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Biology

विषाक्तता परीक्षण के लिए हवाई कणों के लिए यथार्थवादी, दोहराया साँस लेना एक्सपोजर के लिए एक एयर-लिक्विड इंटरफेस ब्रोंकियल एपिथेलियल मॉडल

doi: 10.3791/61210 Published: May 13, 2020

Summary

वर्णित विषाक्तता परीक्षण के लिए कणों के लिए यथार्थवादी, दोहराया साँस लेना जोखिम के लिए एक इन विट्रो ब्रोंकियल मॉडल की सेल संस्कृति और जोखिम विधि है।

Abstract

हवाई कणों के विषाक्तता परीक्षण के लिए, यथार्थवादी जोखिम स्थितियों की नकल करने के लिए इन विट्रो परीक्षणों के लिए एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) एक्सपोजर सिस्टम विकसित किए गए हैं। यह सेल संस्कृति मॉडल पर विशिष्ट मांग डालता है। कई सेल प्रकार हवा के संपर्क में आने से नकारात्मक रूप से प्रभावित होते हैं (उदाहरण के लिए, सूखना) और केवल कुछ दिनों के लिए व्यवहार्य रहते हैं। यह जोखिम स्थितियों को सीमित करता है जिनका उपयोग इन मॉडलों में किया जा सकता है: आमतौर पर अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता बादल (यानी, कणों वाली बूंदों, जो तेजी से बसने वाली बूंदों) के रूप में लागू होती है, जो थोड़े समय के भीतर तेजी से बस जाती हैं। इस तरह की प्रायोगिक स्थितियां कणों की कम सांद्रता के लिए यथार्थवादी दीर्घकालिक जोखिम को प्रतिबिंबित नहीं करती हैं। इन सीमाओं को दूर करने के लिए एक मानव ब्रोंकियल एपिथेलियल सेल लाइन के उपयोग, Calu-3 की जांच की गई थी । इन कोशिकाओं को अली स्थितियों में कई हफ्तों के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है, जबकि एक स्वस्थ आकृति विज्ञान और तंग जंक्शनों के साथ एक स्थिर मोनोलेयर को बनाए रखने । इसके अलावा, यह ब्रोंकियल मॉडल अली एक्सपोजर सिस्टम का उपयोग करके हवाई कणों की कम, यथार्थवादी सांद्रता के लिए दोहराए गए एक्सपोजर के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त है। यह सिस्टम अन्य अली एक्सपोजर सिस्टम के विपरीत एक सतत एयरफ्लो का उपयोग करता है जो क्लाउड का उत्पादन करने वाले एक ही नेबुलाइजेशन का उपयोग करता है। इसलिए, सतत प्रवाह प्रणाली लगातार कण विशेषताओं, जोखिम एकाग्रता, और वितरित खुराक की निगरानी करते हुए हवाई कणों के लिए दोहराया और लंबे समय तक जोखिम के लिए उपयुक्त है। एक साथ लिया गया, यह ब्रोंकियल मॉडल, निरंतर प्रवाह एक्सपोजर सिस्टम के संयोजन में, यथार्थवादी, दोहराया साँस लेना जोखिम स्थितियों की नकल करने में सक्षम है जिसका उपयोग विषाक्तता परीक्षण के लिए किया जा सकता है।

Introduction

फेफड़े हवाई कणों के संपर्क में साँस लेने की चपेट में हैं । हवाई कणों की संभावित विषाक्तता का आकलन करने के लिए, एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली)एक्सपोजर सिस्टम1, 2,3,4,5विकसित करनेकेलिए प्रगति की गई है। अली एक्सपोजर सिस्टम संस्कृति माध्यम के माध्यम से पारंपरिक जलमग्न एक्सपोजर की तुलना में अधिक प्रासंगिक और यथार्थवादी एक्सपोजर मॉडल की अनुमति देते हैं जो कणों की विशेषताओं और गतिज को बदल देता है6. अली एक्सपोजर सिस्टम सेल संस्कृति मॉडल पर विशिष्ट मांग रखते हैं, क्योंकि मॉडल में संस्कृति माध्यम की कमी होती है और इस प्रकार एपिकल साइड में पोषक तत्व होते हैं। कई सेल मॉडल नकारात्मक रूप से प्रभावित होते हैं और हवा में उजागर होते हैं (उदाहरण के लिए, सूखते हुए) और केवल कुछ दिनों के लिए व्यवहार्य रहते हैं। यह इन मॉडलों में उपयोग की जा सकने वाली जोखिम स्थितियों को सीमित करता है: आमतौर पर अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता को बादल के रूप में थोड़े समय के भीतर लागू किया जाता है (यानी, कणों वाली बूंदें, जो तेजी से व्यवस्थित होती हैं)। ऐसी प्रायोगिक स्थितियां कणों की कम सांद्रता के लिए यथार्थवादी दीर्घकालिक जोखिम को प्रतिबिंबित नहीं करती हैं; इस प्रकार, परिणामों की प्रासंगिकता पर सवाल उठाया जा सकता है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, मानव ब्रोंकियल एपिथेलियल सेल लाइन कैलू-37 से मिलकर एक ब्रोंकियल मॉडल के लिए संस्कृति और एक्सपोजर प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था।

अली एक्सपोजर के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश विट्रो फेफड़ों के मॉडल में अन्य सेल लाइनें होती हैं जैसे A549, BEAS-2B, और 16HBE14o-(16HBE) या प्राथमिक कोशिकाएं आधार8के रूप में। इन सेल लाइनों को नुकसान है कि वे केवल कुछ दिनों के लिए व्यवहार्य रहते है जब ALI पर सुसंस्कृत । इसके अलावा, इनमें से कुछ सेल लाइनें 5 दिनों से अधिक अवधि के लिए सुसंस्कृत होने पर अधिक बढ़ती हैं। अंत में, A549 कोशिकाएं कार्यात्मक तंग जंक्शनों को याद करती हैं और इसलिए एक तंग बाधा नहीं बना सकती हैं जो फेफड़ों की नकल करने के लिए आवश्यक है9,10। प्राथमिक एपीथेलियल कोशिकाएं अली एक्सपोजर के लिए एक अच्छा विकल्प हो सकती हैं क्योंकि उन्हें अली में हफ्तों तक सुसंस्कृत किया जा सकता है। हालांकि, प्राथमिक कोशिकाएं बैच से बैच तक भिन्न होती हैं, बनाए रखने में अधिक कठिन होती हैं, और सेल लाइनों की तुलना में अधिक महंगी होती हैं, जो उन्हें विषाक्तता परीक्षण और स्क्रीनिंग के लिए कम उपयुक्त बनाती हैं। विभिन्न मानव ब्रोंकियल एपिथेलियल सेल लाइनों (16HBE, Calu-3, H292, और BEAS-2B) की तुलना करते समय, केवल कैलू-3 कोशिकाएं यथार्थवादी, दोहराए गए अली एक्सपोजर के लिए आवश्यक सभी मानदंडों को पूरा करती हैं: वे सप्ताह के लिए व्यवहार्य रहते हैं, जबकि अली में सुसंस्कृत, एक उच्च बाधा अखंडता प्रदान करते हैं, अधिक विकास नहीं करते हैं, और संस्कृति और बनाए रखने में आसान हैं। कैलु-3 कोशिकाएं एडेनोकार्सिनोमा से उत्पन्न होती हैं और बलगम11, 12का उत्पादन करने में सक्षम होती हैं। इस बात की विसंगतियां हैं कि क्या कोशिकाएं सिलिया11,13विकसित कर सकती हैं । कैलू-3 कोशिकाएं श्वसन सिंकिटियल वायरस (आरएसवी) संक्रमणों का अध्ययन करने के लिए भी एक उपयुक्त मॉडल हैं जो सिलिएटेड एयरवे एपिथेलियल कोशिकाओं को संक्रमित करती हैं14।

सेल मॉडल के अलावा, एयरोसोल15, 16के लिए एयर-लिक्विड एक्सपोजर के लिए एक स्वचालित एक्सपोजर सिस्टम (एईएस) का उपयोग कियाजाताहै। एईएस को यह फायदा है कि यह सेल मॉडल को एयरोसोल में बेनकाब करने के लिए लगातार एयरफ्लो का इस्तेमाल करता है । यह अन्य वायु-तरल एक्सपोजर प्रणालियों के विपरीत है जो आमतौर पर थोड़े समय के भीतर अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता का उपयोग बादल के रूप में करते हैं (यानी, बूंदें जिनमें कण तेजी से बसते हैं)17,18,19 ये क्लाउड सिस्टम कणों की कम सांद्रता के लिए यथार्थवादी दीर्घकालिक जोखिम को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। एईएस का उपयोग करके एक सतत एयरफ्लो लागू करके, सेल मॉडल को लंबे समय तक कणों की कम एकाग्रता के संपर्क में किया जा सकता है, जो यथार्थवादी जोखिम स्थितियों को दर्शाती है। क्लाउड सिस्टम पर एक और लाभ यह है कि एईएस के पास कण लक्षण वर्णन उपकरणों को जोड़ने का विकल्प है, जिससे समय के साथ कण आकार, संख्या एकाग्रता और द्रव्यमान की माप की अनुमति है। एईएस की एक सीमा यह है कि यह 10 एमएल/न्यूनतम और १०० एमएल/मिनट के बीच अपेक्षाकृत उच्च एयरफ्लो का उपयोग करता है ।

Protocol

1. सेल कल्चर मीडियम (सीसीएम) तैयार करना

  1. ग्लूटामीन के साथ पूरक न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम) की 500 मिलीएल की एक बोतल तैयार करें।
  2. पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (यानी 100 यू/एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) के 5 एमएल जोड़ें।
  3. गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए) समाधान के 5 एमएल जोड़ें।
  4. एम्फोटेरिन बी (वैकल्पिक) के 10 एमएल जोड़ें।
  5. एफबीएस के 50 एमएल जोड़ें (गर्मी निष्क्रिय, कृपया गर्मी निष्क्रियता के लिए एटीसीसी प्रोटोकॉल का पालन करें; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20ग्इड्स/AnimCellCulture_Guide.एशेक्स, पेज 19)) ।

2. कैलू-3 कोशिकाओं का उपकुलेचर

नोट: Calu-3 कोशिकाओं T75 या T175 सेल संस्कृति फ्लास्क में ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर सुसंस्कृत हैं । कोशिकाओं को हर 2-3 दिनों में सीसीएम नवीकरण के साथ हर 7 दिनों में 60-80% की मंजूरी दी जाती है। सीसीएम को बंद कर दिया जाता है और ताजा सीसीएम (टी 25 = 5 एमएल, T75 = 15 15 एमएल, और T175 = 25 एमएल) को फ्लास्क में पिपेट किया जाता है और फ्लास्क को वापस इनक्यूबेटर में रखा जाता है। कोशिकाओं को विगलन के बाद कम से कम 2x, प्रयोगों में उपयोग करने से पहले, या ठंड से पहले पारित किया जाना चाहिए, और उन्हें कुल मिलाकर 25x से अधिक नहीं जाना चाहिए।

  1. पुष्टि करें कि फ्लास्क हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे जांच करके 60-80% कॉन्फ्लूंट है या नहीं।
  2. फ्लास्क से सीसीएम बंद डालो।
  3. कैल्शियम के बिना और मैग्नीशियम के बिना 1x हैंक्स के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) के 5 एमएल के साथ कोशिकाओं को 2x धोएं। प्रत्येक धोने के बाद एचबीएसएस को छोड़ दें। एचबीएस सीरम निकालता है, जो ट्राइप्सिन को रोकता है।
  4. T75 (T175 के लिए 4 एमसीएल) के लिए ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 3 एमएल जोड़ें और फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में वापस रखें और 10-15 मिनट के लिए 5% सीओ2। 10 मिनट के बाद जांच करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं फ्लास्क सतह से अलग हो गए हैं । यदि कोशिकाओं को 80% तक बढ़ाया जाता है, तो वे ट्राइप्सिन 0.05% का उपयोग नहीं करेंगे और ट्राइप्सिन 0.25% का उपयोग किया जा सकता है।
  5. फ्लास्क में सीसीएम के 6 एमएल (यानी, मूल रूप से जोड़े गए ट्राइप्सिन-ईडीटीए वॉल्यूम को दोगुना करें और उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए फ्लास्क को धीरे-धीरे रॉक करें। यह सुनिश्चित करने के लिए है कि ट्रिप्सिन को सीसीएम में एफबीएस द्वारा निष्प्रभावी कर दिया गया है और कोशिकाओं पर इसकी गतिविधि रोकी गई है । यदि ट्राइपसिन को बहुत लंबे समय तक कोशिकाओं के संपर्क में रहने की अनुमति है तो वे एक नई सेल संस्कृति फ्लास्क में डालने पर फिर से संलग्न नहीं होंगे।
  6. फ्लास्क की पूरी सामग्री को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में डालें।
  7. 130 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, यह सुनिश्चित करना कि अपकेंद्रित्र सही ढंग से संतुलित है।
  8. कोशिकाओं को वापस एसेप्टिक स्थितियों में वापस लाने वाली शीशी को वापस करें और पैलेट को परेशान किए बिना धीरे-धीरे सुपरनैंट को हटा दें। सुपरनैंट को बंद किया जा सकता है और शेष को बंद कर दिया जा सकता है, यह सुनिश्चित करते हुए कि गोली परेशान न हो।
  9. सीसीएम के 1 एमएल में सेल पेलेट को तब तक ऊपर और नीचे पिपिंग करके फिर से उठाया जाए जब तक कि सभी कोशिकाओं को निलंबित नहीं किया जाता (यानी, कोई गोली या सेल समूह नहीं देखा जाता है)। सेल निलंबन को कमजोर करने के लिए अतिरिक्त सीसीएम जोड़ा जा सकता है।
  10. एक हीमोसाइटोमीटर का उपयोग कर सीसीएम के 1 एमसीएल में मृत और जीवित दोनों कोशिकाओं की गणना करें। यदि उचित गिनती के लिए आवश्यक हो, तो कोशिकाओं को 3 या 4 एमएल में पतला करें।
  11. आवश्यक सीसीएम मात्रा में कोशिकाओं को निलंबित करें और प्रत्येक फ्लास्क में सेल निलंबन जोड़ें। एक सप्ताह में लगभग 80% संकुचन प्राप्त करने के लिए, एक T75 या 6 x10 6 कोशिकाओं में बीज 2 x10 6 कोशिकाओं को T175 में।
  12. धीरे - धीरे फ्लास्क को रॉक करें और फिर इसे 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर इनक्यूबेटर में वापसरखें।
  13. कोशिकाओं को 60-80% की नरमी तक पहुंचने पर हर 2-3 दिन और उपसंस्कृति के साथ ताजा सीसीएम के साथ बदलें।

3. संस्कृति आवेषण पर बोने Calu-3 कोशिकाओं

नोट: आवेषण विभिन्न ताकना आकारों के साथ उपलब्ध हैं। छोटे ताकना आकार (जैसे, 0.4 माइक्रोन) का लाभ है कि कोशिकाओं को और अधिक आसानी से बढ़ने और पहले से ही 5 दिनों के बाद एक अच्छा बाधा प्राप्त कर सकते है जलमग्न परिस्थितियों में खेती, के रूप में ट्रांस Epithelial विद्युत प्रतिरोध (TEER) द्वारा मापा जाता है । हालांकि, जब कण स्थानांतरण में रुचि रखते हैं, तो ये छिद्र बहुत छोटे होते हैं और कणों को फंसा देंगे। इसलिए, बड़े ताकना आकार (जैसे, 3 माइक्रोन) आमतौर पर कणों का परीक्षण करने के लिए चुना जाता है। एक बड़े ताकना आकार का उपयोग करते समय, कोशिकाओं को एक अच्छा टीयर प्राप्त करने के लिए लंबे समय तक अवधि (जैसे, जलमग्न परिस्थितियों में 7-10 दिन की खेती) की आवश्यकता होती है।

  1. चरण 2.1-2.10 के बाद ज्ञात एकाग्रता के साथ सेल निलंबन तैयार करें।
  2. 12 अच्छी तरह से आवेषण के लिए 6 अच्छीतरह से आवेषण या 2.5 x 10 5 कोशिकाओं/एमएल के लिए प्रीवार्म्ड सीसीएम में 5 x10 5 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता के लिए पतला कोशिकाओं ।
  3. आवेषण के साथ एक सेल संस्कृति प्लेट लें और एसेप्टिक परिस्थितियों में रखें।
  4. 6 अच्छी तरह से आवेषण के लिए प्रीवार्म्ड सीसीएम के 2 मिलीलीटर के साथ बेसोटेरल साइड भरें, या 12 अच्छी तरह से आवेषण के लिए 1 मिलीलीटर। संस्कृति माध्यम जोड़ते समय, चिमटी का उपयोग करके डालने को बाहर निकालें।
  5. ध्यान से ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा सेल निलंबन मिश्रण। पिपेट 1.0 एमसीएल के लिए 6 अच्छी तरह से आवेषण के लिए और 12 कुओं आवेषण के लिए 500 माइक्रोन (100,000 कोशिकाओं के बराबर/ 3.0 माइक्रोन छिद्रों के लिए, सेल घनत्व को 128,000 सेल/सेमी2तक बढ़ाएं।
  6. सेल कल्चर प्लेट को कवर करें और 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेट करें।
  7. हर 2-3 दिन में सीसीएम बदलें।
  8. चलो कोशिकाओं को ALI में संस्कृति के लिए जारी रखने से पहले जलमग्न परिस्थितियों में 7 दिनों के लिए ढुलमुल हो जाते हैं ।
  9. टीईईआर को मापें।
    1. चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड सेट के साथ पूरक एक एपिथेलियल वोल्टोममीटर लें और बैटरी सिस्टम को रात भर चार्ज करें।
    2. वोल्टोमीटर को चार्जर से डिस्कनेक्ट करें और चॉपस्टिक इलेक्ट्रोड को कनेक्ट करें।
    3. 70% इथेनॉल के साथ इलेक्ट्रोड को साफ करें।
    4. बाहरी संस्कृति मीडिया में लंबे इलेक्ट्रोड डाल कर सीसीएम में इलेक्ट्रोड रखें जब तक कि यह पकवान के नीचे को छू न जाए और झिल्ली को छुए बिना छोटे इलेक्ट्रोड को मीडिया में डाल दें।
    5. कोशिकाओं के बिना एक खाली डालने के साथ शुरू करो। माप स्थिर होने तक प्रतीक्षा करें और ओम्स में प्रतिरोध लिखें। यह माप किसी भी कोशिकाओं (यानी, खाली प्रतिरोध) के बिना सम्मिलित झिल्ली का प्रतिरोध है।
    6. प्रत्येक सम्मिलन के लिए माप दोहराएं और सही प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए खाली प्रतिरोध को घटाएं।
    7. डेटा विश्लेषण के लिए, डालने के सतह क्षेत्र द्वारा प्रतिरोध मूल्यों को गुणा Ω एक्स सेमी2में करें। 6 अच्छी तरह से सम्मिलित करने के लिए, सतह क्षेत्र 4.67 सेमी2है। इस प्रकार, यदि 600 ओम का प्रतिरोध मापा जाता है और पृष्ठभूमि 120 ओम है, तो प्रतिरोध 480 ओम है, जिसे कुल2,241.6 ओम एक्ससेमी2 के लिए 4.67 सेमी 2 के सतह क्षेत्र से गुणा किया जाता है। टीईईआर को जारी रखने के लिए 1,000 Ω एक्स सेमी2 होना चाहिए।
  10. आवेषण के एपिकल साइड से सीसीएम निकालें।
  11. 6 अच्छी तरह से और 12 अच्छी तरह से सम्मिलित करने के लिए प्रीवार्मेड सीसीएम के 2 एमएल जोड़ें (यानी, सेल कल्चर डालने के तहत)। सीसीएम को नीचे से झिल्ली को छूना चाहिए, लेकिन डालने के शीर्ष पर रिसाव नहीं करना चाहिए।
  12. इस बिंदु पर कोशिकाओं को हवा के संपर्क में किया जाता है, जिसे अली में खेती के रूप में जाना जाता है।
  13. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में अली में संस्कृति कोशिकाओं और 5% सीओ2 एक्सपोजर से पहले 7 दिनों के लिए।
  14. हर 2-3 दिन में बसोलेटरल सीसीएम बदलें। कोशिकाओं को 6 सप्ताह के लिए अली में इस्तेमाल किया जा सकता है।

4. एक्सपोजर सेटअप तैयार करना

नोट: धारा 5-7 एक स्वचालित एक्सपोजर स्टेशन (एईएस, सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके कण जोखिम के लिए तैयारी का वर्णन करती है। कण नेबुलाइजेशन और लक्षण वर्णन के लिए सेटअप अन्य निर्माताओं से अन्य अली एक्सपोजर सिस्टम के साथ भी संगत है। एक उदाहरण के रूप में, कणों के संपर्क में नीचे वर्णित है। इस तरह की प्रणालियों का उपयोग अन्य एक्सपोजर के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि संवेदीकरण, सिगरेट का धुआं और डीजल निकास। चित्रा 1 एईएस और एक एक्सपोजर मॉड्यूल दिखाता है। चित्रा 2 अन्य सभी उपकरणों सहित एक्सपोजर सेटअप का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है।

  1. एईएस का उपयोग करके एक्सपोजर शुरू करने से पहले, एयरोसोल विशेषताओं को मापने के लिए सिस्टम को कई उपकरणों से जोड़ें; एयरोसोल कैबिनेट में प्रवेश करने से ठीक पहले इन्हें एक साइड स्ट्रीम में मापा जाता है।
    नोट: एक प्रवाह स्प्लिटर का उपयोग साइड स्ट्रीम को एक्सपोजर लक्षण वर्णन उपकरण से जोड़ने के लिए किया जाता है। आम तौर पर, निम्नलिखित उपकरणों का उपयोग किया जाता है: स्कैनिंग मोबिलिटी पार्टिकल सिज़र (एसएमपी), ऑप्टिकल पार्टिकल सिज़र (ऑप्स), संघनन कण काउंटर (सीपीसी), पतला तत्व दोलन माइक्रोसैलेंस (TEOM)। SMPS और ऑप्स माप प्रति घंटे 1x प्रदर्शन कर रहे हैं और प्रवाह स्प्लिटर से एक ही टयूबिंग का उपयोग करें। सीपीसी और TEOM निरंतर मापने और दोनों से डेटा एक गिलहरी मॉडल २०२० डेटा लॉगर पर लॉग इन कर रहे है प्रदर्शन करते हैं । इसके अलावा, नियंत्रित सापेक्ष आर्द्रता (40-70%) में माइक्रोबैलेंस का उपयोग करके ग्रेविमेट्रिक मास एकाग्रता निर्धारित की जाती है और तापमान (21-23 डिग्री सेल्सियस) की स्थिति। एक्सपोजर एकाग्रता की पुष्टि करने के लिए प्रत्येक एक्सपोजर से पहले और बाद में टेफ्लॉन फिल्टर को तौला जाता है। निकास पर कब्जा करने के लिए, एक हेपा फिल्टर का उपयोग किया जाता है। इंजीनियर नैनोमटेरियल (ENM) निलंबन और नेबुलाइजर सहित सेटअप सभी लोगों के लिए किसी भी जोखिम को रोकने के लिए एक प्रवाह कैबिनेट में रखा जाता है । एईएस का उपयोग धातुओं और धातु ऑक्साइड सहित कई विभिन्न प्रकार के एनएम के परीक्षण के लिए किया जा सकता है।
  2. एक्सपोजर से कुछ देर पहले नैनोमैटेरियल सस्पेंशन तैयार करें। आमतौर पर एक 1% निलंबन एक शेयर समाधान के रूप में तैयार किया जाता है। उदाहरण के लिए, शुद्ध पानी के 10 मिलीलन में 100 मिलीग्राम नैनोमटेरियल को निलंबित करें।
    नोट: DQ12 एक्सपोजर के लिए, 300 मिलीग्राम का उपयोग लगभग 2 μg/सेमी 2 प्राप्त करने के लिए कियाजाताहै। इस राशि का उपयोग एक ही एक्सपोजर में किया जा सकता है या बार-बार एक्सपोजर पर विभाजित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, 300 मिलीग्राम को एक जोखिम के लिए 30 एमएल में निलंबित किया जाता है या 21.5 मिलीग्राम को हर दिन 2.15 एमएल में निलंबित कर दिया जाता है दोहराया जोखिम के 3 सप्ताह के लिए। निलंबन हौसले से प्रत्येक जोखिम दिन पर तैयार है । कण निलंबन जांच सोनीफिकेशन का उपयोग करके 16 मिनट के लिए सोनिकेट किया जाता है। 1% स्टॉक समाधान की मात्रा शुद्ध पानी जोड़कर 100 मिलीएल की कुल मात्रा में समायोजित की जाती है।
  3. कणों के निपटान को रोकने के लिए एक टोपी और एक चुंबकीय उभारक के साथ एक छोटी बोतल में ENM निलंबन रखो। एक छोटी सी ट्यूब के माध्यम से एक पेरिस्टाल्टिक पंप के लिए बोतल कनेक्ट और 25 mL/h करने के लिए प्रवाह को समायोजित करें ।
  4. पेरिस्टाल्टिक पंप को स्प्रे नोजल से कनेक्ट करें और निरंतर एयरोसोलाइजेशन की अनुमति देने के लिए सेटिंग्स को समायोजित करें।
  5. स्प्रे नोजल को 60 सेमी लंबी एल्यूमीनियम ट्यूब (मिश्रण कक्ष, व्यास 15 सेमी, 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म) तक रखा जाता है। सेटअप 1.5 मीटर लंबी तांबे की ट्यूब (व्यास 15 सेमी) के माध्यम से एईएस से जुड़ा हुआ है। एईएस के शीर्ष पर एक प्रभावक 2.5 माइक्रोन से बड़े सभी एयरोसोल को हटा देता है।
  6. निलंबन के नेबुलाइजेशन की अनुमति देने के लिए दो मास फ्लो कंट्रोलर (एमएफसी) के माध्यम से स्प्रे नोजल को 3 बार संकुचित हवा से कनेक्ट करें। 14 एल/मिन का एक प्रवाह स्प्रे नोजल के लिए, दूसरा एमएफसी ट्यूब में हवा के मिश्रण के लिए इस्तेमाल किया जाता है ।
  7. एक्सपोजर शुरू होने से एक दिन पहले, एईएस को चालू करें ताकि कैबिनेट को 37 डिग्री सेल्सियस के तापमान तक पहुंचने की अनुमति दी जा सके।
  8. एक्सपोजर शुरू होने से पहले कैबिनेट 2 घंटे में हवा के प्रवाह और आर्द्रता को चालू करें, 85% आर्द्रता तक पहुंचने के लिए। एक्सपोजर कक्षों के हीटिंग को चालू करें जिसमें कोशिकाओं के साथ आवेषण रखा जाएगा।
  9. क्वार्ट्ज माइक्रोबैलेंस (क्यूसीएम) चालू करें और सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 0 पर प्रारंभिक मूल्य निर्धारित करें। लॉगिंग शुरू करें। प्रत्येक 10 एस द्रव्यमान को मापा जाता है और एनजी/सेमी 2 के रूप में व्यक्त कियाजाताहै ।
  10. एक पानी के स्नान (~ 20-30 मिनट) में सेल संस्कृति मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।

5. एक्सपोजर के लिए कैलू-3 कोशिकाओं को तैयार करना

नोट: एईएस का उपयोग करके एक विशिष्ट अली एक्सपोजर के लिए, एक कॉन्फ्लूंट सेल लेयर के साथ 15-20 आवेषण की आवश्यकता होती है। इनमें 3 स्वच्छ वायु नियंत्रण, 3 इनक्यूबेटर नियंत्रण होते हैं जिन्हें एईएस में एक्सपोजर के बिना अन्य आवेषणों के समान संभाला जाएगा, एयरोसोल एक्सपोजर के लिए 6-8 आवेषण (0, 1, या 2 माइक्रोबैलेंस के उपयोग के आधार पर), नियंत्रण मापन के लिए 1-3 सम्मिलित (जैसे अधिकतम एलडीएच रिलीज), और कुछ आर्ट के टीईआर के मामले में 3 स्पेयर आवेषण पर्याप्त नहीं हैं। कोशिकाओं को जारी रखने के लिए 1,000 Ω एक्स सेमी2 का टीईआर होना चाहिए।

  1. एक्सपोजर के पहले दिन, सीसीएम के साथ कोशिकाओं को 1x धोएं, सेल आकृति विज्ञान की जांच करें, और वोल्टोममीटर का उपयोग करके सेल मॉडल के टीयर को मापें। कोशिकाओं को अंतराल के बिना एक तंग मोनोलेयर बनाना चाहिए।
  2. 2 एमएल/1 एमसीएल के एचईपीएस ने एफसीएस के बिना सीसीएम को 6 अच्छी तरह से/12 अच्छी तरह से प्लेटों के बेसोटेरल साइड में रखें और नई प्लेटों में कोशिकाओं के साथ संस्कृति आवेषण को स्थानांतरित करें ।
    नोट: एक्सपोजर के दौरान, कोई सीओ2 एईएस में मौजूद नहीं है। इसलिए, परिवहन और एक्सपोजर के दौरान हेपीस बफर संस्कृति माध्यम (25 एमएम एचईपीई) का उपयोग किया जाता है। इस माध्यम का उपयोग एईएस के साथ-साथ इनक्यूबेटर नियंत्रण कोशिकाओं में उजागर दोनों कोशिकाओं के लिए किया जाता है।
  3. यदि कोशिका संस्कृतियों को एईएस में परिवहन करने का समय 5 मिनट से अधिक है, तो कोशिकाओं को परिवहन के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस के पोर्टेबल इनक्यूबेटर में रखें।

6. एक जोखिम के दौरान एईएस हैंडलिंग

  1. एईएस में, भ्रूण बछड़े सीरम (एफसीएस) के बिना एचईपी-बफर सीसीएम के साथ एक्सपोजर मॉड्यूल भरें। सीसीएम की मात्रा उपयोग की गई इकाई और सेल संस्कृति डालने के प्रकार पर निर्भर करती है। ध्यान रखें कि कोशिकाओं को अली में रखने के लिए, माध्यम झिल्ली के नीचे तक पहुंचना चाहिए, लेकिन झिल्ली के शीर्ष पर रिसाव नहीं करना चाहिए। 6 अच्छी तरह से आवेषण का उपयोग करते समय, एक्सपोजर मॉड्यूल में हेपेस-बफर सीसीएम के 6 एमएल जोड़ें।
  2. बाँझ चिमटी का उपयोग कर जोखिम मॉड्यूल के लिए प्लेटों से कोशिकाओं के साथ आवेषण स्थानांतरित करें। जांच करें कि कोशिकाओं के बेसोअर्टल साइड में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं और आवेषण के एपिकल साइड पर किसी भी सीसीएम को हटा दें। यदि बेसोलेटरल साइड में कुछ हवा के बुलबुले हैं, तो बाँझ चिमटी का उपयोग करके आवेषण को धीरे-धीरे चालू करें जब तक कि उन्हें हटा नहीं दिया जाता है। एक्सपोजर के बाद ट्रांसफर के लिए सीसीएम युक्त प्लेटों को इनक्यूबेटर में रखें।
  3. एक्सपोजर अवधि, वायु प्रवाह दर और इलेक्ट्रोस्टैटिक जमाव वृद्धि चुनने के लिए टचस्क्रीन डिस्प्ले का उपयोग करें। प्रदर्शन का उपयोग आर्द्रता और तापमान की जांच करने के लिए भी किया जा सकता है। आमतौर पर, 4 घंटे की एक जोखिम अवधि चुना जाता है, 37 डिग्री सेल्सियस और 85% आर्द्रता पर आवेषण पर 50 एमएल/मिनट की प्रवाह दर के साथ।
    नोट: पहले स्तर(चित्रा 1)में मॉड्यूल स्वच्छ हवा जोखिम के लिए उपयोग किया जाता है; इस स्तर में आवेषण स्वच्छ हवा जोखिम नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। दूसरे और तीसरे स्तर के अन्य मॉड्यूल का उपयोग एयरोसोल एक्सपोजर के लिए किया जा सकता है, जिसमें ऑनलाइन जमाव को मापने के लिए क्वार्ट्ज क्रिस्टल माइक्रोबैलेंस (क्यूक्यूएम) के लिए दो मॉड्यूल शामिल हैं।
  4. एक्सपोजर शुरू करने से पहले लीक टेस्ट कराया जाना चाहिए। रिसाव 5 एमएल/मिनट से कम होना चाहिए । एईएस डिस्प्ले पर दिए गए निर्देशों का पालन करें। जब लीक टेस्ट खत्म हो गया है, तो एक्सपोजर शुरू किया जा सकता है। लीक होने की स्थिति में टयूबिंग की जांच होनी चाहिए।
  5. एक्सपोजर के अंत में, एईएस मॉड्यूल का दरवाजा खोलें, एक्सपोजर मॉड्यूल खोलें, सेल कल्चर आवेषण को सेल कल्चर प्लेटों में वापस रखें, और प्लेटों को पोर्टेबल इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
  6. मॉड्यूल (यानी, उजागर नमूनों) से मीडिया को इकट्ठा करें और बाद के विश्लेषण के लिए प्लेटों (यानी इनक्यूबेटर नियंत्रण) से, जैसे लैक्टेट डेहाइड्रोजनेज (एलडीएच) माप।
  7. सेल संस्कृति प्रयोगशाला में वापस, ताजा मानक सीसीएम से भरी प्लेटों के लिए सेल संस्कृति आवेषण हस्तांतरण । अगले एक्सपोजर तक या विश्लेषण तक इनक्यूबेटर में सेल कल्चर प्लेट्स रखें।
  8. अंतिम एक्सपोजर दिन के बाद, अगले दिन तक इनक्यूबेटर में आवेषण डाल दें।
  9. अंतिम एक्सपोजर के बाद दिन में, एक Voltohmmeter का उपयोग कर TEER को मापने के लिए apical पक्ष के लिए सीसीएम जोड़ें । साइटोकिन्स के विश्लेषण के लिए एपिकल और बेसोटेरल सीसीएम दोनों को अलग से इकट्ठा करें।
  10. सभी सीसीएम को हटा दें और जोड़कर एक सेल व्यवहार्यता परख करें, उदाहरण के लिए, एपिकल पक्ष के लिए एक प्रसार रीएजेंट।

7. एईएस की सफाई

  1. एक्सपोजर मॉड्यूल को पानी से भरें, 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और पानी निकालें। इसके बाद, मॉड्यूल को 70% इथेनॉल से भरें, इसे 10 मिनट के लिए छोड़ दें, और इथेनॉल को हटा दें। 70% इथेनॉल के साथ एक्सपोजर तुरही को भी साफ करें।
  2. 85% आर्द्रता नियंत्रण बंद करो, लेकिन अगले प्रयोग के लिए कैबिनेट के तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।

Representative Results

यह लेख अली में मानव ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं को बनाने और उजागर करने के लिए एक विधि प्रदान करता है जो यथार्थवादी, दोहराया साँस लेना जोखिम स्थितियों की नकल करता है जिसका उपयोग विषाक्तता परीक्षण के लिए किया जा सकता है। सेल मॉडल और एक्सपोजर सिस्टम दोनों की विशेषताएं एक यथार्थवादी साँस लेना एक्सपोजर मॉडल प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं जिसका उपयोग बार-बार एक्सपोजर के लिए किया जा सकता है। इन विशेषताओं पर परिणाम नीचे दिखाए गए हैं।

सेल मॉडल आवश्यकताओं और चयन

उपयुक्त सेल मॉडल का चयन करते समय, निम्नलिखित विशेषताओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए:

  1. सेल मॉडल फेफड़ों की बाधा की नकल करने के लिए तंग जंक्शनों के कामकाज के साथ एक शांत मोनोलेयर बनाने में सक्षम होना चाहिए।
  2. वातानुकूलित (तापमान और आर्द्रता) हवा में बार-बार उजागर होने पर सेल मॉडल को इष्टतम प्रदर्शन दिखाना चाहिए।
  3. सेल मॉडल को एक्सपोजर का जवाब देना चाहिए।

यह अध्ययन चार अलग-अलग मानव ब्रोंकियल एपिथेलियल सेल लाइनों के साथ शुरू हुआ: 16HBE, Calu-3, H292, और BEAS-2B। ये सभी व्यापक रूप से नैनोमैटेरियल्स और रसायनों के विषाक्तता परीक्षण के लिए उपयोग किए जाते हैं। चार सेल लाइनों में से, केवल कैलू-3 कोशिकाओं ने उपरोक्त सभी आवश्यकताओं को पूरा किया। कोशिकाओं तंग जंक्शनों(चित्रा 3)के साथ एक मोनोलेयर का गठन किया है कि समय के साथ एक स्थिर बाधा के रूप में TEER द्वारा मापा बने रहे, जबकि अंय सेल लाइनों या तो एक बाधा फार्म नहीं था या बाधा समारोह में एक बूंद दिखाया जब ALI(चित्रा 4)पर सुसंस्कृत । इसके अलावा, H292 और BEAS-2B एक लंबी समय अवधि के लिए सुसंस्कृत जब कई सेल परतों में अधिक वृद्धि करने के लिए खड़ा था । पारंपरिक जलमग्न सेल संस्कृति और अली संस्कृति बहुत अलग है, क्योंकि अली पोषक तत्वों पर केवल basolateral पक्ष से उपलब्ध थे और कोशिकाओं को apical पक्ष में सूखी स्थिति को उजागर किया गया । ये स्थितियां सेल मॉडलों को तनाव पैदा कर सकती हैं, जिन्हें समय के साथ सेल व्यवहार्यता को मापने के द्वारा देखा जा सकता है। सेल लाइनों 16HBE, H292, और BEAS-2B सभी एक वृद्धि हुई LDH रिलीज दिखाया जब अली में सुसंस्कृत, जबकि Calu-3 कोशिकाओं को केवल एक मामूली LDH रिलीज(चित्रा 5) दिखाया

इसके बाद, पदार्थों के लिए Calu-3 मॉडल की प्रतिक्रिया का परीक्षण किया गया था । एक सकारात्मक नियंत्रण पदार्थ के रूप में, एलपीएस मॉडल के एपिकल पक्ष को नेबुलाइजेशन के माध्यम से प्रशासित किया गया था। जमा की गई खुराक 0.25 माइक्रोग्राम/सेमी2थी। Calu-3 कोशिकाओं LDH रिलीज में वृद्धि और ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNF-α) रिलीज(चित्रा 6)में वृद्धि से lipopolysaccharide (एलपीएस) के लिए एक प्रतिक्रिया दिखाई ।

अंत में, Calu-3 मोनोलेयर क्वार्ट्ज सिलिका (DQ12) नैनोमैटेरियल्स (आईओएम, एडिनबर्ग) के संपर्क में था। क्रिस्टलीय सिलिका सिलिकोसिस को प्रेरित कर सकता है और फेफड़ों के ट्यूमर का कारण भी बन सकता है। इसलिए, इंटरनेशनल एजेंसी फॉर रिसर्च ऑन कैंसर (आईएआरसी) ने क्रिस्टलीय सिलिका को ग्रुप I ह्यूमन कार्सिनोजन20के रूप में वर्गीकृत किया है । क्रिस्टलीय सिलिका की क्रिया का तंत्र 21 , 22,23के प्रतिक्रियाशील सतह के कारण लगातार सूजन के रूप में शामिल होने के माध्यम से मानाजाताहै । चूहों और चूहों दोनों में वीवो अध्ययनों मेंकई क्रिस्टलीय सिलिका24, 25, 26, 27,28,29 के संपर्क में सांस लेने के बाद ट्यूमर और फाइब्रोसिस सहित सूजन और हिस्टोपैथोलॉजी परिवर्तनों के शामिल होने की रिपोर्टकरतेहैं। ये सभी प्रभाव बार-बार एक्सपोजर और/या दीर्घकालिक अनुवर्ती कार्रवाई के बाद देखे जाते हैं । Calu-3 मॉडल की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि क्या वीवो अध्ययन में से टिप्पणियों एक इन विट्रो मॉडल है कि अली में बार-बार उजागर किया जा सकता है का उपयोग कर नकल की जा सकती है ।

Calu-3 कोशिकाओं को लगातार 3 सप्ताह, प्रति सप्ताह 5 दिन, 4 घंटे प्रति दिन DQ12 के लिए उजागर किया गया । जमा की गई खुराक को क्यूसीएम का उपयोग करके मापा गया था। औसत जमा खुराक प्रति दिन 120 एनजी/सेमी2 थी, जिसमें 1.6 माइक्रोग्राम/सेमी2की संचयी खुराक थी, जो वीवो में प्रभाव को प्रेरित करने वाली खुराक के समान थी। अन्य कण विशेषताओं को तालिका 1में दिखाया गया है। जोखिम के 3 सप्ताह के बाद, DQ12 टीयर, सेल व्यवहार्यता, और मोनोसाइट केमोएट्रेक्ट प्रोटीन 1 (एमसीपी-1) रिलीज में कोई महत्वपूर्ण प्रभाव प्रेरित, स्वच्छ हवा नियंत्रण(चित्रा 7) कीतुलना में । चूंकि वीवो डेटा के आधार पर DQ12 की अधिक विषाक्तता की उम्मीद थी, इसलिए यूरोपीय संघ-परियोजना अनुग्रह (डिलिवरेबल 5.3) के भीतर अनुकूलित प्रोटोकॉल के अनुसार एक एसेलुलर परख का उपयोग करके कणों की प्रतिक्रियाशीलता की जांच की गई थी। DQ12 बैच की प्रतिक्रियाशीलता उम्मीद से कम थी(चित्रा 8),सकारात्मक नियंत्रण कणों कार्बन ब्लैक (सीबी) की तुलना में परिमाण के आदेश कम। प्रतिक्रियाशीलता की यह कमी Calu-3 मॉडल में विषाक्तता प्रतिक्रिया के अभाव की व्याख्या कर सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: स्वचालित एक्सपोजर स्टेशन (एईएस)।
बायां आंकड़ा टच पैनल के साथ कैबिनेट के बाहर दिखाता है । एईएस में एक्सपोजर मॉड्यूल के साथ तीन स्तर हैं: स्वच्छ हवा एक्सपोजर के लिए शीर्ष स्तर, और एयरोसोल एक्सपोजर के लिए मध्य और नीचे का स्तर। सही आंकड़ा एक्सपोजर मॉड्यूल दिखाता है जिसमें कोशिकाओं के साथ आवेषण रखे जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक्सपोजर सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।
बाएं से दाएं: 1) एनएम निलंबन एक पेरिस्टाल्टिक पंप के माध्यम से स्प्रे नोजल से जुड़ा हुआ है; 2) संकुचित हवा का उपयोग स्प्रे नोजल एनएम निलंबन को अस्पष्ट करता है और एक मिश्रण कक्ष के माध्यम से एयरोसोल एईएस का नेतृत्व कर रहे हैं; 3) एईएस में प्रवेश करने से ठीक पहले, एयरोसोल चरित्र चित्रण उपकरण जुड़े हुए हैं: एसएमपी, ऑप्स, सीपीसी और टेओम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: 10 दिनों के लिए एयर-लिक्विड इंटरफेस (अली) पर खेती के बाद Calu-3 कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवि ।
10 दिनों के लिए अली में खेती के बाद Calu-3 कोशिकाओं की फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवि । टाइट जंक्शन प्रोटीन जेडओ-1 हरे रंग में दाग है, कोशिकाओं के नाभिक नीले रंग में दाग रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: 21 दिनों की संस्कृति अवधि के दौरान चार अलग-अलग सेल लाइनों का ट्रांसेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर)।
16HBE, Calu-3, H292, और BEAS-2B के TEER मूल्यों जब 21 दिनों के लिए सुसंस्कृत: पहले 7 दिन जलमग्न, अली में 14 दिनों के बाद । डालने के पृष्ठभूमि प्रतिरोध के लिए टीईईआर मूल्यों को ठीक किया गया था और डालने के सतह क्षेत्र से गुणा किया गया था। प्रतीकों और त्रुटि सलाखों के औसत मूल्य और छह आवेषण के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: 21 दिनों की संस्कृति अवधि के दौरान चार अलग-अलग सेल लाइनों का एलडीएच रिलीज।
16HBE, Calu-3, H292, और BEAS-2B की LDH रिलीज जब 21 दिनों के लिए सुसंस्कृत: 7 दिन जलमग्न, अली में 14 दिनों के बाद । दिखाए गए एलडीएच मान प्रति सेल प्रकार अधिकतम एलडीएच रिलीज के सापेक्ष हैं। प्रतीकों और त्रुटि सलाखों के औसत मूल्य और पांच आवेषण के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: Calu-3 एलपीएस के संपर्क में कोशिकाओं में सेलुलर प्रभाव।
Calu-3 कोशिकाओं को ०.२५ μg/सेमी2 एलपीएस के लिए बादल nebulization के माध्यम से उजागर किया गया । (A)WST-1 रूपांतरण । (ख)एलडीएच रिलीज । (C)एलपीएस एक्सपोजर के बाद टीएनएफ-α रिलीज । प्रतीकों और त्रुटि सलाखों के औसत मूल्यों और तीन आवेषण के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: Calu-3 कोशिकाओं में सेलुलर प्रभाव DQ12 नैनोमैटेरियल्स के संपर्क में ।
Calu-3 कोशिकाओं को 3 सप्ताह के लिए उजागर किया गया (4 घंटे प्रति दिन, प्रति सप्ताह 5 दिन) DQ12 नैनोमैटेरियल्स के लिए, के बारे में १२० एनजी/सेमी2 प्रति दिन, १.६ μg/सेमी2की संचयी खुराक । (A)टीईआर मूल्य । (ख)एलडीएच रिलीज । (C)DQ12 एक्सपोजर के बाद एमसीपी-1 रिलीज । सभी प्रतीकों और त्रुटि सलाखों के नियंत्रण के लिए तीन आवेषण और DQ12 जोखिम के लिए छह आवेषण के औसत मूल्यों और मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: DQ12 की एसेलुलर रिएक्टिविटी।
DQ12 को सतह की प्रतिक्रियाशीलता का पता लगाने के लिए 2,7-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए) जांच के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था । सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्बन ब्लैक (सीबी) कणों को शामिल किया गया। सीबी की तुलना में, DQ12 में बहुत कम सतह प्रतिक्रियाशीलता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

कण द्रव्यमान (μg/m3) कण संख्या (#/सेमी3) गतिशीलता कण आकार (एनएम) ज्यामितीय मानक विचलन ऑप्टिकल कण का आकार (माइक्रोन)
2969 (418) 83983 (10215) 66.6 2.5 1.1 (1.3)

तालिका 1: DQ12 एक्सपोजर विशेषताएं। मान कोष्ठक में मानक विचलन के साथ औसत के रूप में दिखाए जाते हैं।

Discussion

यह पत्र अली के तहत मानव ब्रोंकियल एपिथेलियल कोशिकाओं को तैयार करने और एयरोसोल या गैसों के लिए इस ब्रोंकियल मॉडल को उजागर करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है। Calu-3 कोशिकाओं का उपयोग करने का लाभ यह है कि वे तंग जंक्शनों के रूप में, एक मोनोलेयर रहते हैं, हवा के प्रवाह का सामना करने में सक्षम हैं, और अली में हफ्तों के लिए संस्कारी किया जा सकता है, कई अंय सेल प्रकार (जैसे, 16HBE, H292, और BEAS-2B) के विपरीत । विट्रोसेल ® स्वचालित एक्सपोजर स्टेशन (एईएस) का उपयोग करने से यह लाभ होता है कि कोशिकाओं को यथार्थवादी और प्रासंगिक परिस्थितियों में उजागर किया जा सकता है क्योंकि कम सांद्रता को निरंतर एयरफ्लो का उपयोग करके लागू किया जा सकता है।

एईएस जैसे निरंतर प्रवाह प्रणालियों में क्लाउड सिस्टम3, 32का उपयोग करने की तुलना में फायदे होते हैं, जो निलंबन के एकल नेबुलाइजेशन का उपयोग करते हैं। निरंतर प्रवाह अधिक यथार्थवादी है और प्रवाह दर, आर्द्रता और तापमान जैसे कई चर नियंत्रित होते हैं। इसके अलावा, एक विद्युत क्षेत्र का उपयोग करके बयान को बढ़ाया जा सकता है। अंत में, आकार, संख्या एकाग्रता और द्रव्यमान जैसी एयरोसोल विशेषताओं की ऑनलाइन निगरानी की जाती है। एक नुकसान यह है कि क्लाउड सिस्टम की तुलना में निरंतर प्रवाह प्रणालियां अधिक जटिल हैं। इसलिए, प्रारंभिक प्रयोगों को चलाना महत्वपूर्ण है जो एयरोसोल की कण विशेषताओं और डालने पर वितरित खुराक पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इसके बाद कणों और एईएस सेटिंग्स की प्रारंभिक शुरुआती एकाग्रता को कोशिकाओं पर वांछित खुराक प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकताहै। परीक्षण किए जा रहे कणों के प्रकार के आधार पर, एयरोसोल उत्पादन विधि भिन्न हो सकती है। इलेक्ट्रोस्टैटिक बयान का उपयोग कण प्रकार पर निर्भर करता है और धातु के कणों के लिए सबसे अच्छा काम करता है। एक सकारात्मक सतह चार्ज के साथ कणों के लिए एक नकारात्मक इलेक्ट्रोस्टैटिक क्षेत्र लागू किया जाना चाहिए और इसके विपरीत ।

एक्सपोजर सांद्रता का चयन किसी भी वायु-तरल एक्सपोजर प्रयोग के लिए मुश्किल हो सकता है। DQ12 एक्सपोजर के लिए, उद्देश्य 3 सप्ताह के एक्सपोजर के बाद 1 μg/सेमी2 की कुल संचयी खुराक प्राप्त करना था, प्रति सप्ताह 5 दिन, प्रति दिन 4 घंटे। यह खुराक उस खुराक के समान है जिसने वीवो21 , 25,27,32,33में प्रभाव को प्रेरित किया । एक्सपोजर करते समय, विभिन्न एक्सपोजर दिनों के बीच कुछ भिन्नता थी। हालांकि १.६ μg/सेमी 2 की वास्तविक जमा खुराक1 μg/सेमी2 है कि के लिए उद्देश्य था की तुलना में अधिक है, खुराक भी Calu-3 मॉडल में प्रभाव का पालन करने के लिए कम हो सकता है । स्वच्छ हवा के संपर्क और DQ12 एक्सपोजर के बीच टीयर, व्यवहार्यता और साइटोकिन प्रतिक्रिया में केवल मामूली अंतर देखे गए थे, और ये मतभेद सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थे। अवलोकन के लिए एक स्पष्टीकरण है कि 3 सप्ताह के लिए DQ12 जोखिम Calu-3 कोशिकाओं में महत्वपूर्ण प्रभाव पैदा नहीं किया है कि मैक्रोफेज Calu-3 मॉडल से कमी थी । संभवतः, DQ12 के बाद तेज मैक्रोफेज प्रोइनफ्लेमेटरी साइटोकिन्स का उत्पादन करते हैं जो कैलू-3 कोशिकाओं को प्रभावित कर सकते हैं। एक और स्पष्टीकरण यह है कि प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया DQ12 बैच अपेक्षा के अनुसार प्रतिक्रियाशील नहीं था। जब एक सकारात्मक नियंत्रण पदार्थ के रूप में एलपीएस का उपयोग कर, Calu-3 एक प्रतिक्रिया दिखाता है, के रूप में LDH रिलीज में वृद्धि और TNF में वृद्धि-α रिलीज से मापा जाता है । यह इंगित करता है कि मॉडल विषाक्तता का पता लगा सकता है।

कैलू-3 सेल मॉडल के कई फायदे हैं, जैसा कि परिणाम अनुभाग में चर्चा की गई है। इसके अलावा, जब अली में लंबे समय तक सुसंस्कृत होते हैं, तो कैलू-3 कोशिकाएं सिलिया/सिलिया जैसीसंरचनाएं 13 विकसित कर सकती हैं और बलगम11, 12,13का उत्पादन करसकतीहैं। इन फायदों के बावजूद, मॉडल की शारीरिक प्रासंगिकता के संबंध में सीमाएं हैं। कैलू-3 सेल लाइनें एडेनोकार्सिनोमा से निकलती हैं, जबकि 16HBE और BEAS-2B स्वस्थ ऊतक से निकलती हैं । दुर्भाग्य से, बाद के दो दोहराया अली जोखिम के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि वे समय के साथ एक स्थिर मोनोलेयर नहीं रहते हैं । कैलू-3 मॉडल की एक और सीमा यह है कि यह केवल एक सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है। मानव फेफड़ों में, कई सेल प्रकार जो बातचीत करते हैं और एक्सपोजर के लिए अलग-अलग प्रतिक्रिया देते हैं, मौजूद होते हैं। साँस वाले कण अपने वायुगतिकीय आकार के आधार पर फेफड़ों के विभिन्न क्षेत्रों में जमा होंगे। यह वह जगह है जहां कण एपिथेलियल सेल बैरियर से संपर्क करते हैं, जैसा कि कैलू-3 मॉडल द्वारा नकल की जाती है। मानव फेफड़ों में, अल्वेलर मैक्रोफेज कणों की ओर आकर्षित होते हैं, उन्हें निगल जाते हैं, और उन्हें फेफड़ों से साफ करते हैं। मैक्रोफेज कण जोखिम के लिए सूजन प्रतिक्रिया में एक आवश्यक भूमिका भी निभाते हैं। इसलिए फेफड़ों की बाधा को और अधिक बारीकी से नकल कराने के लिए प्राथमिक मैक्रोफेज को जोड़कर कैलू-3 मॉडल का विस्तार करने का प्रयास किया जा रहा है। मैक्रोफेज का नुकसान यह है कि वे केवल लगभग 7 दिनों तक व्यवहार्य रहते हैं जब अली में कैलू-3 कोशिकाओं के शीर्ष पर सुसंस्कृत होते हैं। इसलिए, वर्तमान कैलू-3 मॉडल को को कोक्चर मॉडल में बदलने के लिए मैक्रोफेज को साप्ताहिक रूप से फिर से जोड़ा जाना चाहिए। सहसंस्कृति प्रोटोकॉल का अनुकूलन वर्तमान में चल रहा है।

उपरोक्त को देखते हुए, कैलू-3 ब्रोंकियल मॉडल सिगरेट के धुएं और एलपीएस से रसायनों जैसे आंशिक रूप से घुलनशील पदार्थों के एयरोसोल के बार-बार संपर्क के लिए एक उपयुक्त मॉडल है। ये घुलनशील पदार्थ कैलू-3 कोशिकाओं में साइटोकिन प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण वृद्धि को प्रेरित करते हैं। डीजल निकास और DQ12 जैसे अघुलनशील कणों के परीक्षण के लिए, एक कूकल्चर मॉडल की आवश्यकता है, क्योंकि मैक्रोफेज कण जोखिम द्वारा प्रभाव को शामिल करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ।

वर्णित एक्सपोजर के लिए, 3.0 माइक्रोन छिद्रों के साथ झिल्ली डालें का उपयोग किया गया था। इस प्रकार के डालने को चुनने का मुख्य कारण यह है कि नैनोमैटेरियल्स के स्थानांतरण का परीक्षण करना संभव है। छोटे 0.4 माइक्रोन पोर आकार का उपयोग करते समय, कण समूह डालने वाली झिल्ली को पार करने में सक्षम नहीं होंगे। एक बड़े ताकना आकार का उपयोग करने का नुकसान यह है कि कोशिकाओं को एक लंबे समय के लिए मिलामोथ विकसित करने की जरूरत है और यह कि यह अधिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कोशिकाओं की आकृति विज्ञान कल्पना करने के लिए मुश्किल है । यह जांचने के लिए कि कोशिकाएं एक कॉन्फ्ल्यूरेंट मोनोलेयर बनाती हैं, एक्सपोजर शुरू करने से पहले टीईआर और 1,000 Ω एक्स सेमी2 होना चाहिए।

एक साथ लिया गया, यहां प्रस्तुत कैलू-3 ब्रोंकियल मॉडल कम से कम 3 सप्ताह तक एयरोसोल के बार-बार संपर्क के लिए उपयोग करने के लिए उपयुक्त है। मॉडल एक निरंतर एयरफ्लो के माध्यम से सुसंस्कृत और उजागर किया जा रहा है और ब्रोंकियल एपिथेलियम के लिए विषाक्तता का पता लगाने में सक्षम है का सामना कर सकते हैं ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को यूरोपीय संघ-परियोजना गश्ती (यथार्थवादी नैनोमटेरियल खतरा aSssment के लिए फिजिकली एंकर्ड टूल्स) और डच स्वास्थ्य, कल्याण और खेल मंत्रालय (परियोजना V/050012) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। हम पांडुलिपि की समीक्षा करने के लिए डॉ Yvonne Staal और डॉ जन वान Benthem शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M NaOH Sigma Aldrich S5881
0.1M (x10) PBS Gibco 14200-059
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) Sigma Aldrich D6883
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) Abcam ab141525
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific Inc. 15290
Automated exposure station Vitrocell
Cell proliferation reagent WST-1 Roche 11644807001
Centrifuge Eppendorf
CPC TSI inc., St Paul MN, USA 3022
Cytotoxicity detection kit LDH Roche 11644793001
DQ12 IOM nanomaterials
ELISA Ready-SET-Go Fischer Scientific 88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2 World Precision Instruments Inc., FL, USA EVOM2-STX2
FBS Greiner bio-one 758093
Flow splitter TSI inc., St Paul MN, USA model 3708
Fluorescein diacetate (F-DA) Sigma Aldrich F7378
HBSS Thermo Fisher Scientific Inc. 14175
Light microscope Olympus CKX41
Mass flow controllers MFC, Bronkhorst, the Netherlands
Methanol (analytical grade) Sigma Aldrich 34860
Microbalance Sartorius, Goettingen, Germany ME-5
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific Inc. 41090
NEAA Thermo Fisher Scientific Inc. 11140
OPS TSI inc., St Paul MN, USA 3339
Pen/Strep Thermo Fisher Scientific Inc. 15140
Phenol red free MEM Gibco 10500-064
Pure water Merck MilliQ
SMPS TSI inc., St Paul MN, USA 3936
Spray nozzle Schlick, Coburg, Germany
Teflon filters Pall R2PJ46
TEOM Rupprecht & Patashnick NY, USA series 1400
Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific Inc. 690175, 658175, 660175
Transwell inserts Corning 3460, 3462
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific Inc. 25300
Tryptan Blue Sigma Aldrich T8154

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References

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  3. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
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Braakhuis, H. M., He, R., Vandebriel, R. J., Gremmer, E. R., Zwart, E., Vermeulen, J. P., Fokkens, P., Boere, J., Gosens, I., Cassee, F. R. An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (159), e61210, doi:10.3791/61210 (2020).More

Braakhuis, H. M., He, R., Vandebriel, R. J., Gremmer, E. R., Zwart, E., Vermeulen, J. P., Fokkens, P., Boere, J., Gosens, I., Cassee, F. R. An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (159), e61210, doi:10.3791/61210 (2020).

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