Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Un modelo epitelial bronquial de interfaz aire-líquido para la exposición realista y repetida por inhalación a partículas en el aire para pruebas de toxicidad

doi: 10.3791/61210 Published: May 13, 2020

Summary

Descrito es el método de cultivo celular y exposición de un modelo bronquial in vitro para la exposición realista y repetida a partículas para pruebas de toxicidad.

Abstract

Para pruebas de toxicidad de partículas en el aire, se han desarrollado sistemas de exposición a la interfaz aire-líquido (ALI) para pruebas in vitro con el fin de imitar condiciones de exposición realistas. Esto impone demandas específicas a los modelos de cultivo celular. Muchos tipos de células se ven afectados negativamente por la exposición al aire (por ejemplo, secado) y sólo permanecen viables durante unos días. Esto limita las condiciones de exposición que se pueden utilizar en estos modelos: por lo general, las concentraciones relativamente altas se aplican como una nube (es decir, gotas que contienen partículas, que se asientan rápidamente) en un corto período de tiempo. Estas condiciones experimentales no reflejan una exposición realista a largo plazo a bajas concentraciones de partículas. Para superar estas limitaciones se investigó el uso de una línea celular epitelial bronquial humana, Calu-3. Estas células se pueden cultivar en condiciones ali durante varias semanas mientras se conserva una morfología saludable y una monocapa estable con uniones estrechas. Además, este modelo bronquial es adecuado para probar los efectos de las exposiciones repetidas a concentraciones bajas y realistas de partículas en el aire utilizando un sistema de exposición ALI. Este sistema utiliza un flujo de aire continuo en contraste con otros sistemas de exposición a ALI que utilizan una sola nebulización que produce una nube. Por lo tanto, el sistema de flujo continuo es adecuado para la exposición repetida y prolongada a partículas en el aire mientras monitorea continuamente las características de las partículas, la concentración de exposición y la dosis administrada. En conjunto, este modelo bronquial, en combinación con el sistema de exposición continua al flujo, es capaz de imitar condiciones realistas y repetidas de exposición a la inhalación que se pueden utilizar para pruebas de toxicidad.

Introduction

Los pulmones son vulnerables a la exposición a la inhalación a partículas en el aire. Para evaluar la toxicidad potencial de las partículas en el aire, se ha avanzado en el desarrollo de sistemas de exposición a la interfaz aire-líquido (ALI)1,2,3,4,5. Los sistemas de exposición ALI permiten modelos de exposición más relevantes y realistas en comparación con la exposición sumergida tradicional a través del medio de cultivo que altera las características y cinéticas de las partículas6. Los sistemas de exposición ali ponen demandas específicas en los modelos de cultivo celular, ya que los modelos carecen de medio de cultivo y por lo tanto nutrientes en el lado apical. Muchos modelos celulares se ven afectados negativamente por ser cultivados y expuestos al aire (por ejemplo, secarse) y sólo permanecen viables durante unos días. Esto limita las condiciones de exposición que se pueden utilizar en estos modelos: normalmente se aplican concentraciones relativamente altas en un corto período de tiempo como una nube (es decir, gotas que contienen partículas, que se asientan rápidamente). Estas condiciones experimentales no reflejan una exposición realista a largo plazo a bajas concentraciones de partículas; por lo tanto, la pertinencia de los resultados puede ser cuestionada. Para superar estas limitaciones, se optimizó el protocolo de cultivo y exposición para un modelo bronquial que consiste en la línea celular epitelial bronquial humana Calu-37.

La mayoría de los modelos pulmonares in vitro utilizados para la exposición a ALI contienen otras líneas celulares como A549, BEAS-2B y 16HBE14o- (16HBE) o células primarias como base8. Estas líneas celulares tienen la desventaja de que siguen siendo viables durante sólo unos días cuando se cultivan en el ALI. Además, algunas de estas líneas celulares se sobrecargan cuando se cultivan durante un período superior a 5 días. Por último, las células A549 pierden uniones estrechas funcionales y, por lo tanto, no pueden formar una barrera apretada que se necesita para imitar los pulmones9,10. Las células epiteliales primarias pueden ser una buena opción para la exposición a ALI, ya que pueden ser cultivadas en el ALI durante semanas. Sin embargo, las células primarias difieren de un lote a otro, son más difíciles de mantener y son más costosas en comparación con las líneas celulares, lo que las hace menos adecuadas para las pruebas de toxicidad y la detección. Al comparar diferentes líneas celulares epiteliales bronquiales humanas (16HBE, Calu-3, H292 y BEAS-2B), sólo las células Calu-3 cumplen todos los criterios necesarios para la exposición realista y repetida de ALI: siguen siendo viables durante semanas mientras se cultivan en el ALI, proporcionan una alta integridad de barrera, no superan y son fáciles de desarrollar y mantener. Las células Calu-3 se originan a partir de un adenocarcinoma y son capaces de producir moco11,12. Hay inconsistencias en cuanto a si las células pueden desarrollar cilio11,13. Las células Calu-3 también son un modelo adecuado para estudiar infecciones por el virus respiratorio sincitial (RSV) que infectan las células epiteliales de las vías respiratoriasciliadas 14.

Además del modelo celular, se utiliza un sistema automatizado de exposición (AES) para la exposición aire-líquido a aerosoles15,16. El AES tiene la ventaja de que utiliza un flujo de aire continuo para exponer el modelo celular a aerosoles. Esto contrasta con otros sistemas de exposición aire-líquido que suelen utilizar concentraciones relativamente altas en un corto período de tiempo como nube (es decir, gotas que contienen partículas que se asientan rápidamente)17,18,19. Estos sistemas en la nube no reflejan una exposición realista a largo plazo a bajas concentraciones de partículas. Al aplicar un flujo de aire continuo utilizando el AES, el modelo celular puede estar expuesto a una baja concentración de partículas durante un período de tiempo más largo, lo que refleja condiciones de exposición realistas. Otra ventaja sobre los sistemas en la nube es que el AES tiene la opción de conectar instrumentos de caracterización de partículas, lo que permite medir el tamaño de las partículas, la concentración numérica y la masa a lo largo del tiempo. Una limitación del AES es que utiliza flujos de aire relativamente altos entre 10 mL/min y 100 mL/min.

Protocol

1. Preparación del medio de cultivo celular (CCM)

  1. Preparar una botella de 500 ml de medio esencial mínimo (MEM) complementado con glutamina.
  2. Añadir 5 ml de penicilina-estreptomicina (es decir, 100 penicilinas U/mL y 100 μg/mL de estreptomicina).
  3. Añadir 5 ml de solución de aminoácidos no esenciales (NEAA).
  4. Añadir 10 ml de anfotericina B (opcional).
  5. Añadir 50 ml de FBS (inactivado por calor, por favor siga el protocolo ATCC para la inactivación de calor; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/AnimCellCulture_Guide.ashx, página 19)).

2. Subculturing de células Calu-3

NOTA: Las células Calu-3 se cultivan en frascos de cultivo celular T75 o T175 a 37 °C y 5% CO2. Las celdas se pasan al 60-80% de confluencia cada 7 días con renovación de CCM cada 2-3 días. Ccm se vierte y ccm fresco (T25 = 5 mL, T75 = 15 mL, y T175 = 25 mL) se canaliza en el matraz y el matraz se coloca de nuevo en la incubadora. Las células deben ser pasadas por lo menos 2 veces después de descongelarse, antes de usarlas en experimentos, o antes de congelarse, y no deben pasar más de 25 veces en total.

  1. Confirme si el matraz es 60-80% confluente comprobando bajo un microscopio de luz.
  2. Vierta el CCM del matraz.
  3. Lave las células 2 veces con 5 ml de solución de sal equilibrada (HBSS) de 1x Hanks sin calcio y sin magnesio. Deseche el HBSS después de cada lavado. HBSS elimina el suero, que inhibe la trippsina.
  4. Añadir 3 ml de trypsin-EDTA para un T75 (4 ml para un T175) y colocar el matraz de nuevo en la incubadora a 37 °C y 5% CO2 durante 10-15 min. Compruebe después de 10 min, asegurando que las células se hayan desprendido de la superficie del matraz. En caso de que las células crezcan a >80% de confluencia, no se separarán usando trypsin 0.05% y trypsin 0.25% podría ser utilizado.
  5. Añadir 6 mL (es decir, duplicar el volumen trypsin-EDTA originalmente añadido) de CCM al matraz y agitar suavemente los frascos para asegurar una mezcla adecuada. Esto es para asegurar que la trypsin ha sido neutralizada por el FBS en el CCM y su actividad en las células detenidas. Si se permite que la trippsina permanezca en contacto con las células durante demasiado tiempo, no volverán a colocarse cuando se pongan en un nuevo matraz de cultivo celular.
  6. Vierta el contenido completo del matraz en un tubo centrífuga de 50 ml.
  7. Centrífuga las células durante 5 min a 130 x g,asegurándose de que la centrífuga esté correctamente equilibrada.
  8. Vuelva a colocar el vial que contiene las células en condiciones asépticas y retire el sobrenadante suavemente, sin alterar el pellet. El sobrenadante se puede verter y el resto pipetted apagado, asegurando que el pellet no se perturba.
  9. Resuspend el pellet celular en 1 ml de CCM pipendo hacia arriba y hacia abajo hasta que se suspendan todas las células (es decir, no se observan aglomerados de pellets o células). Se puede agregar CCM adicional para diluir la suspensión celular.
  10. Cuente las células, tanto muertas como vivas, en 1 ml de CCM usando un hemocítómetro. Si es necesario para un recuento adecuado, diluya las células en 3 o 4 ml.
  11. Suspenda las celdas en el volumen CCM requerido y agregue la suspensión de la celda en cada matraz. Para lograr alrededor del 80% de confluencia en una semana, sembrar 2 x 106 células en un T75 o 6 x 106 células en un T175.
  12. Mezcle suavemente el matraz y vuelva a colocarlo en la incubadora a 37 °C y 5% CO2.
  13. Reemplace con CCM fresco cada 2–3 días y subcultura cuando las células alcancen el 60-80% de confluencia.

3. Sembrar células Calu-3 en inserciones de cultivo

NOTA: Las plaquitas están disponibles con diferentes tamaños de poros. Los tamaños de poros pequeños (por ejemplo, 0,4 μm) tienen la ventaja de que las células crecen más fácilmente y pueden lograr una buena barrera ya después de 5 días de cultivo en condiciones sumergidas, medida por resistencia eléctrica epitelial trans (TEER). Sin embargo, cuando están interesados en la translocación de partículas, estos poros son demasiado pequeños y atraparán las partículas. Por lo tanto, los tamaños de poros más grandes (por ejemplo, 3 μm) generalmente se eligen para probar partículas. Cuando se utiliza un tamaño de poro más grande, las células necesitan períodos de tiempo más largos (por ejemplo, 7-10 días de cultivo en condiciones sumergidas) para lograr un buen TEER.

  1. Prepare la suspensión celular con concentración conocida siguiendo los pasos 2.1–2.10.
  2. Diluir las células a una concentración de 5 x 105 células/ml en CCM preguerrado para 6 plaquitas de pozo o 2,5 x 105 celdas/ml para 12 plaquitas de pozo.
  3. Tome una placa de cultivo celular con plaquitas y colóquela en condiciones asépticas.
  4. Llene el lado basolateral con 2 ml de CCM prewarmed para 6 plaquitas de pozo, o 1 mL para 12 plaquitas de pozo. Al agregar el medio de cultivo, saque la plaquita con pinzas.
  5. Mezcle cuidadosamente la suspensión de la celda canalizando hacia arriba y hacia abajo. Pipeta 1,0 ml para 6 plaquitas de pozo y 500 μL para 12 plaquitas de pozos (equivalentes a 100.000 células/cm2)en la parte superior de la membrana en el inserto de cultivo celular con 0,4 μm de poros. Para los poros de 3,0 μm, aumente la densidad celular a 128.000 células/cm2.
  6. Cubra la placa de cultivo celular e incubar a 37 °C y 5% CO2.
  7. Cambie el MCP cada 2–3 días.
  8. Deje que las células se vuelvan confluentes durante 7 días en condiciones sumergidas antes de continuar cultivando en el ALI.
  9. Medir TEER.
    1. Tome un voltohmómetro epitelial complementado con conjunto de electrodos de palillo y cargue el sistema de baterías durante la noche.
    2. Desconecte el Voltohmmeter del cargador y conecte el electrodo del palillo.
    3. Limpie el electrodo con un 70% de etanol.
    4. Coloque el electrodo en el CCM colocando el electrodo más largo en el medio de cultivo externo hasta que toque la parte inferior del plato y poniendo el electrodo más corto en el medio sin tocar la membrana.
    5. Comience con una plaquita vacía sin celdas. Espere hasta que la medición se estabilice y anote la resistencia en Ohmios. Esta medida es la resistencia de la membrana de la plaquita sin ninguna celda (es decir, resistencia en blanco).
    6. Repita la medición de cada plaquita y reste la resistencia en blanco para obtener la verdadera resistencia.
    7. Para el análisis de datos, multiplique los valores de resistencia por el área de superficie de la plaquita en Ω x cm2. Para una inserción de 6 pozos, la superficie es de 4,67 cm2. Por lo tanto, si se mide una resistencia de 600 Ohmios y el fondo es de 120 Ohmios, la resistencia es de 480 Ohmios, que luego se multiplica por la superficie de 4,67 cm2 para un total de 2.241,6 Ohmios x cm2. El TEER debe ser >1.000 Ω x cm2 para continuar.
  10. Retire el CCM del lado apical de las plaquitas.
  11. Añadir 2 ml de CCM prewarmed para 6 pozos y 1 mL para 12 plaquitas de pozo al lado basolateral del pozo (es decir, debajo de la inserción de cultivo celular). El CCM debe tocar la membrana desde la parte inferior, pero no filtrarse en la parte superior de la plaquita.
  12. En este punto las células están expuestas apáticamente al aire, que se conoce como cultivo en el ALI.
  13. Células de cultivo en el ALI en la incubadora a 37 °C y 5% CO2 durante 7 días antes de la exposición.
  14. Cambie el CCM basolateral cada 2-3 días. Las células se pueden utilizar en el ALI durante 6 semanas.

4. Preparación de la configuración de exposición

NOTA: Las secciones 5–7 describen los preparativos para la exposición a partículas utilizando una estación de exposición automatizada (AES, ver Tabla de Materiales). La configuración para la nebulización y caracterización de partículas también es compatible con otros sistemas de exposición ALI de otros fabricantes. Como ejemplo, la exposición a partículas se describe a continuación. Estos sistemas también se pueden utilizar para otras exposiciones, como sensibilizantes, humo de cigarrillos y escape diésel. La Figura 1 muestra el AES y un módulo de exposición. La Figura 2 muestra una representación esquemática de la configuración de exposición, incluidos todos los demás instrumentos.

  1. Antes de iniciar una exposición utilizando el AES, conecte el sistema a varios instrumentos para medir las características del aerosol; estos se miden en una corriente lateral justo antes de que los aerosoles entren en el armario.
    NOTA: Se utiliza un divisor de flujo para conectar la corriente lateral al equipo de caracterización de exposición. Generalmente, se utiliza el siguiente equipo: tamaño de partícula de movilidad de barrido (SMPS), dimensionador óptico de partículas (OPS), contador de partículas de condensación (CPC), microequilibrio oscilante de elementos cónicos (TEOM). Las mediciones SMPS y OPS se realizan 1x por hora y utilizan el mismo tubo desde el divisor de flujo. El CPC y el TEOM realizan medición continua y los datos de ambos se registran en un registrador de datos Squirrel modelo 2020. Además, la concentración de masa gravimétrica se determina utilizando un microequilibrio en humedad relativa controlada (40-70 %) y condiciones de temperatura (21–23 °C). Los filtros de teflón se pesan antes y después de cada exposición para confirmar la concentración de exposición. Para capturar el escape, se utiliza un filtro HEPA. La configuración, incluidas las suspensiones de nanomateriales de ingeniería (ENM) y el nebulizador, se colocan en un gabinete de flujo para evitar cualquier exposición a las personas. El AES se puede utilizar para probar muchos tipos diferentes de ENM, incluyendo metales y óxidos metálicos.
  2. Prepare una suspensión nanomaterial poco antes de la exposición. Por lo general, se prepara una suspensión del 1% como solución de stock. Por ejemplo, suspender 100 mg de nanomaterial en 10 ml de agua pura.
    NOTA: Para la exposición DQ12, se utilizan 300 mg para alcanzar aproximadamente 2 μg/cm2. Esta cantidad se puede utilizar en una sola exposición o dividirse sobre exposiciones repetidas (por ejemplo, 300 mg se suspende en 30 ml para una sola exposición o 21,5 mg se suspende en 2,15 ml frescos todos los días durante 3 semanas de exposición repetida). La suspensión se prepara recién en cada día de exposición. La suspensión de partículas se sonica durante 16 min utilizando sonicación de sonda. El volumen de la solución de stock del 1% se ajusta a un volumen total de 100 ml mediante la adición de agua pura.
  3. Coloque la suspensión ENM en una botella pequeña con una tapa y un agitador magnético para evitar el sedimento de las partículas. Conecte la botella a una bomba peristáltica a través de un tubo pequeño y ajuste el flujo a 25 mL/h.
  4. Conecte la bomba peristáltica a una boquilla de pulverización y ajuste los ajustes para permitir la en aerosolización continua.
  5. La boquilla de pulverización está montada en un tubo de aluminio de 60 cm de largo (cámara de mezcla, diámetro 15 cm, calentado a 60 °C). La configuración está conectada al AES a través de un tubo de cobre de 1,5 metros de largo (diámetro 15 cm). Además del AES, un impactador elimina todos los aerosoles de más de 2,5 μm.
  6. Conecte la boquilla de pulverización a aire comprimido de 3 barras a través de dos controladores de flujo de masa (MFC) para permitir la nebulización de las suspensiones. Un flujo de 14 L/min se utiliza para la boquilla de pulverización, el otro MFC para la mezcla del aire en el tubo.
  7. El día antes del inicio de la exposición, encienda el AES para permitir que el gabinete alcance una temperatura de 37 °C.
  8. Encienda el flujo de aire y la humedad en el armario 2 h antes del inicio de la exposición, para alcanzar el 85% de humedad. Encienda el calentamiento de las cámaras de exposición en las que se colocarán las plaquitas con las celdas.
  9. Encienda el microequilibrio de cuarzo (QCM) y establezca el valor inicial en 0 utilizando el software. Comience a registrar. Cada 10 s la masa se mide y se expresa como ng/cm2.
  10. Caliente los medios de cultivo celular a 37 °C en un baño de agua (~20–30 min).

5. Preparación de células Calu-3 para la exposición

NOTA: Para una exposición ali típica usando el AES, se necesitan 15-20 plaquitas con una capa celular confluente. Consisten en 3 controles de aire limpio, 3 controles de incubadora que se manejarán de forma similar a las otras plaquitas sin exposición en el AES, 6-8 plaquitas para la exposición al aerosol (dependiendo del uso de 0, 1 o 2 microequilibrios), 1-3 plaquitas para mediciones de control (como la liberación máxima de LDH) y 3 plaquitas de repuesto en caso de que el TEER de algunas de las plaquitas no sea suficiente. Las celdas deben tener un TEER de >1.000 Ω x cm2 para continuar.

  1. En el primer día de exposición, lave las células 1x con CCM, compruebe la morfología celular y mida el TEER del modelo celular usando un Voltohmmeter. Las células deben formar una monocapa apretada sin huecos.
  2. Ponga 2 mL/1 mL de HEPES en búfer CCM sin FCS al lado basolateral de 6 placas de pozo/12 y transfiera las plaquitas de cultivo con celdas a las nuevas placas.
    NOTA: Durante la exposición, no hay CO2 presente en el AES. Por lo tanto, el medio de cultivo almacenado en búfer HEPES (HEPES de 25 mM) se utiliza durante el transporte y la exposición. Este medio se utiliza tanto para las células expuestas en el AES como para las células de control de incubadoras.
  3. En caso de que el tiempo para transportar los cultivos celulares al AES sea superior a 5 min, coloque las celdas en una incubadora portátil de 37 °C durante el transporte.

6. Manipulación del AES durante una exposición

  1. En el AES, llene los módulos de exposición con CCM amortiguado por HEPES sin suero de becerro fetal (FCS). La cantidad de MCP depende de la unidad utilizada y del tipo de inserción de cultivo de celda. Tenga en cuenta que para mantener las células en el ALI, el medio debe llegar a la parte inferior de la membrana, pero no debe filtrarse en la parte superior de la membrana. Cuando utilice 6 plaquitas de pozo, agregue 6 ml de CCM amortiguado por HEPES a los módulos de exposición.
  2. Transfiera las plaquitas con células de las placas a los módulos de exposición utilizando pinzas estériles. Compruebe que no haya burbujas de aire en el lado basolateral de las celdas y retire cualquier CCM en el lado apical de las plaquitas. En caso de que haya algunas burbujas de aire en el lado basolateral, gire suavemente las plaquitas usando las pinzas estériles hasta que se retiren. Mantenga las placas que contienen CCM en una incubadora para su transferencia después de una exposición.
  3. Utilice la pantalla táctil para elegir la duración de la exposición, el caudal de aire y la mejora de la deposición electrostática. La pantalla también se puede utilizar para comprobar la humedad y la temperatura. Por lo general, se elige una duración de exposición de 4 h, con un caudal de 50 ml/min en las plaquitas a 37 °C y un 85% de humedad.
    NOTA: Los módulos del primer nivel (Figura 1) se utilizan para la exposición al aire limpio; las plaquitas de este nivel se utilizan como controles de exposición al aire limpio. Los demás módulos del segundo y tercer nivel se pueden utilizar para la exposición al aerosol, incluidos dos módulos para microequilibrios de cristal de cuarzo (QCM) para medir la deposición en línea.
  4. La prueba de fugas debe realizarse antes de iniciar la exposición. La fuga debe ser inferior a 5 ml/min. Siga las instrucciones que aparecen en la pantalla de AES. Una vez finalizada la prueba de fugas, se puede iniciar la exposición. En caso de fuga, se debe comprobar el tubo.
  5. Al final de la exposición, abra la puerta de un módulo AES, abra los módulos de exposición, coloque las plaquitas de cultivo celular de nuevo a las placas de cultivo celular y transfiera las placas a la incubadora portátil.
  6. Recoja los medios de los módulos (es decir, muestras expuestas) y de las placas (es decir, controles de incubadora) para su posterior análisis, como la medición de lactato deshidrogenasa (LDH).
  7. De vuelta en el laboratorio de cultivo celular, transfiera las plaquitas de cultivo celular a placas llenas de CCM estándar fresco. Coloque las placas de cultivo celular en la incubadora hasta la siguiente exposición o hasta su análisis.
  8. Después del día de exposición final, coloque las plaquitas en la incubadora hasta el día siguiente.
  9. Al día siguiente de la exposición final, agregue CCM al lado apical para medir EL TEER usando un Voltohmmeter. Recoja el CCM basolateral y apical por separado para el análisis de citoquinas.
  10. Retire todo ccm y realice un ensayo de viabilidad celular agregando, por ejemplo, un reactivo de proliferación al lado apical.

7. Limpieza del AES

  1. Llene los módulos de exposición con agua, espere 1 minuto y retire el agua. A continuación, llene los módulos con un 70% de etanol, déjelo durante 10 minutos y retire el etanol. Limpie las trompetas de exposición también con un 70% de etanol.
  2. Detenga el control de humedad del 85%, pero deje la temperatura del gabinete a 37 °C para el próximo experimento.

Representative Results

Este artículo proporciona un método para cultivar y exponer células epiteliales bronquiales humanas en el ALI que imita condiciones realistas de exposición a la inhalación repetida que se pueden utilizar para pruebas de toxicidad. Las características tanto del modelo celular como del sistema de exposición son esenciales para lograr un modelo realista de exposición a la inhalación que pueda utilizarse para exposiciones repetidas. Los resultados sobre estas características se muestran a continuación.

Requisitos y selección del modelo celular

Al seleccionar un modelo de celda adecuado, deben tenerse en cuenta las siguientes características:

  1. El modelo celular debe ser capaz de formar una monocapa confluente con uniones estrechas que funcionen para imitar la barrera pulmonar.
  2. El modelo de celda debe mostrar un rendimiento óptimo cuando se expone repetidamente al aire acondicionado (temperatura y humedad).
  3. El modelo celular debe responder a una exposición.

Este estudio comenzó con cuatro líneas celulares epiteliales bronquiales humanas diferentes: 16HBE, Calu-3, H292 y BEAS-2B. Todos estos son ampliamente utilizados para pruebas de toxicidad de nanomateriales y productos químicos. De las cuatro líneas celulares, sólo las células Calu-3 cumplieron con todos los requisitos anteriores. Las células formaron una monocapa con uniones estrechas(Figura 3)que se mantuvo como una barrera estable con el tiempo medida por TEER, mientras que las otras líneas celulares no formaron una barrera o mostraron una caída en la función de barrera cuando se cultivaban en el ALI (Figura 4). Además, H292 y BEAS-2B tendían a crecer en exceso en varias capas celulares cuando se cultivaban durante un período de tiempo más largo. La culturing tradicional de células sumergidas y la culturing ALI difieren mucho, porque en el lado basolateral los nutrientes ALI sólo estaban disponibles desde el lado basolateral y las células estaban expuestas a condiciones secas en el lado apical. Estas condiciones pueden causar estrés a los modelos celulares, que podrían observarse midiendo la viabilidad celular con el tiempo. Las líneas celulares 16HBE, H292 y BEAS-2B mostraron una mayor liberación de LDH cuando se cultivaban en el ALI, mientras que las células Calu-3 mostraron sólo una ligera liberación de LDH(Figura 5).

A continuación, se probó la respuesta del modelo Calu-3 a las sustancias. Como sustancia de control positiva, lps se administró a través de nebulización en el lado apical del modelo. La dosis depositada fue de 0,25 μg/cm2. Las células calu-3 mostraron una reacción a la lipopolisacárido (LPS) por un aumento en la liberación de LDH y en la liberación del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) (Figura 6).

Finalmente, la monocapa Calu-3 estuvo expuesta a nanomateriales de sílice de cuarzo (DQ12) (OIM, Edimburgo). La sílice cristalina puede inducir silicosis y también puede causar tumores pulmonares. Por lo tanto, la Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer (IARC) ha clasificado la sílice cristalina como carcinógeno humano del Grupo I20. Se cree que el mecanismo de acción de la sílice cristalina es a través de la inducción de inflamación persistente causada por su superficie reactiva21,22,23. Varios estudios in vivo tanto en ratas como en ratones reportan la inducción de cambios de inflamación e histopatología, incluyendo tumores y fibrosis, después de la exposición por inhalación a sílice cristalina24,25,26,27,28,29. Todos estos efectos se observan después de la exposición repetida y/o seguimiento a largo plazo. El modelo Calu-3 se utilizó para investigar si las observaciones de los estudios in vivo podían ser imitadas usando un modelo in vitro que podría ser expuesto repetidamente en el ALI.

Las células calu-3 estuvieron expuestas durante 3 semanas consecutivas, 5 días por semana, 4 h por día a DQ12. La dosis depositada se midió utilizando un QCM. La dosis media depositada fue de 120 ng/cm2 al día, con una dosis acumulada de 1,6 μg/cm2,similar a las dosis que inducen un efecto in vivo. Otras características de partículas se muestran en la Tabla 1. Después de 3 semanas de exposición, DQ12 no indujo efectos significativos en teer, viabilidad celular, y la liberación de proteína quimioattractante monocito 1 (MCP-1), en comparación con los controles de aire limpio (Figura 7). A medida que se esperaba una mayor toxicidad del DQ12 basada en los datos in vivo, la reactividad de las partículas se comprobó mediante un ensayo acelular de acuerdo con el protocolo optimizado dentro del proyecto de la UE GRACIOUS (entregable 5.3). La reactividad del lote DQ12 fue menor de lo esperado(Figura 8),órdenes de magnitudes menores en comparación con las partículas de control positivas negro de carbono (CB). Esta falta de reactividad podría explicar la ausencia de una respuesta de toxicidad en el modelo Calu-3.

Figure 1
Figura 1: La estación de exposición automatizada (AES).
La figura izquierda muestra el exterior del armario con el panel táctil. El AES tiene tres niveles con módulos de exposición: el nivel superior para exposiciones de aire limpio y el nivel medio e inferior para exposiciones a aerosoles. La figura correcta muestra el módulo de exposición en el que se colocan las plaquitas con celdas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representación esquemática de la configuración de exposición.
De izquierda a derecha: 1) la suspensión ENM conectada a la boquilla de pulverización a través de una bomba peristáltica; 2) El uso de aire comprimido la boquilla de pulverización nebuliza la suspensión ENM y a través de una cámara de mezcla los aerosoles se llevan a la AES; 3) Justo antes de entrar en el AES, los instrumentos de caracterización de aerosoles están conectados: SMPS, OPS, CPC y TEOM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagen representativa de las células Calu-3 después de la culturing en la interfaz aire-líquido (ALI) durante 10 días.
Imagen microscopía de fluorescencia de células Calu-3 después de cultivar en el ALI durante 10 días. La proteína de unión estrecha ZO-1 está manchada en verde, los núcleos de las células están manchados de azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Resistencia eléctrica transepithelial (TEER) de cuatro líneas celulares diferentes durante un período de cultivo de 21 días.
Valores TEER de 16HBE, Calu-3, H292 y BEAS-2B cuando se cultivan durante 21 días: primeros 7 días sumergidos, seguidos de 14 días en el ALI. Los valores TEER se corrigieron para la resistencia de fondo de la plaquita y se multiplicaron por el área de superficie de la plaquita. Los símbolos y las barras de error representan el valor medio y la desviación estándar de seis inserciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Liberación LDH de cuatro líneas celulares diferentes durante un período de cultivo de 21 días.
Lanzamiento LDH de 16HBE, Calu-3, H292 y BEAS-2B cuando se cultiva durante 21 días: 7 días sumergidos, seguido de 14 días en el ALI. Los valores LDH mostrados son relativos a la liberación máxima de LDH por tipo de celda. Los símbolos y las barras de error representan el valor medio y la desviación estándar de cinco inserciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Efectos celulares en células Calu-3 expuestas a LPS.
Las células calu-3 fueron expuestas a través de la nebulización de la nube a 0,25 μg/cm2 LPS. (A) La conversión WST-1. (B) Liberación LDH. (C) Liberación de TNF-α después de la exposición a LPS. Los símbolos y las barras de error representan valores medios y desviaciones estándar de tres inserciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Efectos celulares en células Calu-3 expuestas a nanomateriales DQ12.
Las células Calu-3 estuvieron expuestas durante 3 semanas (4 h por día, 5 días a la semana) a nanomateriales DQ12, aproximadamente 120 ng/cm2 por día, dosis acumulada de 1,6 μg/cm2. (A) valores TEER. (B) Liberación LDH. (C) Liberación mcp-1 después de la exposición DQ12. Todos los símbolos y barras de error representan valores medios y desviaciones estándar de tres inserciones para los controles y seis insertos para la exposición DQ12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Reactividad acelular del DQ12.
DQ12 fue incubado con una sonda 2ʹ,7ʹ-Dichlorofluorescein Diacetate (DCFH-DA) para detectar su reactividad superficial. Como control positivo, se incluyeron partículas de negro carbón (CB). En comparación con CB, DQ12 tiene una reactividad superficial muy baja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Masa de partículas (μg/m3) Número de partícula (#/cm3) Tamaño de partícula de movilidad (nm) Desviación estándar geométrica Tamaño de partícula óptica (μm)
2969 (418) 83983 (10215) 66.6 2.5 1.1 (1.3)

Tabla 1: Características de exposición DQ12. Los valores se muestran como promedio con desviación estándar entre corchetes.

Discussion

Este artículo describe un método para cultivar células epiteliales bronquiales humanas bajo ALI y exponer este modelo bronquial a aerosoles o gases. La ventaja de usar células Calu-3 es que forman uniones estrechas, siguen siendo una monocapa, son capaces de soportar el flujo de aire y se pueden cultivar durante semanas en el ALI, a diferencia de muchos otros tipos de células (por ejemplo, 16HBE, H292 y BEAS-2B). El uso de la estación de exposición automatizada (AES) vitrocell® tiene la ventaja de que las células pueden ser expuestas en condiciones realistas y relevantes, ya que se pueden aplicar bajas concentraciones utilizando un flujo de aire continuo.

Los sistemas de flujo continuo, como el AES, tienen ventajas en comparación con el uso de sistemas en la nube3,32, que utilizan una sola nebulización de una suspensión. El flujo continuo es más realista y muchas variables como el caudal, la humedad y la temperatura se controlan. Además, la deposición se puede mejorar utilizando un campo eléctrico. Por último, las características del aerosol como el tamaño, la concentración numérica y la masa se supervisan en línea. Una desventaja es que los sistemas de flujo continuos son más complejos en comparación con los sistemas en la nube. Por lo tanto, es importante llevar a cabo experimentos preparatorios que se centren en las características de las partículas del aerosol y la dosis administrada en la plaquita. La concentración inicial inicial de las partículas y los ajustes de AES se pueden ajustar para lograr la dosis deseada en las células33. Dependiendo del tipo de partículas que se prueben, el método de generación de aerosoles puede diferir. El uso de la deposición electrostática depende del tipo de partícula y funciona mejor para partículas metálicas. Para las partículas con una carga superficial positiva, se debe aplicar un campo electrostático negativo y viceversa.

La selección de las concentraciones de exposición puede ser difícil para cualquier experimento de exposición aire-líquido. Para las exposiciones DQ12, el objetivo era lograr una dosis acumulada total de 1 μg/cm2 después de 3 semanas de exposición, 5 días a la semana, 4 h por día. Esta dosis es similar a las dosis que indujeron un efecto in vivo21,25,27,32,33. Al realizar las exposiciones, hubo alguna variación entre los diferentes días de exposición. Aunque la dosis real depositada de 1,6 μg/cm2 es superior a la 1 μg/cm2 destinada, la dosis podría haber sido demasiado baja para observar los efectos en el modelo Calu-3. Sólo se observaron diferencias menores en el TEER, la viabilidad y la respuesta a las citoquinas entre la exposición al aire limpio y la exposición al DQ12, y estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Una explicación para la observación de que la exposición DQ12 durante 3 semanas no indujo efectos significativos en las células Calu-3 es que faltaban macrófagos del modelo Calu-3. Posiblemente, después de la absorción de DQ12 macrófagos producen citoquinas proinflamatorias que pueden afectar a las células calu-3. Otra explicación es que el lote DQ12 que se utilizó para los experimentos no fue tan reactivo como se esperaba. Cuando se utiliza LPS como sustancia de control positiva, Calu-3 muestra una respuesta, medida por un aumento en la liberación de LDH y un aumento en la liberación de TNF-α. Esto indica que el modelo puede detectar toxicidad.

El modelo de celda Calu-3 tiene muchas ventajas, como se describe en la sección de resultados. Además, cuando se cultiva durante más tiempo en el ALI, las células Calu-3 pueden cultivar estructuras cilia/cilia-like13 y producir moco11,12,13. A pesar de estas ventajas, el modelo tiene limitaciones con respecto a su relevancia fisiológica. Las líneas celulares Calu-3 se originan a partir de un adenocarcinoma, mientras que 16HBE y BEAS-2B se originan en tejido sano. Desafortunadamente, estos dos últimos no son adecuados para la exposición repetida de ALI, ya que no permanecen como un monocapa estable con el tiempo. Otra limitación del modelo Calu-3 es que solo representa un solo tipo de celda. En el pulmón humano, hay múltiples tipos de células que interactúan y responden de manera diferente a la exposición. Las partículas inhaladas se depositarán en diferentes regiones de los pulmones dependiendo de su tamaño aerodinámico. Aquí es donde las partículas entran en contacto con la barrera celular epitelial, como imita el modelo Calu-3. En el pulmón humano, los macrófagos alveolares se sienten atraídos por las partículas, las envuelven y las eliminan de los pulmones. Los macrófagos también desempeñan un papel esencial en la respuesta de inflamación a la exposición a partículas. Por lo tanto, se están haciendo esfuerzos para extender el modelo Calu-3 añadiendo macrófagos primarios para imitar la barrera pulmonar más de cerca. La desventaja de los macrófagos es que siguen siendo viables sólo durante unos 7 días cuando se cultivan encima de las células Calu-3 en el ALI. Por lo tanto, los macrófagos deben leerse semanalmente para transformar el actual modelo Calu-3 en un modelo de cocultura. La optimización del protocolo de cocultura está actualmente en curso.

Dado lo anterior, el modelo bronquial Calu-3 es un modelo adecuado para la exposición repetida a aerosoles de sustancias parcialmente solubles como productos químicos del humo del cigarrillo y LPS. Estas sustancias solubles inducen aumentos significativos en las respuestas de citoquinas en las células calu-3. Para probar partículas insolubles como el escape diésel y el DQ12, se necesita un modelo de cocultura, porque los macrófagos desempeñan un papel crucial en la inducción de efectos por exposición a partículas.

Para las exposiciones descritas, se utilizaron membranas de inserción con poros de 3,0 μm. La razón principal para elegir este tipo de plaquita es que es posible probar la translocación de nanomateriales. Cuando se utiliza un tamaño de poro más pequeño de 0,4 μm, los aglomerados de partículas no podrán cruzar la membrana de la plaquita. La desventaja de usar un tamaño de poro grande es que las células necesitan más tiempo para confluentes y que es más difícil visualizar la morfología de las células usando microscopía ligera. Para comprobar que las células forman una monocapa confluente, el TEER debe ser >1.000 Ω x cm2 antes de iniciar una exposición.

En conjunto, el modelo bronquial Calu-3 presentado aquí es adecuado para su uso para la exposición repetida a aerosoles, al menos hasta 3 semanas. El modelo puede soportar ser cultivado y expuesto a través de un flujo de aire continuo y es capaz de detectar toxicidad para el epitelio bronquial.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo está financiado por el proyecto de la UE PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) y el Ministerio holandés de Salud, Bienestar y Deporte (proyecto V/050012). Nos gustaría agradecer a la Dra. Yvonne Staal y al Dr. Jan van Benthem por revisar críticamente el manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.01 M NaOH Sigma Aldrich S5881
0.1M (x10) PBS Gibco 14200-059
2’,7’-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA) Sigma Aldrich D6883
3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride) Abcam ab141525
Amphotericin B Thermo Fisher Scientific Inc. 15290
Automated exposure station Vitrocell
Cell proliferation reagent WST-1 Roche 11644807001
Centrifuge Eppendorf
CPC TSI inc., St Paul MN, USA 3022
Cytotoxicity detection kit LDH Roche 11644793001
DQ12 IOM nanomaterials
ELISA Ready-SET-Go Fischer Scientific 88-8086-86, 88-7399-88
EVOM2 World Precision Instruments Inc., FL, USA EVOM2-STX2
FBS Greiner bio-one 758093
Flow splitter TSI inc., St Paul MN, USA model 3708
Fluorescein diacetate (F-DA) Sigma Aldrich F7378
HBSS Thermo Fisher Scientific Inc. 14175
Light microscope Olympus CKX41
Mass flow controllers MFC, Bronkhorst, the Netherlands
Methanol (analytical grade) Sigma Aldrich 34860
Microbalance Sartorius, Goettingen, Germany ME-5
Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX Thermo Fisher Scientific Inc. 41090
NEAA Thermo Fisher Scientific Inc. 11140
OPS TSI inc., St Paul MN, USA 3339
Pen/Strep Thermo Fisher Scientific Inc. 15140
Phenol red free MEM Gibco 10500-064
Pure water Merck MilliQ
SMPS TSI inc., St Paul MN, USA 3936
Spray nozzle Schlick, Coburg, Germany
Teflon filters Pall R2PJ46
TEOM Rupprecht & Patashnick NY, USA series 1400
Tissue culture flask Thermo Fisher Scientific Inc. 690175, 658175, 660175
Transwell inserts Corning 3460, 3462
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific Inc. 25300
Tryptan Blue Sigma Aldrich T8154

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology. Nanomaterials (Basel). 7, (2), 49 (2017).
  2. Herzog, F., et al. Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches. The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).
  3. Lenz, A. G., et al. A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).
  4. Paur, H. R., et al. In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology. Journal of Aerosol Science. 42, (10), 668-692 (2011).
  5. Lacroix, G., et al. Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations. Applied in vitro Toxicology. 4, (2), 91-106 (2018).
  6. Loret, T., et al. Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions. Particle and Fibre Toxicology. 13, (1), 58 (2016).
  7. Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses. Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).
  8. Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives in Toxicology. 89, (9), 1469-1495 (2015).
  9. Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport. PLoS One. 11, (10), 0165225 (2016).
  10. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, (2), 107-126 (2015).
  11. Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies. International Archives of Allergy and Immunology. 170, (1), 1-21 (2016).
  12. Jeong, M. H., et al. In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576 (2019).
  13. Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier. Pharmacology Research. 23, (7), 1482-1490 (2006).
  14. Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection. Journal of Virological Methods. 174, (1-2), 144-149 (2011).
  15. Vitrocell. Vitrocell® Automated Exposure Station. Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1 (2019).
  16. Mülhopt, S., et al. Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system. Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).
  17. Vitrocell. VITROCELL® Cloud for the exposure to liquid aerosols. Available from: https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system (2019).
  18. Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11, (1), 40 (2014).
  19. Lenz, A. G., et al. Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions. Am J Respir Cell Mol Biol. 51, (4), 526-535 (2014).
  20. Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism. Critical Reviews in Toxicology. 41, (9), 756-770 (2011).
  21. Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica. Particle and Fibre Toxicology. 15, (1), 23 (2018).
  22. Kawasaki, H. A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity. Inhalation Toxicology. 27, (8), 363-377 (2015).
  23. Sayes, C. M., et al. Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles. Inhalation Toxicology. 22, (4), 348-354 (2010).
  24. Driscoll, K. E., et al. Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide. Toxicology and Applied Pharmacology. 111, (2), 201-210 (1991).
  25. Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica. Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, Suppl 2 27-29 (1995).
  26. Peeters, P. M., et al. Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs. Particle and Fibre Toxicology. 11, 58 (2014).
  27. Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats. Food and Chemical Toxicology. 29, (5), 341-354 (1991).
  28. Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months. Food and Chemical Toxicology. 45, (10), 1856-1867 (2007).
  29. Cho, W. S., et al. Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles. Toxicology Letters. 175, (1-3), 24-33 (2007).
  30. Herzog, F., et al. Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 10, (1), 11 (2013).
  31. Mülhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement. Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).
  32. van Ravenzwaay, B., et al. Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz. Toxicology Letters. 186, (2), 152-159 (2009).
  33. Henderson, R. F., et al. A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats. Fundamental and Applied Toxicology. 24, (2), 183-197 (1995).
Un modelo epitelial bronquial de interfaz aire-líquido para la exposición realista y repetida por inhalación a partículas en el aire para pruebas de toxicidad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braakhuis, H. M., He, R., Vandebriel, R. J., Gremmer, E. R., Zwart, E., Vermeulen, J. P., Fokkens, P., Boere, J., Gosens, I., Cassee, F. R. An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (159), e61210, doi:10.3791/61210 (2020).More

Braakhuis, H. M., He, R., Vandebriel, R. J., Gremmer, E. R., Zwart, E., Vermeulen, J. P., Fokkens, P., Boere, J., Gosens, I., Cassee, F. R. An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing. J. Vis. Exp. (159), e61210, doi:10.3791/61210 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter