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Biology

독성 테스트를 위해 공기 중 입자에 대한 사실적이고 반복적인 흡입 노출을 위한 공기 액체 인터페이스 기관지 상피 모델

doi: 10.3791/61210 Published: May 13, 2020

Summary

설명된 세포 배양 및 생체 내 기관지 모델의 세포 배양 및 노출 방법은 독성 검사를 위한 입자에 대한 사실적이고 반복적인 흡입 노출을 위한 것이다.

Abstract

공중 입자의 독성 테스트를 위해, 공기 액체 인터페이스 (ALI) 노출 시스템은 현실적인 노출 조건을 모방하기 위해 시험관 내 테스트를 위해 개발되었습니다. 이것은 세포 배양 모형에 특정 한 요구를 둡시합니다. 많은 세포 모형은 공기에 노출에 의해 부정적인 영향을 받습니다 (예를 들면, 건조) 단지 며칠 동안 유효합니다. 이렇게 하면 이러한 모델에서 사용할 수 있는 노출 조건을 제한합니다: 일반적으로 상대적으로 높은 농도는 짧은 기간 내에 클라우드(즉, 입자를 포함하는 액적)로 적용됩니다. 이러한 실험 조건은 입자의 낮은 농도에 현실적인 장기 노출을 반영하지 않습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 인간 기관지 상피 세포주 사용, Calu-3조사되었다. 이 세포는 건강한 형태와 단단한 접합을 가진 안정된 단층을 유지하면서 몇 주 동안 ALI 조건에서 배양될 수 있습니다. 또한, 본 기관지 모델은 ALI 노출 시스템을 사용하여 공기 중 입자의 낮고 사실적인 농도에 반복적으로 노출되는 효과를 테스트하는 데 적합합니다. 이 시스템은 클라우드를 생성하는 단일 분무기를 사용하는 다른 ALI 노출 시스템과 달리 연속 기류를 사용합니다. 따라서, 연속 유동 시스템은 입자 특성, 노출 농도 및 전달 용량을 지속적으로 모니터링하면서 공기 중 입자에 반복적이고 장기간 노출에 적합합니다. 이 기관지 모델은 연속 유동 노출 시스템과 함께 독성 테스트에 사용할 수 있는 사실적이고 반복된 흡입 노출 조건을 모방할 수 있습니다.

Introduction

폐는 공기 중 입자에 흡입 노출에 취약합니다. 공기 중 입자의 잠재적 독성을 평가하기 위해 공기 액체 인터페이스(ALI) 노출 시스템1,2,3,4,5를개발하기 위한 진전이 이루어졌습니다. ALI 노출 시스템은 입자6의특성과 운동성을 변화시키는 배양 매체를 통한 기존의 침수 된 노출에 비해 보다 관련성이 있고 사실적인 노출 모델을 허용합니다. ALI 노출 시스템은 모델이 배양 배지가 부족하고 따라서 액면에 영양이 부족하기 때문에 세포 배양 모델에 특정 요구를 배치합니다. 많은 세포 모델은 공기 중(예: 건조)에서 배양되고 노출됨으로써 부정적인 영향을 받고 며칠 동안만 실행 가능합니다. 이것은 이러한 모델에서 사용할 수 있는 노출 조건을 제한합니다: 일반적으로 상대적으로 높은 농도는 구름으로 짧은 기간 내에 적용됩니다(즉, 입자를 포함하는 방울, 즉, 빠르게 정착하는 물방울). 이러한 실험 조건은 입자의 낮은 농도에 현실적인 장기 노출을 반영하지 않습니다; 따라서 결과의 관련성에 의문을 제기할 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 인간 기관지 상피 세포주 Calu-37로 구성된 기관지 모델에 대한 배양 및 노출 프로토콜이 최적화되었다.

ALI 노출에 사용되는 대부분의 체외폐 모델은 A549, BEAS-2B 및 16HBE14o-(16HBE) 또는 1차 세포와 같은 다른 세포주를 기초8로함유하고 있다. 이러한 세포주는 ALI에서 배양할 때 며칠 동안만 실행 가능한 상태로 남아 있다는 단점이 있습니다. 또한, 이러한 세포주 중 일부는 5일 이상 동안 배양될 때 과도하게 증가한다. 마지막으로, A549 세포는 기능적 단단한 접합을 놓치므로 폐9,10을모방하는 데 필요한 단단한 장벽을 형성할 수 없습니다. 1 차상 피 세포는 몇 주 동안 ALI에서 배양 될 수 있기 때문에 ALI 노출에 대한 좋은 옵션이 될 수 있습니다. 그러나, 1 차 적인 세포는 배치마다 다르고, 유지 관리가 더 어렵고, 세포주에 비해 더 비싸므로 독성 검사 및 스크리닝에 덜 적합합니다. 다른 인간 기관지 상피 세포주 (16HBE, Calu-3, H292 및 BEAS-2B)를 비교할 때, 칼루-3 세포만이 현실적이고 반복된 ALI 노출에 필요한 모든 기준을 충족합니다: 그들은 ALI에서 배양하는 동안 몇 주 동안 실행 가능한 상태를 유지하고, 높은 장벽 무결성을 제공하고, 과도하게 성장하지 않으며, 배양과 유지가 용이합니다. Calu-3 세포는 선암에서 유래하고점액(11,12)을생성할 수 있다. 세포가섬모(11,13)를개발할 수 있는지에 대한 불일치가 있다. 칼루-3 세포는 또한 섬모기도 상피세포(14)를감염시키는 호흡기 싱크성 바이러스(RSV) 감염을 연구하기에 적합한 모델이다.

셀 모델 외에도,에어로졸(15,16)에공기 액체 노출에 자동 노출 시스템(AES)이 사용된다. AES는 연속 기류를 사용하여 세포 모델을 에어로졸에 노출시키는 장점이 있습니다. 이는 일반적으로 구름(즉, 빠르게 정착하는 입자를 포함하는 액적)으로서 단기간 내에 상대적으로 높은 농도를 사용하는 다른 공기-액체 노출 시스템과 는 대조적이다)17,18,19. 이러한 클라우드 시스템은 입자의 낮은 농도에 대한 현실적인 장기 노출을 반영하지 않습니다. AES를 사용하여 연속 기류를 적용함으로써, 셀 모델은 사실적인 노출 조건을 반영하여 더 긴 기간 동안 입자의 낮은 농도에 노출될 수 있다. 클라우드 시스템보다 또 다른 장점은 AES가 파티클 특성화 계측기를 연결하여 시간이 지남에 따라 입자 크기, 수 농도 및 질량을 측정할 수 있다는 것입니다. AES의 제한은 10mL/min과 100mL/분 사이의 비교적 높은 공기 흐름을 사용한다는 것입니다.

Protocol

1. 세포 배양 배지 준비 (CCM)

  1. 글루타민으로 보충된 최소 필수 매체(MEM)의 500mL 병을 준비합니다.
  2. 페니실린 연쇄 절제술(즉, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 연쇄절제술)의 5mL를 추가합니다.
  3. 비필수 아미노산(NEAA) 용액 5mL를 추가합니다.
  4. 앰포테리카진 B(선택 사항)의 10mL를 추가합니다.
  5. FBS의 50 mL을 추가 (열 비활성화, 열 비활성화에 대한 ATCC 프로토콜을 따르십시오; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20가이드/AnimCellCulture_Guide.ashx, 페이지 19)).

2. 칼루-3 셀의 분수

참고: Calu-3 세포는 T75 또는 T175 세포 배양 플라스크에서 37°C 및 5% CO2에서배양된다. 세포는 2-3일마다 CCM 갱신으로 7일마다 60-80%의 인플루엔트에서 통과됩니다. CCM은 부어및 신선한 CCM(T25 = 5mL, T75 = 15mL 및 T175 = 25 mL)을 플라스크로 피펫하고 플라스크는 인큐베이터로 다시 배치된다. 세포는 해동 후, 실험에서 사용하기 전에 또는 동결하기 전에 적어도 2배 이상 통과되어야 하며, 총 25배 이상 통과해야 합니다.

  1. 플라스크가 60-80% 컨실수 인지 가벼운 현미경으로 확인 하십시오.
  2. 플라스크에서 CCM을 붓습니다.
  3. 칼슘없이 마그네슘없이 1 x 행크스의 균형 소금 용액 (HBSS)의 5mL로 세포를 2 배 세척합니다. 세척 할 때마다 HBSS를 폐기하십시오. HBSS는 트립신을 억제하는 혈청을 제거합니다.
  4. T75(T175의 경우 4mL)에 트립신-EDTA 3mL을 추가하고 플라스크를 37°C, 10-15분 동안 5%CO2로 다시 인큐베이터에 넣습니다. 10분 후에 세포가 플라스크 표면에서 분리되었는지 확인합니다. 세포가 >80%로 성장하는 경우 트립신 0.05%를 사용하지 않으며 트립신 0.25%를 사용할 수 있습니다.
  5. 플라스크에 CCM의 6mL(즉, 원래 추가된 트립신-EDTA 볼륨의 두 배)를 추가하고 플라스크를 부드럽게 흔들어 적절한 혼합을 보장합니다. 이것은 트립신이 CCM에 있는 FBS에 의해 중화되고 세포에 그것의 활동이 중단되었는지 확인하기 위한 것입니다. 트립신이 너무 오랫동안 세포와 접촉할 수 있는 경우 새로운 세포 배양 플라스크에 넣으면 다시 부착되지 않습니다.
  6. 플라스크의 전체 내용을 50mL 원심분리기 튜브에 붓습니다.
  7. 원심 분리기는 130 x g에서5 분 동안 세포를 원심 분리하여 원심분리기가 올바르게 균형을 이루도록 합니다.
  8. 세포를 함유한 유리병을 무균 상태로 되돌리고 펠릿을 방해하지 않고 초본을 부드럽게 제거합니다. 상체는 부어질 수 있고 나머지는 펠릿이 방해받지 않도록 피펫을 벗겨낼 수 있습니다.
  9. 모든 세포가 일시 중단될 때까지 위아래로 피펫팅하여 CCM의 1mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다(즉, 펠릿 또는 세포 응집체가 관찰되지 않습니다). 추가 CCM은 세포 현탁액을 희석하기 위해 첨가될 수 있다.
  10. 혈류계를 사용하여 CCM의 1mL에서 죽은 세포와 살아있는 세포를 계산합니다. 적절한 계산에 필요한 경우 세포를 3 또는 4 mL로 희석하십시오.
  11. 필요한 CCM 부피로 세포를 일시 중단하고 각 플라스크에 셀 서스펜션을 추가합니다. 일주일에 약 80%의 인플루엔티지를 달성하기 위해 T75 또는 6 x 106 세포에서 T75 또는 6 x 10 6 세포에서 종자 2 x 106 세포를 T175에 종자.
  12. 플라스크를 부드럽게 흔들어 서 37°C및 5% CO2에서인큐베이터에 다시 넣습니다.
  13. 세포가 60-80%에 도달하면 2-3일마다 신선한 CCM과 하위 배양으로 교체하십시오.

3. 배양 물자에 Calu-3 세포를 파종

참고: 인서트가 다른 기공 크기로 제공됩니다. 작은 기공 크기(예를 들어, 0.4 μm)는 세포가 더 쉽게 성장하고 트랜스 상피 전기 저항(TEER)에 의해 측정된 바와 같이 침수된 조건에서 5일 배양 후 이미 좋은 장벽을 달성할 수 있다는 장점이 있다. 그러나 입자 전좌에 관심이 있을 때 이러한 모공은 너무 작아서 입자를 트랩합니다. 따라서, 더 큰 공공 크기 (예를 들어, 3 μm)는 일반적으로 입자를 테스트하기 위해 선택된다. 더 큰 공공 크기를 사용하는 경우, 세포는 좋은 TEER를 달성하기 위해 더 긴 기간 (예를 들어, 침수 된 조건하에서 배양 7-10 일)이 필요합니다.

  1. 2.1-2.10 단계 다음 알려진 농도로 세포 현탁액을 준비합니다.
  2. 6 웰 인서츠에 대한 전동 CCM에서 5 x 105 셀 / mL의 농도로 세포를 희석하거나 12 잘 삽입할 경우 2.5 x 105 셀 /mL.
  3. 무균 조건하에서 인서트와 배치가 있는 세포 배양판을 가져 가라.
  4. 바소측면을 6웰 인서츠용 전소 CCM 2mL, 12웰 인서츠용 1mL로 채우는 다. 배양 매체를 추가하는 동안 핀셋을 사용하여 삽입을 꺼내십시오.
  5. 셀 서스펜션을 위아래로 피펫팅하여 조심스럽게 혼합합니다. 파이펫 1.0 mL 6 웰 인서트및 500 μL 12개의 우물 인서트(100,000세포/cm 2에 해당)를 위한 피펫 1.0 mL은세포 배양물에서 멤브레인트 상단에 0.4 μm 모공을 삽입한다. 3.0 μm 모공의 경우 세포 밀도를 128,000 셀/cm2로늘립니다.
  6. 세포 배양판을 덮고 37°C 및 5% CO2에서배양한다.
  7. 2-3일마다 CCM을 변경합니다.
  8. ALI에서 배양을 계속하기 전에 침수 된 조건에서 7 일 동안 세포가 침수되도록하십시오.
  9. TEER를 측정합니다.
    1. 젓가락 전극 세트로 보충된 상피 볼토암미터를 타고 하룻밤 동안 배터리 시스템을 충전하십시오.
    2. 충전기에서 Voltohmmeter를 분리하고 젓가락 전극을 연결합니다.
    3. 전극을 70% 에탄올로 청소합니다.
    4. 전극을 외부 배양 매체에 더 긴 전극을 넣고 접시의 바닥에 닿을 때까지, 멤브레인을 건드리지 않고 매체에 더 짧은 전극을 넣는다.
    5. 셀없이 빈 삽입으로 시작합니다. 측정이 안정될 때까지 기다렸다가 Ohms의 저항성을 적어 둡니다. 이 측정은 어떤 세포 (즉, 빈 저항)없이 삽입 막의 저항이다.
    6. 각 인서트에 대한 측정을 반복하고 빈 저항을 빼서 진정한 저항을 얻습니다.
    7. 데이터 분석의 경우 인서트 의 표면적별로 저항 값을 Ω x cm2로곱한다. 6 웰 인서치의 경우 표면적은 4.67cm2입니다. 따라서 600 옴의 저항을 측정하고 배경이 120 옴인 경우 저항은 480 옴이며, 그 다음 총 2,241.6 ohm x cm2의표면적 4.67cm2를 곱한다. TEER은 계속하려면 >1,000 Ω x cm2여야 합니다.
  10. 인서츠의 정면에서 CCM을 제거합니다.
  11. 6웰에 대해 2mL의 전소 CCM과 1mL에 12개의 잘 삽입하여 웰의 바소포측(즉, 세포 배양 삽입물)을 추가합니다. CCM은 바닥에서 멤브레인을 만져야하지만 인서치의 상단에 누설되지 않아야합니다.
  12. 이 시점에서 세포는 ALI에서 배양이라고 하는 공기에 정적으로 노출됩니다.
  13. 노출 7일 전에 인큐베이터에서 ALI에서 배양세포37°C 및 5%CO2를 나타낸다.
  14. 2-3일마다 바소쪽 CCM을 변경합니다. 세포는 6주 동안 ALI에서 사용할 수 있다.

4. 노출 설정 준비

참고: 섹션 5-7에서는 자동 노출 스테이션(AES, 재료 표 참조)을 사용하여 입자 노출 에 대한 준비를 설명합니다. 입자 성운 화 및 특성화를 위한 설정은 다른 제조업체의 다른 ALI 노출 시스템과도 호환됩니다. 예를 들어, 입자에 대한 노출은 아래에 설명되어 있습니다. 이러한 시스템은 감광제, 담배 연기 및 디젤 배기와 같은 다른 노출에도 사용할 수 있습니다. 도 1은 AES 및 노출 모듈을 나타낸다. 도 2는 다른 모든 계측기를 포함하는 노출 설정의 회로도 표현을 나타낸다.

  1. AES를 사용하여 노출을 시작하기 전에 시스템을 여러 계측에 연결하여 에어로졸 특성을 측정합니다. 이들은 에어로졸이 캐비닛에 들어가기 직전에 측면 스트림에서 측정됩니다.
    참고: 플로우 스플리터를 사용하여 측면 스트림을 노출 특성화 장비에 연결합니다. 일반적으로, 다음 장비는 이동성 입자 시저(SMPS), 광학 입자 시저(OPS), 응축 입자 카운터(CPC), 테이퍼드 요소 진동 마이크로밸런스(TEOM)와 같은 장비가 사용된다. SMPS 및 OPS 측정은 시간당 1배씩 수행되며 유동 스플리터에서 동일한 튜브를 사용합니다. CPC와 TEOM은 연속 측정을 수행하고 두 데이터 모두 다람쥐 모델 2020 데이터 로거에 기록됩니다. 또한, 중력 질량 농도는 대조된 상대 습도(40-70%)에서 미세균형을 사용하여 결정됩니다. 및 온도 (21-23 °C) 조건. 테플론 필터는 노출 농도를 확인하기 위해 각 노출 전후의 무게를 측정합니다. 배기를 캡처하려면 HEPA 필터가 사용됩니다. 엔지니어링 된 나노 물질 (ENM) 서스펜션 및 분무기를 포함한 설정은 모두 사람들에게 노출되는 것을 방지하기 위해 흐름 캐비닛에 배치됩니다. AES는 금속 및 금속 산화물을 포함한 다양한 유형의 ENM을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다.
  2. 노출 직전에 나노 물질 현탁액을 준비합니다. 일반적으로 1% 서스펜션은 주식 솔루션으로 제조됩니다. 예를 들어, 100 mg의 나노 물질을 순수한 물의 10mL에서 중단하십시오.
    참고: DQ12 노출의 경우 300 mg이 약 2 μg/cm2를달성하는 데 사용됩니다. 이 양은 단일 노출또는 반복노출에 대해 나눌 수 있다(예를 들어, 300 mg은 단일 노출을 위해 30mL로 일시 중단되거나 21.5 mg은 3주 동안 매일 2.15mL로 매달아 일시 중단됨). 서스펜션은 노출 당일에 신선하게 준비됩니다. 입자 서스펜션은 프로브 초음파 처리를 사용하여 16 분 동안 초음파 처리됩니다. 1% 스톡 솔루션의 부피는 순수한 물을 추가하여 총 100mL의 부피로 조정됩니다.
  3. ENM 서스펜션을 캡과 마그네틱 교반기를 장착한 작은 병에 넣어 입자의 침전을 방지합니다. 작은 튜브를 통해 연동 펌프에 병을 연결하고 25 mL /h로 흐름을 조정합니다.
  4. 연동 펌프를 스프레이 노즐에 연결하고 설정을 조정하여 연속 에어로졸라이제이틱을 허용합니다.
  5. 스프레이 노즐은 60cm 길이의 알루미늄 튜브(혼합 챔버, 직경 15cm, 60°C로 가열)에 장착됩니다. 설정은 1.5 미터 길이의 구리 튜브 (직경 15cm)를 통해 AES에 연결됩니다. AES 위에 는 충격기가 2.5 μm보다 큰 모든 에어로졸을 제거합니다.
  6. 스프레이 노즐을 MFC(질량 유량 컨트롤러)를 통해 압축 공기 3바에 연결하여 서스펜션의 분운을 허용합니다. 14 L/min의 하나의 흐름은 분무 노즐에 사용되며, 다른 MFC는 튜브내 공기를 혼합하는 데 사용됩니다.
  7. 노출이 시작되기 전날, AES를 켜서 캐비닛이 37°C의 온도에 도달할 수 있도록 합니다.
  8. 노출시작 2시간 전에 캐비닛의 공기 흐름과 습도를 켜고 85%의 습도에 도달합니다. 세포와 삽입이 배치되는 노출 챔버의 가열을 켭니다.
  9. 쿼츠 마이크로 밸런스(QCM)를 켜고 소프트웨어를 사용하여 초기 값을 0으로 설정합니다. 로깅을 시작합니다. 매10s마다 질량을 측정하고 ng/cm2로표현한다.
  10. 수조에서 세포 배양 배지를 37°C로 데우세요(~20~30분).

5. 노출을 위한 Calu-3 셀 준비

참고: AES를 사용하는 일반적인 ALI 노출의 경우 컨리치 셀 레이어가 있는 15-20개의 인서트가 필요합니다. 이들은 3개의 깨끗한 공기 제어, AES에 노출되지 않고 다른 인서트와 유사하게 처리될 3개의 인큐베이터 컨트롤, 에어로졸 노출을 위한 6-8인서트(0, 1 또는 2마이크로저드의 사용에 따라), 제어 측정을 위한 1-3인서트(예: 최대 LDH 방출) 및 일부 삽입물의 TEER의 경우 3개의 예비 인서트로 구성됩니다. 세포는 계속하려면 >1,000 Ω x cm2의 TEER가 있어야합니다.

  1. 노출 첫날에는 CCM로 셀 1x를 세척하고 세포 형태학을 확인하고 Voltohmmeter를 사용하여 세포 모델의 TEER를 측정합니다. 세포는 간격없이 단단한 단층층을 형성해야합니다.
  2. FCS 없이 완충된 CCM 의 2mL/1 mL을 6웰/12웰 플레이트의 바소포측에 넣고 세포와 함께 배양 삽입을 새로운 플레이트로 옮길 수 있다.
    참고: 노출 중에 AES에는 CO2가 없습니다. 따라서, HEPES 완충 배양 배지(25mHEPES)는 수송 및 노출 중에 사용된다. 이 매체는 AES의 노출된 세포뿐만 아니라 인큐베이터 제어 셀모두에 사용된다.
  3. AES로 세포 배양을 운반하는 시간이 5분 이상인 경우, 수송 시 37°C의 휴대용 인큐베이터에 세포를 넣는다.

6. 노출 중 AES 처리

  1. AES에서 태아 종아리 혈청(FCS)없이 HEPES 버퍼링 CCM로 노출 모듈을 채웁니다. CCM의 양은 사용되는 단위 및 세포 배양 삽입유형에 따라 달라집니다. ALI에 세포를 유지하려면 배지가 멤브레인의 바닥에 도달해야하지만 멤브레인 의 상단에 누출해서는 안됩니다. 6개의 웰 인서트를 사용하는 경우 노출 모듈에 HEPES 버퍼링CCM 6mL을 추가합니다.
  2. 멸균 핀셋을 사용하여 플레이트에서 노출 모듈로 세포와 함께 인서트를 전송합니다. 세포의 바소포측에 기포가 없는지 확인하고 인서트 측의 CCM을 제거한다. 바소포측에 기포가 있는 경우, 멸균 핀셋을 사용하여 인서트를 부드럽게 돌리면 제거됩니다. 노출 후 전송을 위해 CCM이 포함된 플레이트를 인큐베이터에 보관하십시오.
  3. 터치스크린 디스플레이를 사용하여 노출 지속 시간, 공기 유량 및 정전기 증착 향상을 선택합니다. 디스플레이는 습도와 온도를 확인하는 데 사용할 수도 있습니다. 일반적으로 4h의 노출 지속시간이 선택되며, 37°C및 85%의 습도에서 인서트에 50mL/min의 유량이 선택됩니다.
    참고: 첫 번째 레벨의모듈(그림 1)은깨끗한 공기 노출에 사용됩니다. 이 레벨의 인서트가 깨끗한 공기 노출 컨트롤로 사용됩니다. 2층과 3층의 다른 모듈은 상영크리스탈 마이크로저울림(QCM)을 위한 두 개의 모듈을 포함하여 에어로졸 노출에 사용될 수 있다.
  4. 누출 테스트는 노출을 시작하기 전에 실시되어야 합니다. 누출은 5mL/분 미만이어야 합니다. AES 디스플레이의 지침을 따르십시오. 누출 테스트가 완료되면 노출을 시작할 수 있습니다. 누출의 경우 튜브를 확인해야합니다.
  5. 노출이 끝나면 AES 모듈의 문을 열고, 노출 모듈을 열고, 세포 배양 삽입을 세포 배양 판에 다시 배치하고, 플레이트를 휴대용 인큐베이터로 옮길 수 있습니다.
  6. 젖산 탈수소효소(LDH) 측정과 같은 이후 분석을 위해 모듈(즉, 노출된 샘플)과 플레이트(즉, 인큐베이터 컨트롤)에서 미디어를 수집합니다.
  7. 다시 세포 배양 실험실에서, 새로운 표준 CCM로 채워진 플레이트에 세포 배양 인서트를 전송. 다음 노출 또는 분석 전까지 세포 배양 판을 인큐베이터에 넣습니다.
  8. 마지막 노출 일 후, 다음 날까지 인큐베이터에 인서트를 넣어.
  9. 최종 노출 다음 날, 표피 측에 CCM을 추가하여 Voltohmmeter를 사용하여 TEER를 측정합니다. 사이토카인 분석을 위해 정점과 바소자측 CCM을 별도로 수집합니다.
  10. 모든 CCM을 제거하고, 예를 들어, 증식 시약을 apical 측에 추가하여 세포 생존성 분석기를 수행한다.

7. AES 청소

  1. 노출 모듈을 물로 채우고 1분 동안 기다렸다가 물을 제거합니다. 다음으로 모듈을 70% 에탄올로 채우고 10분 동안 방치하고 에탄올을 제거합니다. 70%의 에탄올로 도노출 트럼펫을 청소하십시오.
  2. 85% 습도 제어를 중지하지만 다음 실험을 위해 캐비닛의 온도를 37°C로 둡니다.

Representative Results

이 문서에서는 독성 검사에 사용할 수 있는 사실적이고 반복적인 흡입 노출 조건을 모방하는 ALI에서 인간 기관지 상피 세포를 배양하고 노출시키는 방법을 제공합니다. 셀 모델과 노출 시스템의 특성은 반복노출에 사용될 수 있는 사실적인 흡입 노출 모델을 달성하는 데 필수적입니다. 이러한 특성에 대한 결과는 다음과 같습니다.

셀 모델 요구 사항 및 선택

적합한 셀 모델을 선택할 때 다음 특성을 고려해야 합니다.

  1. 세포 모델은 폐 장벽을 모방하기 위해 단단한 접합을 작동하는 컨리치 모노레이어를 형성할 수 있어야 합니다.
  2. 셀 모델은 컨디셔닝(온도 및 습도) 공기에 반복적으로 노출될 때 최적의 성능을 보여줘야 합니다.
  3. 셀 모델은 노출에 반응해야 합니다.

이 연구는 4개의 다른 인간 기관지 상피 세포주로 시작했습니다: 16HBE, Calu-3, H292 및 BEAS-2B. 이들은 모두 널리 나노 물질 및 화학 물질의 독성 테스트에 사용 됩니다. 4개의 세포주 중, 칼루-3 세포만이 위의 모든 요구 사항을 충족시켰다. 세포는 TEER에 의해 측정된 바와 같이 시간이 지남에 따라 안정된 장벽을 유지한 단단한 접합부(도3)를가진 단층층을 형성한 반면, 다른 세포주는 벽을 형성하지 않았거나 ALI(도4)에서배양할 때 장벽 기능의 하락을 보였다. 또한, H292 및 BEAS-2B는 더 긴 기간 동안 배양할 때 다중 세포 층으로 과도하게 성장하는 경향이 있었다. ALI 영양소에서만 바식측에서만 사용할 수 있었고 세포가 정측의 건조한 조건에 노출되었기 때문에 기존의 침수된 세포 배양 및 ALI 배양은 크게 차이가 있었다. 이러한 조건은 시간이 지남에 따라 세포 생존가능성을 측정하여 관찰될 수 있는 세포 모델에 스트레스를 일으킬 수 있습니다. 세포주 16HBE, H292 및 BEAS-2B는 모두 ALI에서 배양할 때 LDH 방출이 증가하는 반면, Calu-3 세포는 약간의 LDH방출(도 5)만보였다.

다음으로, 물질에 대한 Calu-3 모델의 반응을 테스트했습니다. 양성 조절 물질로서, LPS는 모델의 정압측으로 분운화를 통해 투여되었다. 증착된 투여량은 0.25 μg/cm2. 칼루-3 세포는 LDH 방출의 증가와 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)방출(도 6)에의한 리포폴리사카라이드(LPS)에 대한 반응을 보였다.

마지막으로, 칼루-3 단층은 석영 실리카 (DQ12) 나노 물질 (IOM, 에든버러)에 노출되었다. 결정실리카는 실리코시스를 유발할 수 있으며 폐 종양을 유발할 수도 있다. 따라서 국제암연구기구(IARC)는 결정성 실리카를 그룹 I 인간발암물질(20)으로분류했다. 결정실리카의작용 기전은 반응성표면(21,22,23)에의한 지속적인 염증의 유도를 통해 생각된다. 쥐와 마우스 모두에 있는 몇몇 생체 내 연구 결과는 결정실리카24,25,26,27,28,29에흡입 노출 후에 종양과 섬유증을 포함하여 염증및 조직 병리학 변경의 유도를 보고합니다. 이러한 효과 모두 반복 노출 및/또는 장기 후속 후에 관찰 됩니다. Calu-3 모델은 생체 내 연구에서 관찰이 ALI에서 반복적으로 노출될 수 있는 체외 모델을 사용하여 모방될 수 있는지 여부를 조사하는 데 사용되었습니다.

Calu-3 세포는 3주 연속, 주 5일, DQ12까지 하루 4시간 동안 노출되었다. 증착된 투여량은 QCM을 사용하여 측정하였다. 평균 증착 용량은 하루에 120 ng/cm2였으며, 누적 투여량은 1.6 μg/cm2로,생체 내 효과를 유도하는 용량과 유사했다. 다른 파티클 특성은 표 1에표시됩니다. 3주 간의 노출 후, DQ12는 청결 공기제어(도 7)에비해 TEER, 세포 생존가능성 및 단핵구 화학요법 단백질 1(MCP-1) 방출에 유의한 효과를 유발하지 않았다. 생체 내 데이터를 기반으로 DQ12의 독성이 더 많이 예상됨에 따라, EU-프로젝트 내에서 최적화된 프로토콜에 따라 세포 분석체를 사용하여 입자의 반응성을 점검하였다(결과물 5.3). DQ12 배치의 반응성은 예상보다 낮았다(그림8),양극제어 입자탄소블랙(CB)에 비해 크기가 낮았다. 반응성의 이 부족은 Calu-3 모형에 있는 독성 반응의 부재를 설명할 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 자동 노출 스테이션(AES)입니다.
왼쪽 그림은 터치 패널이 있는 캐비닛 의 외부를 보여줍니다. AES는 노출 모듈이 있는 세 가지 수준( 깨끗한 공기 노출을 위한 최상위 수준, 에어로졸 노출의 중간 및 하단 수준)을 가지고 있습니다. 올바른 그림은 셀삽입이 배치되는 노출 모듈을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 노출 설정의 회로도 표현.
왼쪽에서 오른쪽으로: 1) 연동 펌프를 통해 스프레이 노즐에 연결된 ENM 서스펜션; 2) 압축 공기를 사용하여 스프레이 노즐은 ENM 서스펜션을 성운시키고 혼합 챔버를 통해 에어로졸이 AES로 이끌려; 3) AES에 들어가기 직전에 에어로졸 특성화 기기가 연결되어 있습니다: SMPS, OPS, CPC 및 TEOM. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 10일 동안 공기-액체 인터페이스(ALI)에서 배양한 후 Calu-3 세포의 대표적인 이미지.
10 일 동안 ALI에서 배양 한 후 Calu-3 세포의 형광 현미경 이미지. 단단한 접합 단백질 ZO-1은 녹색으로 염색되고, 세포의 핵은 파란색으로 염색된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 21일의 배양 기간 동안 4개의 상이한 세포주중환피성 전기저항(TEER).
TEER 값 16HBE, Calu-3, H292 및 BEAS-2B는 21일 동안 배양될 때: 처음 7일 동안 잠수하고, ALI에서 14일 동안 이다. TEER 값은 인서트의 배경 저항을 위해 수정하고 삽입의 표면적을 곱했습니다. 기호 및 오류 막대는 6개의 인서트의 평균 값 및 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 21일의 배양 기간 동안 4개의 상이한 세포주 LDH 방출.
LDH 릴리스16HBE, Calu-3, H292, BEAS-2B 21 일 동안 배양 할 때 : 7 일 침수, ALI에서 14 일. 표시된 LDH 값은 셀 유형당 최대 LDH 방출을 기준으로 합니다. 기호 및 오류 막대는 5개의 인서트의 평균 값 및 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: LPS에 노출된 Calu-3 세포의 세포 효과.
Calu-3 세포는 구름 성운화를 통해 0.25 μg/cm2 LPS로 노출되었다. (A)WST-1 변환. (B)LDH 릴리스. (C)LPS 노출 후 TNF-α 방출. 기호 및 오류 막대는 평균 값과 세 개의 삽입의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: DQ12 나노 물질에 노출된 Calu-3 세포의 세포 효과.
Calu-3 세포는 DQ12 나노 물질에 3 주 (하루 4 시간, 주 5 일)에 노출되었으며, 하루에 약 120 ng / cm2, 누적 투여량 1.6 μg /cm2. (A)TEER 값입니다. (B)LDH 릴리스. (C)DQ12 노출 후 MCP-1 릴리스. 모든 심볼 및 오류 막대는 컨트롤에 대한 세 개의 인서트와 DQ12 노출에 대한 6개의 인서트의 평균 값 및 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: DQ12의 세포 반응성.
DQ12는 표면 반응성을 감지하기 위해 2~7개의 디클로로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 프로브로 배양되었다. 양수 조절으로서, 카본 블랙(CB) 입자가 포함되었다. CB에 비해 DQ12는 표면 반응성이 매우 낮습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

입자 질량(μg/m3) 파티클 번호(#/cm3) 이동성 입자 크기(nm) 기하학적 표준 편차 광학 입자 크기(μm)
2969 (418) 83983 (10215) 66.6 2.5 1.1 (1.3)

표 1: DQ12 노출 특성. 값은 괄호에서 표준 편차가 있는 평균으로 표시됩니다.

Discussion

이 논문은 ALI 의 밑에 인간 기관지 상피 세포를 배양하고 에어로졸 또는 가스에 이 기관지 모형을 드러내기 위한 방법을 설명합니다. Calu-3 셀을 사용하는 장점은 단단한 접합을 형성하고, 단층으로 남아, 공기 흐름을 견딜 수 있으며, 다른 많은 세포 유형(예를 들어, 16HBE, H292 및 BEAS-2B)과 달리 ALI에서 몇 주 동안 배양될 수 있다는 것입니다. VITROCELL® 자동 노출 스테이션(AES)을 사용하면 연속기류를 이용하여 낮은 농도를 적용할 수 있기 때문에 실적이고 관련성 있는 조건하에서 세포가 노출될 수 있다는 장점이 있다.

AES와 같은 지속적인 유동 시스템은 서스펜션의 단일 분기를 사용하는 클라우드 시스템3,32를사용하는 것과 비교하여 장점이 있습니다. 연속 흐름은 더 사실적이며 유량, 습도 및 온도와 같은 많은 변수가 제어됩니다. 또한, 기착은 전기장을 사용하여 강화될 수 있다. 마지막으로, 크기, 수 농도 및 질량과 같은 에어로졸 특성을 온라인으로 모니터링합니다. 단점은 클라우드 시스템에 비해 지속적인 흐름 시스템이 더 복잡하다는 것입니다. 따라서 에어로졸의 입자 특성과 인서트상전달용량에 초점을 맞춘 예비 실험을 실행하는 것이 중요하다. 입자 및 AES 설정의 초기 시작 농도는세포(33)에서원하는 용량을 달성하기 위해 조절될 수 있다. 테스트중인 입자의 종류에 따라 에어로졸 생성 방법이 다를 수 있습니다. 정전기 증착의 사용은 입자 유형에 따라 다르며 금속 입자에 가장 적합합니다. 양수 표면 충전이 있는 입자의 경우 음극전지장을 적용해야 하며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.

노출 농도의 선택은 공기 액체 노출 실험에 어려울 수 있습니다. DQ12 노출의 경우 3주 노출 후 1 μg/cm2의 총 누적 투여량을 달성하는 것이 목표였으며, 주 5일, 하루 4시간 입니다. 이 투여량은 생체 내 효과를 유도한 투여량과유사하며, 21,25,27,32,33. 노출을 수행할 때 노출일 사이에 약간의 차이가 있었습니다. 실제 증착 용량은 1.6 μg/cm2가 목표였던 1 μg/cm2보다 높지만, 용량이 너무 낮아 Calu-3 모델의 효과를 관찰할 수 없을 수 있습니다. TEER, 생존가능성 및 사이토카인 반응의 사소한 차이만 깨끗한 공기 노출과 DQ12 노출 사이에 관찰되었으며, 이러한 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 칼루-3 세포에서 DQ12 노출이 3주 동안 유의한 효과를 유발하지 않았다는 관측에 대한 설명은 대식세포가 Calu-3 모델에서 부족했다는 점이다. 아마도, DQ12 섭취 대식세포 후 Calu-3 세포에 영향을 미칠 수 있는 염증 성 사이토카인을 생성. 또 다른 설명은 실험에 사용된 DQ12 배치가 예상대로 반응적이지 않다는 것입니다. LPS를 양성 제어 물질로 사용하는 경우, Calu-3은 LDH 방출의 증가와 TNF-α 방출의 증가로 측정된 반응을 보여줍니다. 이는 모델이 독성을 감지할 수 있음을 나타냅니다.

Calu-3 셀 모델은 결과 섹션에서 설명한 바와 같이 많은 장점이 있습니다. 더욱이, ALI에서 더 긴 시간 동안 배양될 때, Calu-3 세포는 섬모/섬모와 같은구조물(13)을 성장시키고점액(11,12,13)을생성할 수 있다. 이러한 장점에도 불구 하 고, 모델은 생리 적 관련성에 관한 제한이 있다. Calu-3 세포주 선암에서 유래, 반면 16HBE와 BEAS-2B는 건강한 조직에서 유래합니다. 불행히도, 후자의 두 가지는 시간이 지남에 따라 안정적인 단층으로 남아 있지 않기 때문에 반복된 ALI 노출에 적합하지 않습니다. Calu-3 모델의 또 다른 제한사항은 단일 셀 유형만 나타낸다는 것입니다. 인간 폐에서는 노출에 다르게 상호 작용하고 반응하는 다중 세포 모형이 존재합니다. 흡입된 입자는 공기역학적 크기에 따라 폐의 다른 영역에 보관됩니다. 이것은 입자가 Calu-3 모델에 의해 모방된 바와 같이 상피 세포 장벽에 접촉하는 곳입니다. 인간의 폐에서 폐포 대식세포는 입자에 끌리고, 삼키고, 폐에서 제거합니다. 대식세포는 또한 입자 노출에 대한 염증 반응에 필수적인 역할을 합니다. 따라서 폐 장벽을 보다 밀접하게 모방하기 위해 1차 대식세포를 추가하여 Calu-3 모델을 확장하려는 노력이 이루어지고 있다. 대식세포의 단점은 ALI에서 Calu-3 세포 위에 배양될 때 약 7일 동안만 실행 가능한 상태로 남아 있다는 것입니다. 따라서 현재 Calu-3 모델을 공동 문화 모델로 변환하려면 매주 대식대를 다시 추가해야 합니다. 동문화 프로토콜의 최적화는 현재 진행 중입니다.

상기를 감안할 때, Calu-3 기관지 모델은 담배 연기 및 LPS에서 화학 물질과 같은 부분적으로 용해성 물질의 에어로졸에 반복적으로 노출하기 위한 적합한 모델이다. 이러한 수용성 물질은 Calu-3 세포에서 사이토카인 반응에 있는 유의한 증가를 유도합니다. 디젤 배기 및 DQ12와 같은 불용성 입자를 테스트하기 위해서는 대식세포가 입자 노출에 의한 효과 유도에 중요한 역할을 하기 때문에 공동 문화 모델이 필요합니다.

설명된 노출을 위해, 3.0 μm 모공을 가진 삽입 막을 사용하였다. 이러한 유형의 인서트를 선택하는 주된 이유는 나노 물질의 전역을 테스트할 수 있기 때문입니다. 0.4 μm 모공 크기를 더 작게 사용하는 경우 입자 응집체는 삽입 막을 교차할 수 없습니다. 큰 모공 크기를 사용하는 단점은 세포가 수렴성장하는 데 시간이 길어지고 가벼운 현미경을 사용하여 세포의 형태를 시각화하기가 더 어렵다는 것입니다. 세포가 컨플루언티지 단층층을 형성하는지 확인하려면, TEER는 노출을 시작하기 전에 >1,000 Ω x cm2여야 합니다.

함께 촬영, 여기에 제시 된 Calu-3 기관지 모델은 에어로졸에 반복 노출에 사용하기에 적합, 적어도 3 주. 이 모델은 연속 기류를 통해 배양되고 노출되는 것을 견딜 수 있으며 기관지 상피에 대한 독성을 감지 할 수 있습니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작품은 EU 프로젝트 순찰대 (현실적인 나노 물질 위험 무분별증을위한 생리학적으로 고정 된 도구)와 네덜란드 보건 복지부 및 스포츠 부 (프로젝트 V / 050012)에 의해 지원됩니다. 이본 스탈 박사와 얀 반 벤심 박사에게 원고를 비판적으로 검토해 주신 것에 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M NaOH Sigma Aldrich S5881
0.1M (x10) PBS Gibco 14200-059
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) Sigma Aldrich D6883
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) Abcam ab141525
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific Inc. 15290
Automated exposure station Vitrocell
Cell proliferation reagent WST-1 Roche 11644807001
Centrifuge Eppendorf
CPC TSI inc., St Paul MN, USA 3022
Cytotoxicity detection kit LDH Roche 11644793001
DQ12 IOM nanomaterials
ELISA Ready-SET-Go Fischer Scientific 88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2 World Precision Instruments Inc., FL, USA EVOM2-STX2
FBS Greiner bio-one 758093
Flow splitter TSI inc., St Paul MN, USA model 3708
Fluorescein diacetate (F-DA) Sigma Aldrich F7378
HBSS Thermo Fisher Scientific Inc. 14175
Light microscope Olympus CKX41
Mass flow controllers MFC, Bronkhorst, the Netherlands
Methanol (analytical grade) Sigma Aldrich 34860
Microbalance Sartorius, Goettingen, Germany ME-5
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific Inc. 41090
NEAA Thermo Fisher Scientific Inc. 11140
OPS TSI inc., St Paul MN, USA 3339
Pen/Strep Thermo Fisher Scientific Inc. 15140
Phenol red free MEM Gibco 10500-064
Pure water Merck MilliQ
SMPS TSI inc., St Paul MN, USA 3936
Spray nozzle Schlick, Coburg, Germany
Teflon filters Pall R2PJ46
TEOM Rupprecht & Patashnick NY, USA series 1400
Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific Inc. 690175, 658175, 660175
Transwell inserts Corning 3460, 3462
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific Inc. 25300
Tryptan Blue Sigma Aldrich T8154

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독성 테스트를 위해 공기 중 입자에 대한 사실적이고 반복적인 흡입 노출을 위한 공기 액체 인터페이스 기관지 상피 모델
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Braakhuis, H. M., He, R., Vandebriel, R. J., Gremmer, E. R., Zwart, E., Vermeulen, J. P., Fokkens, P., Boere, J., Gosens, I., Cassee, F. R. An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (159), e61210, doi:10.3791/61210 (2020).More

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