., FL, USA EVOM2-STX2
FBS Greiner bio-one 758093
Flow splitter TSI inc., St Paul MN, USA model 3708
Fluorescein diacetate (F-DA) Sigma Aldrich F7378
HBSS Thermo Fisher Scientific Inc. 14175
Light microscope Olympus CKX41
Mass flow controllers MFC, Bronkhorst, the Netherlands
Methanol (analytical grade) Sigma Aldrich 34860
Microbalance Sartorius, Goettingen, Germany ME-5
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific Inc. 41090
NEAA Thermo Fisher Scientific Inc. 11140
OPS TSI inc., St Paul MN, USA 3339
Pen/Strep Thermo Fisher Scientific Inc. 15140
Phenol red free MEM Gibco 10500-064
Pure water Merck MilliQ
SMPS TSI inc., St Paul MN, USA 3936
Spray nozzle Schlick, Coburg, Germany
Teflon filters Pall R2PJ46
TEOM Rupprecht & Patashnick NY, USA series 1400
Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific Inc. 690175, 658175, 660175
Transwell inserts Corning 3460, 3462
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific Inc. 25300
Tryptan Blue Sigma Aldrich T8154

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology. Nanomaterials (Basel). 7, (2), 49 (2017).
  2. Herzog, F., et al. Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches. The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).
  3. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  4. Paur, H. R., et al. In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology. Journal of Aerosol Science. 42, (10), 668-692 (2011).
  5. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations. Applied in vitro Toxicology. 4, (2), 91-106 (2018).
  6. Loret, T., et al. Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Particle and Fibre Toxicology. 13, (1), 58 (2016).
  7. Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).
  8. Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives in Toxicology. 89, (9), 1469-1495 (2015).
  9. Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport. PLoS One. 11, (10), 0165225 (2016).
  10. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, (2), 107-126 (2015).
  11. Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies. International Archives of Allergy and Immunology. 170, (1), 1-21 (2016).
  12. Jeong, M. H., et al. In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576 (2019).
  13. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmacology Research. 23, (7), 1482-1490 (2006).
  14. Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of Virological Methods. 174, (1-2), 144-149 (2011).
  15. Vitrocell. Vitrocell® Automated Exposure Station. Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1 (2019).
  16. Mülhopt, S., et al. Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system. Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).
  17. Vitrocell. VITROCELL® Cloud for the exposure to liquid aerosols. Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system (2019).
  18. Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11, (1), 40 (2014).
  19. Lenz, A. G., et al. Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, (4), 526-535 (2014).
  20. Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism. Critical Reviews in Toxicology. 41, (9), 756-770 (2011).
  21. Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica. Particle and Fibre Toxicology. 15, (1), 23 (2018).
  22. Kawasaki, H. A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity. Inhalation Toxicology. 27, (8), 363-377 (2015).
  23. Sayes, C. M., et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles. Inhalation Toxicology. 22, (4), 348-354 (2010).
  24. Driscoll, K. E., et al. Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide. Toxicology and Applied Pharmacology. 111, (2), 201-210 (1991).
  25. Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica. Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, Suppl 2 27-29 (1995).
  26. Peeters, P. M., et al. Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs. Particle and Fibre Toxicology. 11, 58 (2014).
  27. Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats. Food and Chemical Toxicology. 29, (5), 341-354 (1991).
  28. Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months. Food and Chemical Toxicology. 45, (10), 1856-1867 (2007).
  29. Cho, W. S., et al. Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles. Toxicology Letters. 175, (1-3), 24-33 (2007).
  30. Herzog, F., et al. Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 10, (1), 11 (2013).
  31. Mülhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement. Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).
  32. van Ravenzwaay, B., et al. Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz. Toxicology Letters. 186, (2), 152-159 (2009).
  33. Henderson, R. F., et al. A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats. Fundamental and Applied Toxicology. 24, (2), 183-197 (1995).
نموذج ظهاري لواجهة هوائية-سائلة لتعرض واقعي ومكرر للاستنشاق للجسيمات المحمولة جواً لاختبار السمية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braakhuis, H. M., He, R., Vandebriel, R. J., Gremmer, E. R., Zwart, E., Vermeulen, J. P., Fokkens, P., Boere, J., Gosens, I., Cassee, F. R. An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (159), e61210, doi:10.3791/61210 (2020).More

Braakhuis, H. M., He, R., Vandebriel, R. J., Gremmer, E. R., Zwart, E., Vermeulen, J. P., Fokkens, P., Boere, J., Gosens, I., Cassee, F. R. An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (159), e61210, doi:10.3791/61210 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter