Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Et luftvæsket grensesnitt bronkial epitelmodell for realistisk, gjentatt innåndingseksponering for luftbårne partikler for toksisitetstesting

doi: 10.3791/61210 Published: May 13, 2020

Summary

Beskrevet er cellekulturen og eksponeringsmetoden til en in vitro bronkial modell for realistisk, gjentatt innåndingseksponering for partikler for toksisitetstesting.

Abstract

For toksisitetstesting av luftbårne partikler er eksponeringssystemer for luftvæskegrensesnitt (ALI) utviklet for in vitro-tester for å etterligne realistiske eksponeringsforhold. Dette stiller spesifikke krav til cellekulturmodellene. Mange celletyper påvirkes negativt av eksponering for luft (f.eks. uttørking) og forblir bare levedyktige i noen dager. Dette begrenser eksponeringsforholdene som kan brukes i disse modellene: Vanligvis brukes relativt høye konsentrasjoner som en sky (det vil si dråper som inneholder partikler, som roer seg raskt) innen kort tid. Slike eksperimentelle forhold reflekterer ikke realistisk langsiktig eksponering for lave konsentrasjoner av partikler. For å overvinne disse begrensningene ble bruken av en menneskelig bronkial epitelcellelinje, Calu-3 undersøkt. Disse cellene kan dyrkes ved ALI-forhold i flere uker samtidig som de beholder en sunn morfologi og et stabilt monolag med trange veikryss. I tillegg er denne bronkialmodellen egnet for testing av effekten av gjentatt eksponering for lave, realistiske konsentrasjoner av luftbårne partikler ved hjelp av et ALI-eksponeringssystem. Dette systemet bruker en kontinuerlig luftstrøm i motsetning til andre ALI-eksponeringssystemer som bruker en enkelt forstøvning som produserer en sky. Det kontinuerlige strømningssystemet er derfor egnet for gjentatt og langvarig eksponering for luftbårne partikler mens det kontinuerlig overvåker partikkelegenskapene, eksponeringskonsentrasjonen og den leverte dosen. Samlet sett er denne bronkialmodellen, i kombinasjon med det kontinuerlige strømningseksponeringssystemet, i stand til å etterligne realistiske, gjentatte eksponeringsforhold som kan brukes til toksisitetstesting.

Introduction

Lungene er sårbare for innåndingseksponering for luftbårne partikler. For å vurdere den potensielle toksisiteten av luftbårne partikler, er det gjort fremskritt for å utvikle luftvæskegrensesnitt (ALI)eksponeringssystemer 1,2,3,4,5. ALI eksponeringssystemer tillater mer relevante og realistiske eksponeringsmodeller sammenlignet med tradisjonell nedsenket eksponering via kulturmedium som endrer partiklenes egenskaper og kinetikk6. ALI-eksponeringssystemene stiller spesifikke krav til cellekulturmodellene, da modellene mangler kulturmedium og dermed næringsstoffer på den a apiske siden. Mange cellemodeller påvirkes negativt av å bli dyrket og eksponert i luften (f.eks. uttørking) og forblir levedyktige i noen dager. Dette begrenser eksponeringsforholdene som kan brukes i disse modellene: Vanligvis brukes relativt høye konsentrasjoner innen kort tid som sky (det vil si dråper som inneholder partikler, som roer seg raskt). Slike eksperimentelle forhold reflekterer ikke realistisk langsiktig eksponering for lave konsentrasjoner av partikler; Dermed kan relevansen av resultatene bli avhørt. For å overvinne disse begrensningene ble kultur- og eksponeringsprotokollen for en bronkial modell bestående av den menneskelige bronkial epitelcellelinjenCalu-3 7 optimalisert.

De fleste in vitro lungemodeller som brukes til ALI-eksponering inneholder andre cellelinjer som A549, BEAS-2B og 16HBE14o- (16HBE) eller primærceller som grunnlag8. Disse cellelinjene har ulempen at de forblir levedyktige i bare noen få dager når de dyrkes på ALI. I tillegg overvekst noen av disse cellelinjene når de dyrkes i en periode lenger enn 5 dager. Til slutt, A549 celler savner funksjonelle tette veikryss og kan derfor ikke danne en stram barriere som er nødvendig for å etterligne lungene9,10. Primære epitelceller kan være et godt alternativ for ALI eksponering som de kan dyrkes på ALI i flere uker. Primærceller varierer imidlertid fra batch til batch, er vanskeligere å vedlikeholde, og er dyrere sammenlignet med cellelinjer, noe som gjør dem mindre egnet for toksisitetstesting og screening. Når du sammenligner forskjellige humane bronkiale epitelcellelinjer (16HBE, Calu-3, H292 og BEAS-2B), oppfyller bare Calu-3-cellene alle kriteriene som trengs for realistisk, gjentatt ALI-eksponering: de forblir levedyktige i flere uker mens de dyrkes på ALI, gir en høy barriereintegritet, ikke overgrow, og er enkle å kultur og vedlikeholde. Calu-3 celler stammer fra et adenokarsinom og er i stand til å produsere slim11,12. Det er uoverensstemmelser om cellene kan utvikle flimmerhår11,13. Calu-3 celler er også en egnet modell for å studere respiratoriske syncytial virus (RSV) infeksjoner som infiserer ciliated luftveis epitelceller14.

Foruten cellemodellen brukes et automatisert eksponeringssystem (AES) til luftvæskeeksponering for aerosoler15,16. AES har fordelen at den bruker en kontinuerlig luftstrøm for å utsette cellemodellen for aerosoler. Dette er i motsetning til andre luftvæskeeksponeringssystemer som vanligvis bruker relativt høye konsentrasjoner innen kort tid som sky (det vil si dråper som inneholder partikler som roer seg raskt)17,18,19. Disse skysystemene reflekterer ikke realistisk langsiktig eksponering for lave konsentrasjoner av partikler. Ved å bruke en kontinuerlig luftstrøm ved hjelp av AES, kan cellemodellen bli utsatt for en lav konsentrasjon av partikler over en lengre tidsperiode, noe som gjenspeiler realistiske eksponeringsforhold. En annen fordel over skysystemer er at AES har muligheten til å koble partikkelkarakteriseringsinstrumenter, slik at måling av partikkelstørrelse, tallkonsentrasjon og masse over tid. En begrensning av AES er at den bruker relativt høye luftstrømmer mellom 10 ml / min og 100 ml / min.

Protocol

1. Klargjøre cellekulturmedium (CCM)

  1. Forbered en flaske på 500 ml minimum viktig medium (MEM) supplert med glutamin.
  2. Tilsett 5 ml penicillin-streptomycin (det vil at 100 E/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin).
  3. Tilsett 5 ml ikke-essensielle aminosyrer (NEAA) løsning.
  4. Tilsett 10 ml amfotericin B (valgfritt).
  5. Tilsett 50 ml FBS (varmeaktivert, følg ATCC-protokollen for varmeaktivering; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guider/AnimCellCulture_Guide.ashx, side 19)).

2. Underkultur av Calu-3 celler

MERK: Calu-3 celler er dyrket i T75 eller T175 celle kultur kolbe ved 37 ° C og 5% CO2. Celler blir passasjer ved 60–80 % samløpet hver 7. CCM helles av og frisk CCM (T25 = 5 ml, T75 = 15 ml, og T175 = 25 ml) er pipetted inn i kolben og kolben er plassert tilbake i inkubatoren. Celler bør passeres minst 2x etter tining, før de brukes i eksperimenter, eller før frysing, og de bør passeres ikke mer enn 25x totalt.

  1. Bekreft om kolben er 60–80 % samløpet ved å kontrollere under et lett mikroskop.
  2. Hell av CCM fra kolben.
  3. Vask cellene 2x med 5 ml 1x Hanks' balanserte saltløsning (HBSS) uten kalsium og uten magnesium. Kast HBSS etter hver vask. HBSS fjerner serum, noe som hemmer trypsin.
  4. Tilsett 3 ml trypsin-EDTA for en T75 (4 ml for en T175) og plasser kolben tilbake i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i 10–15 min. Kontroller etter 10 min, slik at cellene har blitt løsrevet fra kolbeoverflaten. I tilfelle cellene dyrkes til > 80% samløpet, vil de ikke løsne ved hjelp av trypsin 0,05% og trypsin 0,25% kan brukes.
  5. Tilsett 6 ml (det vil si doble trypsin-EDTA-volumet som opprinnelig ble lagt til) av CCM i kolben og gynge forsiktig kollene for å sikre riktig blanding. Dette er for å sikre at trypsin har blitt nøytralisert av FBS i CCM og dens aktivitet på cellene stoppet. Hvis trypsin får lov til å forbli i kontakt med cellene for lenge, vil de ikke feste når de settes inn i en ny cellekulturkolbe.
  6. Hell hele innholdet i kolben i et 50 ml sentrifugerør.
  7. Sentrifuge cellene i 5 min ved 130 x g, slik at sentrifugen er riktig balansert.
  8. Returner hetteglasset som inneholder cellene tilbake til aseptiske forhold og fjern supernatanten forsiktig, uten å forstyrre pelleten. Det overnaturlige kan helles av og resten pipettert av, slik at pelleten ikke forstyrres.
  9. Resuspend cellepellet i 1 ml CCM ved å pipettere opp og ned til alle celler er suspendert (det vil vil at ingen pellet eller celle agglomerater observeres). Ytterligere CCM kan legges til for å fortynne cellefjæringen.
  10. Tell cellene, både døde og levende, i 1 ml CCM ved hjelp av et hemocytometer. Om nødvendig for riktig telling, fortynne cellene i 3 eller 4 ml.
  11. Suspender cellene i CCM-volumet som kreves, og legg til cellesuspensjonen i hver kolbe. For å oppnå ca 80% samløpet i en uke, frø 2 x 106 celler i en T75 eller 6 x 106 celler i en T175.
  12. Klipp forsiktig kolben forsiktig og plasser den deretter tilbake i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
  13. Erstatt med fersk CCM hver 2-3 dager og subkultur når cellene når 60-80% samløpet.

3. Seeding Calu-3 celler på kulturinnlegg

MERK: Innsatser er tilgjengelige med forskjellige porestørrelser. Små porestørrelser (f.eks. 0,4 μm) har en fordel at cellene vokser lettere og kan oppnå en god barriere allerede etter 5 dager som dyrkes under nedsenkede forhold, målt ved Trans Epithelial Electrical Resistance (TEER). Men når de er interessert i partikkeltranslokasjon, er disse porene for små og vil fange partiklene. Derfor velges større porestørrelser (f.eks. 3 μm) vanligvis for å teste partikler. Når cellene bruker en større porestørrelse, trenger cellene lengre tidsperioder (f.eks. 7–10 dager under undersenkbare forhold) for å oppnå en god TEER.

  1. Forbered cellesuspensjon med kjent konsentrasjon etter trinn 2.1–2.10.
  2. Fortynn celler til en konsentrasjon på 5 x 105 celler / ml i forhåndswarmed CCM for 6 brønninnlegg eller 2,5 x 105 celler / ml for 12 brønninnlegg.
  3. Ta en cellekulturplate med innsatser og plasser under aseptiske forhold.
  4. Fyll basolateral side med 2 ml forhåndswarmed CCM for 6 brønninnsatser, eller 1 ml for 12 brønninnsatser. Mens du legger til kulturmediet, ta innsatsen ut ved hjelp av pinsett.
  5. Bland cellefjæringen forsiktig ved å pipetter opp og ned. Pipette 1,0 ml for 6 brønninnsatser og 500 μL for 12 brønninnsatser (tilsvarende 100 000 celler/cm2) på toppen av membranen i cellekulturinnsatsen med 0,4 μm porer. For 3,0 μm porer øker du celletettheten til 128 000 celle/cm2.
  6. Dekk cellekulturplaten og inkuber ved 37 °C og 5 % CO2.
  7. Endre CCM hver 2–3.
  8. La cellene bli samløpet i 7 dager under nedsenket forhold før de fortsetter å kultur på ALI.
  9. Mål TEER.
    1. Ta en epitel voltohmmeter supplert med spisepinne elektrode sett og lade batterisystemet over natten.
    2. Koble Voltohmmeteren fra laderen og koble spisepinneelektroden.
    3. Rengjør elektroden med 70 % etanol.
    4. Plasser elektroden i CCM ved å sette den lengre elektroden i det ytre kulturmediet til den berører bunnen av parabolen og legger den kortere elektroden i media uten å berøre membranen.
    5. Start med en tom innsats uten celler. Vent til målingen stabiliserer seg og skriv ned motstanden i Ohms. Denne målingen er motstanden til innsatsmembranen uten celler (det vil vil at tom motstand).
    6. Gjenta målingen for hver innsats og trekk fra den tomme motstanden for å oppnå den sanne motstanden.
    7. For dataanalyse multipliserer du motstandsverdiene med overflaten av innsatsen i Ω x cm2. For en 6 brønninnsats er overflatearealet 4,67 cm2. Dermed, hvis en motstand på 600 Ohm måles og bakgrunnen er 120 Ohm, er motstanden 480 Ohm, som deretter multipliseres med overflatearealet på 4,67 cm2 for totalt 2241,6 Ohm x cm2. TEER skal være > 1000 Ω x cm2 for å fortsette.
  10. Fjern CCM fra den agiske siden av innsatsene.
  11. Legg til 2 ml forhåndswarmed CCM for 6 godt og 1 ml for 12 brønninnlegg til basolateral side av brønnen (det vil si under cellekulturinnsatsen). CCM skal berøre membranen fra bunnen, men ikke lekke på toppen av innsatsen.
  12. På dette punktet celler er apically utsatt for luft, som er referert til som kultivering på ALI.
  13. Kulturceller ved ALI i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2 i 7 dager før eksponering.
  14. Endre den basolaterale CCM hver 2-3 dager. Cellene kan brukes på ALI i 6 uker.

4. Klargjøre eksponeringsoppsettet

MERK: Avsnitt 5–7 beskriver preparater for partikkeleksponering ved hjelp av en automatisert eksponeringsstasjon (AES, se Materialtabell). Oppsettet for partikkeltåkering og karakterisering er også kompatibelt med andre ALI-eksponeringssystemer fra andre produsenter. Som et eksempel er eksponeringen for partikler beskrevet nedenfor. Slike systemer kan også brukes til andre eksponeringer, for eksempel sensibilisatorer, sigarettrøyk og dieseleksos. Figur 1 viser AES og en eksponeringsmodul. Figur 2 viser en skjematisk representasjon av eksponeringsoppsettet, inkludert alle andre instrumenter.

  1. Før du starter en eksponering ved hjelp av AES, koble systemet til flere instrumenter for å måle aerosolegenskaper; disse måles i en sidestrøm like før aerosolene kommer inn i skapet.
    MERK: En strømningssplitter brukes til å koble sidestrømmen til eksponeringstegneutstyret. Vanligvis brukes følgende utstyr: skanning av mobilitetspartikkelstørrelse (SMPS), optisk partikkelstørrelse (OPS), kondenspartikkelteller (CPC), konisk element oscillerende mikrobalanse (TEOM). SMPS- og OPS-målingene utføres 1x per time og bruker samme slange fra strømningssplitteren. CPC og TEOM utfører kontinuerlig måling og data fra begge er logget på en Ekorn modell 2020 datalogger. I tillegg bestemmes gravitasjonsmetrisk massekonsentrasjon ved hjelp av en mikrobalanse i kontrollert relativ fuktighet (40–70 %) og temperatur (21–23 °C) forhold. Teflonfiltre veies før og etter hver eksponering for å bekrefte eksponeringskonsentrasjonen. For å fange eksosen brukes et HEPA-filter. Oppsettet, inkludert konstruerte nanomateriale (ENM) suspensjoner og forstøver, er alle plassert i et strømningskabinett for å forhindre eksponering for mennesker. AES kan brukes til å teste mange forskjellige typer ENMs, inkludert metaller og metalloksider.
  2. Forbered en nanomateriale suspensjon kort tid før eksponering. Vanligvis er en 1% suspensjon utarbeidet som en lagerløsning. For eksempel, suspendere 100 mg nanomateriale i 10 ml rent vann.
    MERK: For DQ12-eksponering brukes 300 mg til å oppnå ca. 2 μg/cm2. Dette beløpet kan brukes i én enkelt eksponering eller dividere over gjentatte eksponeringer (f.eks. 300 mg er suspendert i 30 ml for én enkelt eksponering eller 21,5 mg er suspendert i 2,15 ml ferskt hver dag i 3 uker med gjentatt eksponering). Suspensjonen er nyoppgjort hver eksponeringsdag. Partikkelfjæringen sonikeres i 16 min ved hjelp av sondesonikering. Volumet på 1% lagerløsningen justeres til et totalt volum på 100 ml ved å tilsette rent vann.
  3. Sett ENM-suspensjonen i en liten flaske med hette og magnetisk rører for å forhindre at partiklene blir settling. Koble flasken til en peristaltisk pumpe via et lite rør og juster strømmen til 25 ml/t.
  4. Koble den peristaltiske pumpen til en sprøytedyse og juster innstillingene for å tillate kontinuerlig aerosolisering.
  5. Sprøytedysen er montert på et 60 cm langt aluminiumsrør (blandekammer, diameter 15 cm, oppvarmet til 60 °C). Oppsettet er koblet til AES via et 1,5 meter langt kobberrør (diameter 15 cm). På toppen av AES fjerner en impactor alle aerosoler som er større enn 2,5 μm.
  6. Koble spraydysen til 3 bar trykkluft gjennom to massestrømningskontrollere (MFC) for å tillate tåkering av suspensjoner. En strøm på 14 l/min brukes til sprøytedysen, den andre MFC for blanding av luften i røret.
  7. Dagen før eksponeringsstart, slå på AES slik at kabinettet kan nå en temperatur på 37 °C.
  8. Slå på luftstrømmen og fuktigheten i skapet 2 timer før eksponeringsstart, for å nå 85% fuktighet. Slå på oppvarmingen av eksponeringskamrene der innsatsene med cellene vil bli plassert.
  9. Slå på kvartsmikrobalansen (QCM) og sett startverdien til 0 ved hjelp av programvaren. Begynn å logge. Hver 10 s massen måles og uttrykkes som ng / cm2.
  10. Varm cellekulturmediene til 37 °C i et vannbad (~20–30 min).

5. Klargjøre Calu-3-celler for eksponering

MERK: For en typisk ALI-eksponering ved hjelp av AES er det nødvendig med 15–20 innsatser med et sammenføyd cellelag. Disse består av 3 renluftskontroller, 3 inkubatorkontroller som vil bli håndtert på samme måte som de andre innsatsene uten eksponering i AES, 6–8 innsatser for aerosoleksponering (avhengig av bruk av 0, 1 eller 2 mikrovekter), 1–3 innsatser for kontrollmålinger (for eksempel maksimal LDH-utgivelse) og 3 reserveinnsatser i tilfelle TEER for noen av innsatsene ikke er tilstrekkelige. Cellene skal ha en TEER på > 1000 Ω x cm2 for å fortsette.

  1. På den første eksponeringsdagen vasker du celler 1x med CCM, sjekker cellemorfologi og måler TEER for cellemodellen ved hjelp av en Voltohmmeter. Cellene skal danne et stramt monolag uten hull.
  2. Sett 2 ml/1 ml HEPES bufret CCM uten FCS til basolateral side av 6 godt/ 12 brønnplater og overføre kulturinnsatsene med celler til de nye platene.
    MERK: Det er ikke til stede co2 i AES under eksponering. Hepes bufret kulturmedium (25 mM HEPES) brukes derfor under transport og eksponering. Dette mediet brukes til både de eksponerte cellene i AES samt inkubatorkontrollcellene.
  3. I tilfelle tiden for å transportere cellekulturene til AES er mer enn 5 min, legg cellene i en bærbar inkubator på 37 ° C under transport.

6. Håndtering av AES under en eksponering

  1. Ved AES fyller du eksponeringsmodulene med HEPES-bufret CCM uten føtalkallvserum (FCS). Mengden CCM avhenger av enheten som brukes, og typen cellekulturinnsats. Husk at for å holde celler på ALI, bør mediet nå bunnen av membranen, men bør ikke lekke på toppen av membranen. Når du bruker 6 brønninnsatser, legger du til 6 ml HEPES-bufret CCM i eksponeringsmodulene.
  2. Overfør innsatsene med celler fra platene til eksponeringsmodulene ved hjelp av sterile pinsett. Kontroller at det ikke er luftbobler på basolateral side av cellene og fjern noen CCM på den aktuelle siden av innsatsene. Hvis det er noen luftbobler på basolateral side, vri forsiktig innsatsene ved hjelp av de sterile pinsettene til de er fjernet. Oppbevar platene som inneholder CCM i en inkubator for overføring etter en eksponering.
  3. Bruk berøringsskjermen til å velge eksponeringsvarighet, luftstrømningshastighet og elektrostatisk deponeringsforbedring. Displayet kan også brukes til å kontrollere fuktighet og temperatur. Vanligvis velges en eksponeringsvarighet på 4 timer, med en strømningshastighet på 50 ml / min på innsatsene ved 37 ° C og 85% fuktighet.
    MERK: Modulene i første nivå (figur 1) brukes til eksponering for ren luft; innsatser på dette nivået brukes som ren lufteksponeringskontroller. De andre modulene i andre og tredje nivå kan brukes til aerosoleksponering, inkludert to moduler for kvartskrystallmikrovekter (QCM) for å måle avsetning på nettet.
  4. Lekkasjetesten skal utføres før eksponeringen startes. Lekkasjen må være mindre enn 5 ml/min. Følg instruksjonene på AES-skjermen. Når lekkasjetesten er ferdig, kan eksponeringen startes. Ved lekkasje bør slangen kontrolleres.
  5. På slutten av eksponeringen åpner du døren til en AES-modul, åpner eksponeringsmodulene, plasserer cellekulturen som settes tilbake til cellekulturplatene, og overfører platene til den bærbare inkubatoren.
  6. Samle mediet fra modulene (f.eks. eksponerte prøver) og fra platene (f.eks. inkubatorkontroller) for senere analyse, for eksempel måling av laktatdehydrogenase (LDH).
  7. Tilbake på cellekulturlaboratoriet, overfør cellekulturinnsatsene til plater fylt med fersk standard CCM. Sett cellekulturplatene i inkubatoren til neste eksponering eller til analyse.
  8. Etter den siste eksponeringsdagen, legg innsatsene i inkubatoren til neste dag.
  9. Dagen etter den endelige eksponeringen legger du til CCM på den a apiske siden for å måle TEER ved hjelp av en Voltohmmeter. Samle både apical og basolateral CCM separat for analyse av cytokiner.
  10. Fjern alle CCM og utfør en celle levedyktighet analyse ved å legge til, for eksempel, en spredning reagens til den a apical side.

7. Rengjøring av AES

  1. Fyll eksponeringsmodulene med vann, vent i 1 min, og fjern vannet. Deretter fyller du modulene med 70% etanol, la det stå i 10 min, og fjern etanol. Rengjør eksponerings trompetene også med 70% etanol.
  2. Stopp 85% fuktighetskontroll, men la temperaturen på kabinettet ved 37 °C for neste eksperiment.

Representative Results

Denne artikkelen gir en metode for å kultere og utsette menneskelige bronkial epitelceller ved ALI som etterligner realistiske, gjentatte innåndingseksponeringsforhold som kan brukes til toksisitetstesting. Egenskapene til både cellemodellen og eksponeringssystemet er avgjørende for å oppnå en realistisk innåndingseksponeringsmodell som kan brukes til gjentatte eksponeringer. Resultatene på disse egenskapene er vist nedenfor.

Krav til cellemodell og valg

Når du velger en passende cellemodell, må følgende egenskaper tas i betraktning:

  1. Cellemodellen skal kunne danne et sammenføyd monolag med fungerende tette veikryss for å etterligne lungebarrieren.
  2. Cellemodellen skal vise optimal ytelse når den utsettes gjentatte ganger for betinget (temperatur og fuktighet) luft.
  3. Cellemodellen skal reagere på en eksponering.

Denne studien startet med fire forskjellige humane bronkial epitelcellelinjer: 16HBE, Calu-3, H292 og BEAS-2B. Disse er alle mye brukt for toksisitet testing av nanomaterialer og kjemikalier. Av de fire cellelinjene oppfylte bare Calu-3-cellene alle de ovennevnte kravene. Cellene dannet et monolag med tette veikryss (figur 3) som forble en stabil barriere over tid målt ved TEER, mens de andre cellelinjene enten ikke dannet en barriere eller viste en nedgang i barrierefunksjonen når de ble dyrket ved ALI (figur 4). I tillegg hadde H292 og BEAS-2B en tendens til å overvekst i flere cellelag når de ble dyrket i en lengre tidsperiode. Tradisjonell nedsenket celle culturing og ALI kultivering skilte seg sterkt, fordi på ALI næringsstoffer var bare tilgjengelig fra basolateral side og cellene ble utsatt for tørre forhold på den aktuelle siden. Disse forholdene kan forårsake stress til cellemodellene, som kan observeres ved å måle celle levedyktigheten over tid. Cellelinjer 16HBE, H292 og BEAS-2B viste alle en økt LDH-utgivelse når de ble dyrket ved ALI, mens Calu-3-cellene bare viste en liten LDH-utgivelse (figur 5).

Deretter ble responsen fra Calu-3-modellen til stoffer testet. Som et positivt kontrollstoff ble LPS administrert via nebulisering til den a apiske siden av modellen. Den avsede dosen var 0,25 μg/cm2. Calu-3-cellene viste en reaksjon på lipopolysakkarid (LPS) med en økning i LDH-frigjøring og i tumornekrosefaktor alfa (TNF-α) utgivelse (figur 6).

Til slutt ble Calu-3 monolayer utsatt for kvartssilikatika (DQ12) nanomaterialer (IOM, Edinburgh). Krystallinsk silika kan indusere silikose og kan også forårsake lungesvulster. Derfor har International Agency for Research on Cancer (IARC) klassifisert krystallinsk silika som en gruppe I humant kreftfremkallende20. Virkningsmekanismen av krystallinsk silika antas å være via induksjon av vedvarende betennelse forårsaket av reaktiv overflate21,22,23. Flere in vivo-studier hos både rotter og mus rapporterer induksjon av betennelse og histopatologiendringer, inkludert svulster og fibrose, etter innåndingseksponering for krystallinsk silika24,25,26,27,28,29. Disse effektene observeres alle etter gjentatt eksponering og/eller langsiktig oppfølging. Calu-3-modellen ble brukt til å undersøke om observasjonene fra in vivo-studiene kunne etterlignes ved hjelp av en in vitro-modell som kunne eksponeres gjentatte ganger ved ALI.

Calu-3-celler ble eksponert i 3 sammenhengende uker, 5 dager per uke, 4 timer per dag til DQ12. Den avsponerte dosen ble målt ved hjelp av en QCM. Gjennomsnittlig avsponert dose var 120 ng/cm2 per dag, med en kumulativ dose på 1,6 μg/cm2, tilsvarende dosene som induserer en effekt in vivo. Andre partikkelegenskaper er vist i tabell 1. Etter 3 ukers eksponering induserte DQ12 ingen signifikante effekter i TEER, cellelevabilitet og monocyttkjemoattractantprotein 1 (MCP-1), sammenlignet med ren luftkontroll (figur 7). Etter hvert som det var forventet mer toksisitet av DQ12 basert på in vivo-dataene, ble partiklenes reaktivitet kontrollert ved hjelp av en acellulær analyse i henhold til protokollen som er optimalisert i EU-prosjektet GRACIOUS (leverbar 5.3). Reaktiviteten til DQ12-batchen var lavere enn forventet (figur 8), størrelsesordener lavere sammenlignet med de positive kontrollpartiklene carbon black (CB). Denne mangelen på reaktivitet kan forklare fraværet av toksisitetsrespons i Calu-3-modellen.

Figure 1
Figur 1: Den automatiserte eksponeringsstasjonen (AES).
Den venstre figuren viser utsiden av kabinettet med berøringspanelet. AES har tre nivåer med eksponeringsmoduler: det øverste nivået for eksponeringer i ren luft, og mellom- og bunnnivået for aerosoleksponeringer. Den høyre figuren viser eksponeringsmodulen der innsatser med celler er plassert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk representasjon av eksponeringsoppsettet.
Fra venstre til høyre: 1) ENM suspensjon koblet til spraydysen via en peristaltisk pumpe; 2) Ved hjelp av trykkluft blir sprøytedysen nebulizes ENM-suspensjonen og via et blandekammer blir aerosolene ført til AES; 3) Like før du går inn i AES, er aerosolkarakteriseringsinstrumenter koblet til: SMPS, OPS, CPC og TEOM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Representativt bilde av Calu-3-celler etter å ha kultivert på luftvæskegrensesnittet (ALI) i 10 dager.
Fluorescens mikroskopi bilde av Calu-3 celler etter kultivering på ALI i 10 dager. Tett kobling protein ZO-1 er farget i grønt, kjerner av cellene er farget i blått. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Transepithelial elektrisk motstand (TEER) av fire forskjellige cellelinjer i en kulturperiode på 21 dager.
TEER-verdier på 16HBE, Calu-3, H292 og BEAS-2B når de dyrkes i 21 dager: første 7 dager nedsenket, etterfulgt av 14 dager på ALI. TEER-verdier ble korrigert for bakgrunnsmotstanden til innsatsen og multiplisert med overflaten av innsatsen. Symbolene og feilfeltene representerer gjennomsnittsverdien og standardavviket på seks innsatser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: LDH-frigjøring av fire forskjellige cellelinjer i en kulturperiode på 21 dager.
LDH-utgivelsen av 16HBE, Calu-3, H292 og BEAS-2B når de dyrkes i 21 dager: 7 dager nedsenket, etterfulgt av 14 dager på ALI. LDH-verdier som vises, er i forhold til maksimal LDH-utgivelse per celletype. Symbolene og feilfeltene representerer gjennomsnittsverdien og standardavviket for fem innsatser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Cellulære effekter i Calu-3-celler eksponert for LPS.
Calu-3-celler ble eksponert via skytåkering til 0,25 μg/cm2 LPS. (A)WST-1 konvertering. (B) LDH-utgivelse. (C) TNF-α etter LPS-eksponering. Symbolene og feilfeltene representerer gjennomsnittsverdier og standardavvik for tre innsatser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Cellulære effekter i Calu-3-celler eksponert for DQ12 nanomaterialer.
Calu-3-celler ble eksponert i 3 uker (4 timer per dag, 5 dager per uke) til DQ12 nanomaterialer, ca. 120 ng/cm2 per dag, kumulativ dose på 1,6 μg/cm2. (A) TEER-verdier. (B) LDH-utgivelse. (C) MCP-1-utgivelse etter DQ12-eksponering. Alle symboler og feilfelt representerer gjennomsnittsverdier og standardavvik for tre innsatser for kontrollene og seks innsatser for DQ12-eksponeringen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Acellulær reaktivitet av DQ12.
DQ12 ble inkubert med en 2,7ɪ-Dichlorofluorescein Diacetate (DCFH-DA) sonde for å oppdage overflatereaktiviteten. Som en positiv kontroll ble karbonsvart (CB) partikler inkludert. Sammenlignet med CB har DQ12 svært lav overflatereaktivitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Partikkelmasse (μg/m3) Partikkelnummer (#/cm3) Mobilitet partikkelstørrelse (nm) Geometrisk standardavvik Optisk partikkelstørrelse (μm)
2969 (418) 83983 (10215) 66.6 2.5 1.1 (1.3)

Tabell 1: DQ12 eksponeringsegenskaper. Verdier vises som gjennomsnitt med standardavvik i parentes.

Discussion

Dette papiret beskriver en metode for å kultere menneskelige bronkial epitelceller under ALI og utsette denne bronkialmodellen for aerosoler eller gasser. Fordelen med å bruke Calu-3-celler er at de danner tette veikryss, forblir en monolayer, er i stand til å tåle luftstrømmen, og kan dyrkes i flere uker på ALI, i motsetning til mange andre celletyper (f.eks. 16HBE, H292 og BEAS-2B). Bruk av VITROCELL® automatisert eksponeringsstasjon (AES) har fordelen at cellene kan eksponeres under realistiske og relevante forhold, da lave konsentrasjoner kan brukes ved hjelp av en kontinuerlig luftstrøm.

Fortsatt strømningssystemer, som AES, har fordeler sammenlignet med å bruke skysystemer3,32, som bruker en enkelt forstøvning av en suspensjon. Den kontinuerlige strømmen er mer realistisk og mange variabler som strømningshastighet, fuktighet og temperatur styres. I tillegg kan avsetning forbedres ved hjelp av et elektrisk felt. Til slutt overvåkes aerosolegenskaper som størrelse, tallkonsentrasjon og masse på nettet. En ulempe er at fortsatt strømningssystemer er mer komplekse sammenlignet med skysystemer. Derfor er det viktig å kjøre forberedende eksperimenter som fokuserer på aerosolens partikkelegenskaper og den leverte dosen på innsatsen. Den første startkonsentrasjonen av partiklene og AES-innstillingene kan deretter justeres for å oppnå ønsket dose på cellene33. Avhengig av hvilken type partikler som testes, kan aerosolgenereringsmetoden variere. Bruk av elektrostatisk deponering avhenger av partikkeltypen og fungerer best for metalliske partikler. For partikler med positiv overflateladning bør et negativt elektrostatisk felt påføres og omvendt.

Valg av eksponeringskonsentrasjoner kan være vanskelig for ethvert luftvæskeeksponeringseksperiment. For DQ12-eksponeringene var målet å oppnå en total kumulativ dose på 1 μg/cm2 etter 3 ukers eksponering, 5 dager per uke, 4 timer per dag. Denne dosen ligner doser som induserte en effekt in vivo21,25,27,32,33. Når du utfører eksponeringene, var det en viss variasjon mellom ulike eksponeringsdager. Selv om den faktiske avsekomstdosen på 1,6 μg/cm2 er høyere enn 1 μg/cm2 som var rettet mot, kan dosen ha vært for lav til å observere effekter i Calu-3-modellen. Bare mindre forskjeller i TEER, levedyktighet og cytokinrespons ble observert mellom eksponeringen for ren luft og DQ12-eksponeringen, og disse forskjellene var ikke statistisk signifikante. En forklaring på observasjonen om at DQ12 eksponering i 3 uker ikke induserer signifikante effekter i Calu-3-cellene er at makrofager manglet fra Calu-3-modellen. Muligens, etter DQ12 opptak makrofager produsere proinflammatoriske cytokiner som kan påvirke Calu-3 celler. En annen forklaring er at DQ12-batchen som ble brukt for eksperimentene ikke var så reaktiv som forventet. Når du bruker LPS som et positivt kontrollstoff, viser Calu-3 en respons, målt ved en økning i LDH-frigjøring og en økning i TNF-α frigjøring. Dette indikerer at modellen kan oppdage toksisitet.

Calu-3 cellemodellen har mange fordeler, som omtalt i resultatdelen. Videre, når dyrket i lengre tid på ALI, kan Calu-3-cellene vokse flimmerhåre / cilia-lignendestrukturer 13 og produsere slim11,12,13. Til tross for disse fordelene har modellen begrensninger med hensyn til sin fysiologiske relevans. Calu-3 cellelinjene stammer fra et adenokarsinom, mens 16HBE og BEAS-2B stammer fra sunt vev. Dessverre er de to sistnevnte ikke egnet for gjentatt ALI-eksponering, da de ikke forblir et stabilt monolag over tid. En annen begrensning av Calu-3-modellen er at den bare representerer en enkelt celletype. I den menneskelige lunge er flere celletyper som samhandler og reagerer annerledes på eksponering, tilstede. Inhalerte partikler vil deponere i forskjellige områder av lungene avhengig av deres aerodynamiske størrelse. Det er her partiklene kontakter epitelcellebarrieren, som etterlignet av Calu-3-modellen. I den menneskelige lunge er alveolære makrofager tiltrukket av partiklene, sluke dem og fjerne dem fra lungene. Makrofager spiller også en viktig rolle i betennelsesresponsen mot partikkeleksponering. Derfor arbeides det med å utvide Calu-3-modellen ved å legge til primære makrofager for å etterligne lungebarrieren nærmere. Ulempen med makrofagene er at de forblir levedyktige bare i ca 7 dager når de dyrkes på toppen av Calu-3-celler ved ALI. Makrofager bør derfor leses ukentlig for å transformere den nåværende Calu-3-modellen til en kokulturmodell. Optimaliseringen av kokulturprotokollen pågår for tiden.

Gitt ovennevnte er Calu-3 bronkialmodellen en egnet modell for gjentatt eksponering for aerosoler av delvis løselige stoffer som kjemikalier fra sigarettrøyk og LPS. Disse løselige stoffene induserer signifikante økninger i cytokinresponser i Calu-3-cellene. For å teste uoppløselige partikler som dieseleksos og DQ12, er det nødvendig med en kokulturmodell, fordi makrofagene spiller en avgjørende rolle i induksjon av effekter ved partikkeleksponering.

For de beskrevne eksponeringene ble det brukt inn membraner med 3,0 μm porer. Hovedårsaken til å velge denne typen innsats er at det er mulig å teste translokasjonen av nanomaterialer. Ved bruk av mindre 0,4 μm porestørrelse, vil partikkel agglomerater ikke kunne krysse innsatsmembranen. Ulempen med å bruke en stor porestørrelse er at cellene trenger lengre tid til å vokse samløpet og at det er vanskeligere å visualisere cellenes morfologi ved hjelp av lett mikroskopi. Hvis du vil kontrollere at cellene danner et sammenføyd monolag, bør TEER være > 1000 Ω x cm2 før du starter en eksponering.

Samlet sett er Calu-3 bronkialmodellen som presenteres her, egnet til bruk for gjentatt eksponering for aerosoler, minst opptil 3 uker. Modellen tåler å bli dyrket og utsatt via en kontinuerlig luftstrøm og er i stand til å oppdage toksisitet for bronkial epitelet.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet er finansiert av EU-prosjektet PATROLS (Fysiologisk forankrede verktøy for realistisk nanomateriale fare aSessment) og det nederlandske Helse-, velferds- og sportsdepartementet (prosjekt V/050012). Vi vil takke Dr. Yvonne Staal og Dr. Jan van Benthem for kritisk gjennomgang av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M NaOH Sigma Aldrich S5881
0.1M (x10) PBS Gibco 14200-059
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) Sigma Aldrich D6883
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) Abcam ab141525
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific Inc. 15290
Automated exposure station Vitrocell
Cell proliferation reagent WST-1 Roche 11644807001
Centrifuge Eppendorf
CPC TSI inc., St Paul MN, USA 3022
Cytotoxicity detection kit LDH Roche 11644793001
DQ12 IOM nanomaterials
ELISA Ready-SET-Go Fischer Scientific 88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2 World Precision Instruments Inc., FL, USA EVOM2-STX2
FBS Greiner bio-one 758093
Flow splitter TSI inc., St Paul MN, USA model 3708
Fluorescein diacetate (F-DA) Sigma Aldrich F7378
HBSS Thermo Fisher Scientific Inc. 14175
Light microscope Olympus CKX41
Mass flow controllers MFC, Bronkhorst, the Netherlands
Methanol (analytical grade) Sigma Aldrich 34860
Microbalance Sartorius, Goettingen, Germany ME-5
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific Inc. 41090
NEAA Thermo Fisher Scientific Inc. 11140
OPS TSI inc., St Paul MN, USA 3339
Pen/Strep Thermo Fisher Scientific Inc. 15140
Phenol red free MEM Gibco 10500-064
Pure water Merck MilliQ
SMPS TSI inc., St Paul MN, USA 3936
Spray nozzle Schlick, Coburg, Germany
Teflon filters Pall R2PJ46
TEOM Rupprecht & Patashnick NY, USA series 1400
Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific Inc. 690175, 658175, 660175
Transwell inserts Corning 3460, 3462
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific Inc. 25300
Tryptan Blue Sigma Aldrich T8154

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology. Nanomaterials (Basel). 7, (2), 49 (2017).
  2. Herzog, F., et al. Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches. The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).
  3. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  4. Paur, H. R., et al. In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology. Journal of Aerosol Science. 42, (10), 668-692 (2011).
  5. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations. Applied in vitro Toxicology. 4, (2), 91-106 (2018).
  6. Loret, T., et al. Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Particle and Fibre Toxicology. 13, (1), 58 (2016).
  7. Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).
  8. Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives in Toxicology. 89, (9), 1469-1495 (2015).
  9. Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport. PLoS One. 11, (10), 0165225 (2016).
  10. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, (2), 107-126 (2015).
  11. Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies. International Archives of Allergy and Immunology. 170, (1), 1-21 (2016).
  12. Jeong, M. H., et al. In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576 (2019).
  13. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmacology Research. 23, (7), 1482-1490 (2006).
  14. Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of Virological Methods. 174, (1-2), 144-149 (2011).
  15. Vitrocell. Vitrocell® Automated Exposure Station. Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1 (2019).
  16. Mülhopt, S., et al. Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system. Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).
  17. Vitrocell. VITROCELL® Cloud for the exposure to liquid aerosols. Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system (2019).
  18. Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11, (1), 40 (2014).
  19. Lenz, A. G., et al. Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, (4), 526-535 (2014).
  20. Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism. Critical Reviews in Toxicology. 41, (9), 756-770 (2011).
  21. Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica. Particle and Fibre Toxicology. 15, (1), 23 (2018).
  22. Kawasaki, H. A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity. Inhalation Toxicology. 27, (8), 363-377 (2015).
  23. Sayes, C. M., et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles. Inhalation Toxicology. 22, (4), 348-354 (2010).
  24. Driscoll, K. E., et al. Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide. Toxicology and Applied Pharmacology. 111, (2), 201-210 (1991).
  25. Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica. Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, Suppl 2 27-29 (1995).
  26. Peeters, P. M., et al. Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs. Particle and Fibre Toxicology. 11, 58 (2014).
  27. Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats. Food and Chemical Toxicology. 29, (5), 341-354 (1991).
  28. Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months. Food and Chemical Toxicology. 45, (10), 1856-1867 (2007).
  29. Cho, W. S., et al. Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles. Toxicology Letters. 175, (1-3), 24-33 (2007).
  30. Herzog, F., et al. Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 10, (1), 11 (2013).
  31. Mülhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement. Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).
  32. van Ravenzwaay, B., et al. Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz. Toxicology Letters. 186, (2), 152-159 (2009).
  33. Henderson, R. F., et al. A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats. Fundamental and Applied Toxicology. 24, (2), 183-197 (1995).
Et luftvæsket grensesnitt bronkial epitelmodell for realistisk, gjentatt innåndingseksponering for luftbårne partikler for toksisitetstesting
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braakhuis, H. M., He, R., Vandebriel, R. J., Gremmer, E. R., Zwart, E., Vermeulen, J. P., Fokkens, P., Boere, J., Gosens, I., Cassee, F. R. An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (159), e61210, doi:10.3791/61210 (2020).More

Braakhuis, H. M., He, R., Vandebriel, R. J., Gremmer, E. R., Zwart, E., Vermeulen, J. P., Fokkens, P., Boere, J., Gosens, I., Cassee, F. R. An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (159), e61210, doi:10.3791/61210 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter