Summary
Une méthode est décrite pour l’isolement simultané des myocytes et des non-myocytes des atria et des ventricules d’un coeur adulte simple de souris. Ce protocole a comme résultat des rendements cohérents des myocytes cardiaques et des non-myocytes fortement viables et détaille les conditions optimales de culture cellule-spécifique pour le phénotypage et l’analyse in vitro.
Abstract
L’isolement et la culture des myocytes cardiaques des souris ont été essentiels pour faire avancer la compréhension de la physiologie cardiaque et de la pathophysiologie. Bien que l’isolement des myocytes des cœurs néonatals de souris soit relativement simple, les myocytes du cœur murin adulte sont préférés. C’est parce que par rapport aux cellules néonatales, myocytes adultes plus précisément récapituler la fonction cellulaire comme il se produit dans le cœur adulte in vivo. Cependant, il est techniquement difficile d’isoler les myocytes cardiaques adultes de souris dans les quantités et la viabilité nécessaires, ce qui contribue à une impasse expérimentale. En outre, les procédures publiées sont spécifiques pour l’isolement des myocytes auriculaires ou ventriculaires au détriment des cellules non myocytes auriculaires et ventriculaires. Décrit ici est une méthode détaillée pour isoler les myocytes cardiaques auriculaires et ventriculaires, avec des non-myocytes auriculaires et ventriculaires, simultanément à partir d’un seul coeur de souris. Sont également fournis les détails des méthodes optimales de culture spécifique aux cellules, qui améliorent la viabilité et la fonction cellulaires. Ce protocole vise non seulement à accélérer le processus d’isolement des cellules cardiaques murines adultes, mais aussi à augmenter le rendement et la viabilité des cellules pour les investigations des cellules cardiaques auriculaires et ventriculaires.
Introduction
La culture cellulaire primaire est une ressource intégrale qui offre un environnement contrôlé pour des études mécanistes détaillées de la fonction myocyte cardiaque. En raison de leur nature plus durable et de la facilité d’isolement, les myocytes auriculaires et ventriculaires néonatals de rat ont été la source commune de telles culturescellulaires 1. Cependant, les myocytes auriculaires et ventriculaires adultes de souris (AMAMs et AMVMs) sont fortement souhaitables pour des études in vitro, parce que leurs caractéristiques moléculaires et fonctionnelles imitent mieux ceux des cellules cardiaques adultes. Ainsi, ils sont devenus pertinents pour les études liées aux pathologies cardiaques, dont la plupart se développent chez les adultes2.
En outre, la disponibilité et l’utilisation de modèles transgéniques et de souris de la maladie élargit l’utilité des myocytes cardiaques adultes isolés. Des protocoles pour l’isolement et la culture des AMVMs de souris pour des études à court et à long terme ont été décrits dans de nombreuses publicationsprécédentes 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. En comparaison, peu de protocoles ont été décrits pour l’isolement des AMAMs. En outre, ceux qui sont décrits sont principalement optimisés pour des études aiguës de cellules fraîchement isolées, sans protocole de culture à long terme décrit à cejour 11,12,13. Par conséquent, les protocoles d’isolement amam n’ont pas été conçus pour fournir l’utilité et la polyvalence des protocoles publiés pour l’isolement et la culture des AMVM. En outre, bien que les études pionnières sur l’isolement des AMAM et des AMVM se soient révélées ingénieuses, il n’existe pas de protocoles pour l’isolement et la culture simultanés optimaux des AMAM et des AMVM, ce qui se traduit par une utilisation efficace de tout le cœur pour chaque préparation.
Jusqu’à présent, les protocoles d’isolement amam et AMVM publiés n’étaient pas conçus pour l’isolement simultané des deux types de cellules, parce que la plupart des études sur la fonction auriculaire et ventriculaire ont une orientation spécifique à la chambre. Par exemple, les AMAMs sont principalement utilisés pour étudier l’électrophysiologie des myocytes auriculaires, en partie à cause de l’intérêt pour la fibrillation auriculaire (FA), l’arythmie cardiaque la plus courante aux États-Unis. Cependant, AF n’est pas une maladie qui affecte les atria dans l’isolement, et elle a été impliquée en tant qu’ayant un rôle causatif dans le dysfonctionnement ventriculaire gauche douxà grave 14. En outre, les électrocardiogrammes des patients présentant l’insuffisance cardiaque avec la fraction préservée d’éjection (HFpEF) ont illustré que la taille atriale gauche est l’un des prédicteurs les plus forts pour la susceptibilité àl’insuffisance cardiaque 15.
En plus de son rôle dans l’électrophysiologie et la contractilité, l’atrium est aussi un organe endocrinien sécrétant des cardiokines (c.-à-d. peptide natriurétique auriculaire [ANP]) qui régulent homéostatiquement la pression artérielle et le volume16,17. En outre, ANP (vraisemblablement des myocytes auriculaires) a un rôle protecteur et anti-hypertrophique proéminent dans les myocytes ventriculaires16,17. Bien qu’il y ait une forte implication de la communication neurohormonale entre les atria et les ventricules dans divers états de la maladie, les mécanismes sous-jacents à cette communication n’ont pas été entièrement explorés. Ce point est encore illustré par l’augmentation de la recherche se concentrant sur 1) le rôle des non-myocytes (en particulier les fibroblastes cardiaques et les cellules immunitaires) dans le cœur malades et 2) comment le remodelage cardiaque en fonction de la maladie affecte directement la viabilité des myocytes cardiaques et la fonction cardiaqueglobale 18,19,20,21,22. Ainsi, l’étude des cellules cardiaques des atria et des ventricules est une approche nécessaire pour obtenir une image plus complète de leurs rôles dans la pathophysiologie cardiaque.
Le protocole suivant décrit l’isolement simultané des myocytes auriculaires et ventriculaires et des non-myocytes d’un coeur simple de souris dans des conditions physiologiques et pathophysiologiques. En outre, cette méthode est la première à décrire les conditions optimales nécessaires au maintien des cultures de myocytes cardiaques auriculaires, car les conditions pour maintenir les cultures de myocytes ventriculaires ont déjà été publiées.
Protocol
Toutes les recherches effectuées sur des souris rapportées dans le présent document ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du SDSU et elles sont conformes au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publié par le Conseil national de recherches du Canada.
1. Préparation de l’isolement et des médias culturels et placage
- Préparer 1 L de perfusion cardiaque avant de l’utiliser en ajoutant joklik modifié minimum de médias essentiels (MMEM) à 1 L d’eau stérile. Réglez le pH à 7,36 avec 10 N NaOH, puis filtrez à travers un filtre de 0,2 μm et stockez à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
NOTE: Joklik MMEM se compose de 112 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 9 mM NaH2PO4, et 11,1 mM D-glucose. Ceci est complété par 10 mM HEPES (2,38 g/L), 30 mM taurin (3,75 g/L), 2 mM D-l-carnitine (0,4 g/L), 2 mM créatine et 10 mM de monoxime butanedione (1,01 g/L). - Préparez le tampon de digestion juste avant la perfusion, comme suit : supplément de 50 mL de perfusion cardiaque avec 6,25 μL de 100 mM CaCl2 (voir étape 1.3) et collagène de type 2 (activité enzymatique ~310-320 U/mg dw).
REMARQUE : Pesez l’animal avant le sacrifice. La quantité de collagène de type 2 complétée dans le tampon de digestion est dictée par le poids de l’animal (2,25 mg de collagène de type 2 pour 1 g de poids corporel). - Pour préparer 100 mM CaCl2, ajouter 1,47 g de CaCl2 à 100 mL d’eau de qualité biologie moléculaire. Remuer jusqu’à dissolution, puis passer à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à température ambiante jusqu’à 2 mois.
- Préparer le tampon d’arrêt des myocytes 1 en complétant 90 mL de tampon de perfusion cardiaque avec 10 mL de sérum bovin fœtal (FBS) et 125 μL de 100 mM CaCl2. Passer à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparer le tampon d’arrêt des myocytes 2 en complétant 114 mL de tampon de perfusion cardiaque avec 6 mL de FBS et 150 μL de 10 mM CaCl2. Passer à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparer le milieu de placage auriculaire des myocytes juste avant la perfusion en complétant 95 mL du milieu eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 4 mL de FBS, 1 mL de stylo 100x/strep-glutamine, 1 mL de 100x insuline-transferrin-sélénium, et 1 mL de 10 μM dexamethasone. Passer à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à 37 °C jusqu’au placage.
- Préparer le milieu ventriculaire de placage des myocytes en complétant 95 mL de milieu essentiel minimum (MEM) avec 4 mL de FBS, 1 mL de stylo 100x/strep-glutamine, 10 mL de solution HEPES de 1 M, 1 mL de 100x insuline-transferrin-sélénium, et 0,1 g de monoxime de butanedione. Passer à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Préparer le milieu de maintien ventriculaire du myocyte en complétant 99 mL de MEM avec 1 mL de 100x insuline-transferrin-sélénium, 0,1 mg/mL d’albumine bovine de sérum (BSA), 10 mL de solution HEPES de 1 M et 1 mL de stylo 100x/strep-glutamine. Passer à travers un filtre de 0,2 μm et conserver à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
- Pour préparer des plaques expérimentales et des diapositives recouvertes de laminine, décongeler la solution de bouillon de laminine de souris (1,19 mg/mL). Ajouter 10 μL de solution de bouillon de laminine à chaque 1 mL de DMEM, et mélanger. Enduire uniformément les plaques expérimentales et les glisser et les conserver dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant au moins 1 h avant la perfusion pour permettre l’équilibrage.
REMARQUE : Les plaques expérimentales enduites et les glissières peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à 2 jours.
2. Appareil d’isolement
- Avant chaque isolation, nettoyez le tube et d’autres composants du système avec trois lavages complets de 70% EtOH en remplissant le piège à bulles vers le haut (fermez le robinet d’arrêt inférieur et gardez le robinet d’arrêt supérieur ouvert).
- Rincez le système complet 3x avec le H2O stérile en remplissant le piège à bulles vers le haut (fermez le robinet d’arrêt inférieur et gardez le robinet d’arrêt supérieur ouvert).
- Rincez le système complet avec tampon de perfusion cardiaque et remplissez le piège à bulles à mi-chemin avec des supports.
- Réglez le bain d’eau en circulation à 37 °C.
- Réglez un bain d’eau pour les médias à 37 °C.
- Enlevez les bulles d’air dans le tube de pompe périssaltique.
- Ajuster le débit de la pompe périssaltique à 3 mL/min.
3. Intervention chirurgicale (non-survie)
- Faire tremper les instruments chirurgicaux dans 70% EtOH pendant au moins 5 min.
- Placez le média de perfusion cardiaque, les tampons d’arrêt des myocytes et le tampon de digestion dans le bain d’eau de 37 °C.
- Placez le milieu de placage auriculaire de myocyte, le milieu ventriculaire de placage de myocyte, et le myocyte ventriculaire maintenant le milieu dans un incubateur de 37 °C, 5% de CO2 1 h avant d’employer et desserrer les chapeaux pour permettre l’équilibre.
- Injecter des souris C57b6/j mâles ou femelles de 10 semaines intraperitoneally (i.p.) avec 0,35 mL d’héparine, diluée dans de la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à 100 UI/mL. Laissez le médicament prendre effet pendant environ 10 min.
REMARQUE : Si deux cœurs doivent être soumis à cette procédure d’isolement, la deuxième souris peut être anesthésiée et administrée héparine à ce stade de la première procédure. Pour minimiser le stress sur l’animal, une anesthésie légère peut être administrée à l’aide d’un mélange isoflurane/oxygène de 2 % dans une chambre d’induction hermétiquement scellée. - Anesthésier l’animal avec un mélange isoflurane/oxygène de 2% et injecter i.p. avec du pentobarbital (0,3 mL à partir de 10 mg/mL de bouillon), puis préparer la poitrine en écouvillonnant avec 70% d’EtOH.
- Préparer une suture de soie attachée 5-0 pour être prêt à ligate le cœur à la canule de perfusion. Mont canule juste à côté du microscope chirurgical.
- Ouvrez rapidement la poitrine en faisant d’abord une incision de la peau midline, du milieu de l’abdomen à la mâchoire, puis en entrant dans le péritoine avec les grands ciseaux, dégageant le diaphragme loin par dissection émoussée. Ensuite, coupez la cage thoracique à l’aide des ciseaux avec des coupes vers le haut de la paroi thoracique sur l’aspect latéral des deux côtés.
- Couper les connexions fibreux entre le cœur et la paroi thoracique (y compris le thymus). Ensuite, coupez la cage thoracique tous ensemble. À l’aide des petits forceps et ciseaux, soulevez doucement le cœur par le sommet et exposez l’aspect postérieur du cœur.
- Explanter le cœur en disséquant immédiatement inférieur à l’artère inénominate sur l’aorte ascendante et placer immédiatement le cœur dans pbs glacé ou froid cœur perfusion médias. Par la suite, disséquez rapidement le tissu restant du coeur explanté dans les médias glacés de perfusion de coeur, exposant l’aorte ascendante.
REMARQUE: Il est utile d’explanter le cœur avec le thymus intact à utiliser comme point de repère anatomique. - Nettoyez la zone entourant l’aorte de l’excès de tissu à l’aide de forceps et de ciseaux micro-disséquants. Placez l’aorte sur la canule à l’aide de forceps à pointe fine et fixez-le avec une suture en soie 5-0.
REMARQUE : Le meilleur placement se produit habituellement avec l’aorte s’étendant environ 2 millimètres vers le haut sur la canule. - Perfuser le cœur cannulé avec des supports de perfusion cardiaque à un débit de 3 mL/min pendant 4 min. Ensuite, passez du média de la perfusion cardiaque au tampon de digestion pour 15,0−17,5 min de perfusion (Figure 1A).
REMARQUE : Le débit coronarien augmentera probablement, ce qui indique une digestion efficace des tissus (c.-à-d. un cœur pâle et enflé). - Recueillir 8 mL de flux tampon de digestion à travers pendant les dernières minutes de perfusion pour une utilisation ultérieure dans l’étape 5.4.
- Retirer le cœur de la canule et le placer sur un plat de culture en plastique de 60 mm. Enlever l’excès de tissu (c.-à-d. l’aorte, les veines) et submerger le cœur dans 2,5 mL de tampon de digestion en vue d’une séparation mécanique.
REMARQUE : À ce stade, les atrias sont disséqués, et un expérimentateur devrait mener le protocole d’isolement cellulaire atrial, tandis qu’un deuxième expérimentateur devrait effectuer l’isolement ventriculaire de cellules.
4. Isolement et culture des cellules auriculaires
- Disséquer les airs loin du cœur et le placer dans un plat de culture en plastique de 30 mm. Submergez-le dans 0,75 mL de tampon de digestion pour la séparation mécanique. Gardez les ventricules dans le plat de 60 mm (étape 3.12) et effectuez simultanément les méthodes d’isolement distinctes (section 5, figure 1B).
REMARQUE : À ce stade, les atrias et les ventricules peuvent subir une séparation supplémentaire s’il est nécessaire d’isoler les cellules du côté gauche et droit. - Commencez à hacher et taquiner les airs à part, d’abord avec des ciseaux chirurgicaux à pointe fine et suivi de forceps fines pour hacher davantage. Évitez d’agiter les tissus et ne retirez pas rapidement les fibres musculaires.
- À l’aide d’une pointe stérile de pipette de transfert, continuer à mélanger et à dissocier doucement le tissu pendant 15 minutes. Toutes les 5 minutes, observez la dissociation auriculaire de myocyte du tissu sous un microscope brillant objectif de 10x. Au fur et à mesure que les tissus sont digérés, continuer à mélanger et à dissocier doucement les tissus à l’aide d’une pointe stérile de pipette de transfert avec une plus petite taille de pore.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube de micro-centrifugeuse stérile de 2 mL. Rincer la plaque de 30 mm avec 0,75 mL de myocyte de 37 °C arrêt tampon 1 et combiner avec la suspension cellulaire (volume final = 1,5 mL).
- Laissez les myocytes auriculaires sédimenter par gravité pendant 10 min à température ambiante. Agiter doucement la suspension cellulaire pour permettre aux myocytes de sédimenter au fond du tube conique, formant une pastille visible.
- Centrifugeuse de la suspension cellulaire pendant 5 min à 20 x g. Retirez soigneusement le supernatant, qui contient les non-myocytes, et transférez-le dans un tube conique en polypropylène de 15 mL à l’aide d’une pointe stérile de pipette sans perturber la pastille des myocytes auriculaires.
- Centrifugeuse de la fraction non myocyte pendant 5 min à 20.000 x g. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille non myocyte dans 10 mL de DMEM complété par 10% sérum de veau fœtal (FCS).
- Comptez les non-myocytes à l’aide d’un hémocytomètre ou d’une autre méthode, puis plaque selon les besoins expérimentaux, ou isoler davantage dans des populations cellulaires spécifiques individuelles par le tri cellulaire activé par fluorescence (figure 1C).
- Resuspendez la pastille des myocytes auriculaires isolés de l’étape 4.6 dans 1 mL du milieu de placage atrial de myocyte et appliquez 10 μL de cette suspension sur un hémocytomètre. Effectuez un dénombrement cellulaire de myocytes en forme de tige par champ.
- Aspirer la laminine à partir de plaques/diapositives expérimentales précoated et resuspendre les myocytes auriculaires isolés dans le volume approprié du milieu de placage auriculaire de myocyte complété avec 25 blebbistatin de μM. Plaque à la densité désirée par besoins expérimentaux (Figure 1C).
REMARQUE : La densité typique de placage pour la culture à long terme décrite ici est 5 x 105 cellules/chambre sur les glissières en verre de quatre chambre (1.7 cm2).
5. Isolement et culture de cellules ventriculaires
- Commencez à hacher et taquiner le cœur à part le tissu ventriculaire, d’abord avec des ciseaux chirurgicaux à pointe fine et suivi de forceps fins pour hacher davantage (Figure 1B). Évitez d’agiter le tissu en démontant rapidement les fibres musculaires.
- Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique en polypropylène de 15 mL. Rincer la plaque avec 2,5 mL de myocytes 37 °C arrêt tampon 1 et combiner avec la suspension cellulaire (volume final = 5 mL).
- À l’aide d’une pointe stérile de pipette de transfert, continuer à mélanger et dissocier doucement le tissu pendant 4 min. Appliquez 10 μL de cette suspension cellulaire sur la lame et visualisez la présence de myocytes en forme de tige pour assurer la qualité de l’isolement.
- Passez la suspension cellulaire à travers un filtre en nylon stérile de 100 μm dans un tube conique en polypropylène de 50 mL. Utilisez 2 mL de tampon de digestion recueilli à l’étape 3.12 pour laver les cellules restantes du filtre stérile en nylon.
- Laissez les myocytes ventriculaires sédimenter par gravité pendant 6 min à température ambiante. Agitez doucement la suspension cellulaire filtrée pour permettre aux myocytes de sédimenter au fond du cône, formant une pastille visible.
- Sans perturber la pastille des myocytes ventriculaires, retirez soigneusement le supernatant (non myocytes) et transférez-le dans un tube conique en polypropylène de 50 mL à l’aide d’une pointe stérile de pipette. Centrifugeuse de la fraction non myocyte pendant 5 min à 20.000 x g. Aspirer le supernatant et resuspendre la pastille non myocyte dans 10 mL de DMEM complété par 10% FCS.
- Comptez les non-myocytes à l’aide d’un hémocytomètre et résuspendez dans un volume approprié de DMEM complété par 10% de FCS. Ensuite, plaque selon les besoins expérimentaux, ou isoler davantage dans les populations cellulaires spécifiques individuelles par le tri cellulaire activé par fluorescence (Figure 1C).
- Resuspendez les myocytes ventriculaires isolés dans 2 mL de myocyte arrêt tampon 2 et appliquer 10 μL de suspension cellulaire sur l’hémocytomètre. Effectuez un dénombrement cellulaire de myocytes en forme de tige par champ.
- Réintroduction de Ca2+ à l’aide d’un paradigme stepwise
REMARQUE : Les étapes de réintroduction du calcium sont spécifiques pour les myocytes ventriculaires et ne devraient pas être effectuées pour les myocytes auriculaires, car cela entraînera la mort cellulaire.- Ajouter 50 μL de CaCl2 de 10 mM à la suspension ventriculaire des cellules myocytes. Bien mélanger et incuber pendant 4 min à température ambiante.
- Ajouter 50 μL supplémentaires de 10 mM CaCl2 à la suspension ventriculaire des cellules myocytes. Bien mélanger et incuber pendant 4 min à température ambiante.
- Ajouter 100 μL supplémentaires de 10 mM CaCl2 à la suspension ventriculaire des cellules myocytes. Bien mélanger et incuber pendant 4 min à température ambiante.
- Ajouter 80 μL de CaCl2 de 100 mM à la suspension ventriculaire des cellules myocytes. Bien mélanger et incuber pendant 4 min à température ambiante.
- Enlever le revêtement de laminine des plaques ou des toboggans et résuspendre les myocytes ventriculaires isolés dans un volume approprié de milieu de placage ventriculaire des myocytes selon les besoins expérimentaux (figure 1C).
REMARQUE : La densité typique de placage pour la culture à long terme décrite ici est 5 x 105 cellules/chambre sur les glissières en verre de quatre chambre (1.7 cm2). Évitez le placage à une densité supérieure à 75% de confluence, car la sur-densification cellulaire favorise l’agglutination cellulaire, inhibant ainsi l’attachement à la plaque. En outre, un grand nombre de cellules seront perdues au cours du premier changement moyen. Les cellules de plaque rapidement après isolement, comme ca2+ extracellulaire favorise l’hypercontraction et la perte des myocytes viables. - Permettre aux myocytes ventriculaires de se déposer et d’adhérer pendant au moins 1 h. Changez plus tard le milieu au myocyte ventriculaire maintenant le milieu complété avec 25 blebbistatin de μM.
REMARQUE : Les myocytes ventriculaires peuvent être cultivés jusqu’à 96 h après placage en μM blebbistatin. Des expériences devraient être menées dans le milieu de maintien ventriculaire de myocyte en l’absence de blebbistatin.
Representative Results
Un cœur de souris C57b6/j de type sauvage de 10 semaines donne généralement entre 75 000 et 150 000 myocytes auriculaires et 1,0−1,5 x 106 myocytes ventriculaires, ce qui se traduit par un rendement approximatif de 30 %−50 % pour les myocytes auriculaires et ventriculaires18,19. Pendant et immédiatement après les isolements, les myocytes cardiaques viables devraient apparaître en forme de tige et non contractants. Une majorité de myocytes cardiaques isolés devraient adapter cette morphologie, qui est une indication de perfusion efficace. La morphologie de la forme de la tige peut également être un prédicteur de la viabilité. Le protocole vise à améliorer le rendement et la viabilité des myocytes et des non-myocytes isolés d’un cœur de souris maladie. En outre, il a été testé dans un modèle d’insuffisance cardiaque induite par surcharge de pression (données non montrées).
Pour confirmer l’isolement adéquat et reproductible des myocytes et des non-myocytes du tissu auriculaire et ventriculaire, des cellules ont été observées et photographiées à divers jours en culture (figure 2). En outre, la réaction en chaîne quantitative de polymése de polymésie de reverse-transcription (qRT-PCR) a été exécutée pour mesurer les niveaux des transcriptions qui étaient type-spécifique de cellule. La troponine cardiaque T (Tnnt2) est un marqueur des myocytes cardiaques et a été solidement exprimée dans les cultures auriculaires et ventriculaires de myocyte cardiaque (figure 3A). En revanche, le peptide natriurétique auriculaire (Nppa, qui est typiquement exprimé exclusivement dans les myocytes cardiaques auriculaires adultes dans des conditions physiologiques) et la chaîne de lumière de myosine 2 (Myl2, qui est un gène spécifique de myocyte ventriculaire) ont été solidement et spécifiquement exprimés dans les cultures auriculaires et ventriculaires de myocyte cardiaque, respectivement (figure 3B,C).
Les marqueurs fibroblastes, le facteur de transcription 21 (Tcf21), le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes A (Pdgfra) et le groupe de marqueurs cellulaires dérivés des monocytes de différenciation 68 (Cd68) ont été exclusivement exprimés dans des cultures non myocytes isolées des chambres auriculaires et ventriculaires (figure 3D−F). On estime que les non-myocytes compromettent ~65% de toutes les cellules cardiaques et qu’une majorité d’entre elles proviennent d’une lignée fibroblaste ou dérivée demonocytes 18,19,23,24. Ainsi, les marqueurs de ces deux lignées ont été choisis pour être représentatifs, étant donné l’intérêt pour ces populations cellulaires dans les études de divers modèles et étiologies de la pathologie cardiaque.
L’immunostaining des AMAMs et des AMVMs pour le dihydropyridine de marqueur de t-tubule (DHPR, qui est un canal calcique voltage-dependent (L)-type) aussi bien que le récepteur de ryanodine (RYR2) a démontré des t-tubules intacts tout au long de l’isolement et de la culture à long terme (figure 4A,B). L’abondance de DHPR et la localisation qui était caractéristique et unique aux myocytes auriculaires et ventriculaires ont indiqué les présences des t-tubules. En outre, la colocalisation du DHPR avec immunostaining RYR2 était un indicateur des structures diad intactes. L’immunostaining pour la protéine sarcomeric alpha-actinin dans les myocytes cardiaques auriculaires et ventriculaires a eu comme conséquence le modèle sarcomeric prévu de striation. Le modèle de striation sarcomeric a été employé pour évaluer la pureté et la viabilité des myocytes cardiaques isolés en conjonction avec la forme morphologique rod-formée et la coloration nucléaire avec TOPRO-3(figure 4C,D; pourpre et rouge). Comme prévu, les myocytes cardiaques ventriculaires étaient grands, présentant une longueur moyenne d'~150 millimètres, tandis que les myocytes cardiaques auriculaires étaient en moyenne ~75 millimètres. En outre, sur l’analyse d’immunostaining, les myocytes cardiaques auriculaires (mais pas les myocytes cardiaques ventriculaires) ont exhibé l’expression robuste du peptide natriurétique auriculaire (ANP) dans un modèle de coloration qui était caractéristique de la localisation au réticulum endoplasmique et aux granules sécrétaires(figure 4C,D; vert).
Une caractéristique unique aux myocytes cardiaques auriculaires est sa classification en tant que cellule endocrinienne en plus de la cellule contractile. Alors que les myocytes auriculaires sécrètent l’ANP dans des conditions basales, la sécrétion augmente en réponse aux secretagogues (c.-à-d. l’agoniste alpha-adrénergique, la phényléphrine [PE]). En outre, les myocytes cardiaques auriculaires sécrètent anp et co-sécrétionally traiter une partie de l’hormone de son état précurseur (Pro-ANP, 15 kD) au peptide produit (ANP 3kD)16,17. Cette capacité sécrétaire peut être quantifiée par la détection immunoblot de l’ANP dans les médias des myocytes cardiaques auriculaires isolés en réponse au traitement aigu de PE (figure 4E). Cette capacité sécrétoire et de traitement du myocyte cardiaque atrial s’est trouvée sensible aux conditions de culturation. Ainsi, il est impératif que le milieu atrial de placage de myocyte soit complété avec la dexaméthasone, l’insuline, la transferrine, et le sélénium.
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de la perfusion cardiaque rétrograde, de la digestion et de l’isolement cellulaire. Montré sont les principales étapes impliquées dans l’isolement cellulaire à la fois des chambres auriculaires et ventriculaires simultanément à partir d’un seul cœur de souris. (A) Un seul cœur de souris est rapidement cannulé via l’aorte ascendante et perfusé d’une manière rétrograde. (B) Le cœur est séparé en tissus auriculaires et ventriculaires pour une digestion et une séparation physiques plus complètes. (C) Après une digestion adéquate, les cellules sont séparées par filtration par gravité en un total de quatre fractions cellulaires qui sont cultivés pour l’expérimentation ultérieure. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Analyse morphologique des myocytes cardiaques auriculaires et ventriculaires isolés et des non-myocytes en culture. (A) Myocytes auriculaires isolés de souris adultes (AMAMs), (B) souris adultes non myocytes auriculaires (AMANMs), (C) myocytes ventriculaires adultes de souris (AMVMs), ou (D) adultes ventriculaires non myocytes de souris (AMVNMs) ont été plaqués à 5 x 105 cellules/chambre sur des glissières en verre de quatre chambre (1,7 cm2)dans les supports plaqués respectifs. Des images de phase ont été obtenues à des jours indiqués dans la culture utilisant un objectif de 10x sous un microscope d’épifluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse représentative qRT-PCR des cultures cellulaires isolées. L’ARN a été extrait des myocytes cardiaques et des non-myocytes fraîchement isolés, et des niveaux d’ARNm pour des marqueurs génétiques spécifiques à la cellule ont été déterminés par qRT-PCR4. (A) Tnnt2, troponine du muscle cardiaque T (marqueur myocyte cardiaque); (B) Nppa, peptide natriurétique auriculaire (marqueur myocyte auriculaire); (C) Myl2, chaîne de lumière myosine 2 (marqueur myocyte ventriculaire); (D) Tcf21, facteur de transcription 21 (marqueur fibroblaste); (E) Pdgfra, récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes A (marqueur fibroblaste); (F) Cd68, groupe de différenciation 68 (marqueur cellulaire dérivé des monocytes). Les données représentent ± SEM (*p ≤ 0,05 différent de toutes les autres valeurs, tel que déterminé par ANOVA suivi de l’analyse post-hoc de Newman Keul). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse morphologique et fonctionnelle représentative des myoyctes cardiaques auriculaires et ventriculaires isolés. (A) AMAMs ou (B) AMVMs ont été plaqués à 5 x 105 cellules /chambre sur quatre-chambre (1.7 cm2) glissières en verre dans les médias de placage respectifs pendant 1 h pour permettre l’adhérence. Ceci a été suivi par la réalimentation des supports de placage auriculaire de myocyte ou le changement au myocyte ventriculaire maintenant les médias complétés avec la blebbistatin pour un 16 h additionnel. Les cultures ont ensuite été fixées puis immunotachées pour RYR2 (violet), DHPR (vert), et tache nucléaire TOPRO-3 (rouge). (C) AMAMs ou (D) AMVMs ont été isolés et plaqués, puis immunotachés pour a-actinin (violet), ANP (vert), et TOPRO-3 (rouge). Deux images représentatives pour chaque type de cellule sont affichées. (E) Les AMAMs ont été plaqués à 5 x 105 cellules/puits sur un plat de culture de puits de 12 pendant 16 h dans les médias atrials de placage de myocyte. Par la suite, les AMAMs ont été traités pendant 0,5 h avec le véhicule ou le sécréagogue anp (phényléphrine, 50 mM) avant que les médias ne soient recueillis et soumis à une analyse immunoblot pour la PNO. Avant l’analyse d’immunoblot, des échantillons de médias ont été centrifugés à 500 x g pendant 5 min pour enlever des débris cellulaires et s’assurer que l’ANP observé était le résultat de la sécrétion active des AMAMs. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
La qualité des cellules isolées à l’aide de la procédure décrite ici, telle que déterminée par le rendement cellulaire et la santé globale des cellules en culture, dépend de nombreux facteurs contrôlables. En commençant par la souris elle-même, il a été documenté que le stress imposé à l’animal peut affecter négativement le rendement cellulaire et la viabilité en culture, probablement en raison de l’excès de cortisol systémique, catécholamines, et l’état hypercontractile du tissucardiaque 2,5,7. Pour ces raisons, des mesures devraient être prises pour éviter d’alarmer l’animal avant le sacrifice. Ces mesures comprennent la couverture de la cage de l’animal et la limitation du temps en dehors du vivarium avant le sacrifice. L’héparine et de nombreux barbituriques couramment utilisés pour l’euthanasie peuvent affecter les voies de signalisation; ainsi, la méthode optimale d’euthanasie doit être personnalisée en conséquence. L’âge de l’animal a un impact considérable sur la qualité et la viabilité des cellules isolées, probablement en raison de l’accumulation progressive de fibrose interstitielle se produisant en même temps que le processus de vieillissement, qui peut affecter la digestion des tissus25. Dans les données non présentées ici, alors que la méthode décrite ci-dessus fonctionne chez des souris jusqu’à 78 semaines, la qualité des cellules était plus faible chez ces animaux plus âgés.
L’étape la plus critique dans le processus d’isolement décrit, ainsi que d’autres protocoles comportant un appareil de Langendorff pour la perfusion rétrograde, est la cannulation et la perfusion initiale du coeur. Pour des résultats optimaux, le temps de l’explantation cardiaque à la cannulation de l’aorte ascendante et l’initiation de la perfusion ne devrait pas prendre plus de 90 s. En plus du temps, deux autres facteurs importants sont la profondeur de la canule et la possibilité d’introduire des embolies d’air de l’appareil de perfusion. En conséquence, la canule doit être avancée dans l’aorte ascendante afin de ne pas entrer dans la racine aortique et obstruer la valve aortique, ce qui nuirait à la perfusion des vaisseaux coronaires.
Pendant le processus de digestion, il est important de tester régulièrement la rigidité du cœur pour éviter une exposition prolongée à l’enzyme digestive collagène, qui réduit la tolérance cardiaque au calcium des myocytes. Le protocole décrit ci-dessus pour la réintroduction de calcium dans les cultures ventriculaires isolées de myocyte a été conçu pour limiter la mort cardiaque de myocyte par l’afflux inapproprié de calcium par l’intermédiaire des canaux actionnés de calcium de magasin. Il convient de noter que la réintroduction stepwise de calcium ne devrait pas être exécutée pour les cultures atriales isolées de myocyte, car ceci favorisera la mort cellulaire pendant la culture à court et à long terme12. Pour plus de précaution, les tampons de perfusion et de digestion utilisés ici incluent l’inhibiteur de contraction cardiaque de muscle butanedione monoxime (BDM) pour éviter l’hypercontraction des myocytes isolés, aussi bien que le paradoxe de calcium, qui ont tous deux un impact sur la viabilité de myocyte26. Cependant, le passage de BDM à blebbistatin devrait être noté, car il est l’agent anti-contractile préféré en maintenant le média pour les myocytes cardiaques isolés. Dans les données non montrées, blebbistatin confère une plus grande viabilité pour la culture à long terme des myocytes cardiaques isolés.
Immédiatement après l’isolement, il est important de tenir compte des ramifications de la culture à long terme des cellules cardiaques, en particulier des myocytes. L’isolement cardiaque non myocyte et le protocole de culture décrits ici est basé sur des méthodes communes qui profitent des différentes densités et propriétés adhésives de différentes cellules cardiaques. L’avantage des non-myocytes est leur potentiel élevé d’expansion dans la culture ; ainsi, à la différence des myocytes cardiaques, ils peuvent passer pour la perpétuation. Cependant, il est connu que les conditions de culturisation, y compris la supplémentation moyenne avec FBS, peuvent affecter la fonctionnalité cardiaque de myocyte27. Les médias culturels décrits ici ont été conçus pour optimiser la viabilité et limiter les dérangements fonctionnels, en particulier pour les myocytes auriculaires isolés. Tandis qu’aucune capacité contractile altérée totale n’a été observée dans les myocytes cardiaques isolés après culture en l’absence de supplémentation de blebbistatin, les études qui se concentrent sur l’électrophysiologie, la contractilité, et d’autres signaux moléculaires in vivo-basés d’une seule cellule devraient être exécutées peu de temps après isolement, quand la structure sarcomeric et la signature moléculaire imitent toujours celle du coeur intact.
Une caractéristique caractéristique du myocyte atrial est sa capacité à travailler au clair de lune comme une cellule endocrinienne avec une immense capacité sécrétaire, en plus de leur fonction contractile. Dans des conditions physiologiques, les myocytes auriculaires produisent de grandes quantités d’ANP, qui est stockée dans le réticulum endoplasmique et dans de grands granules sécréoraux à noyau dense prêts pour l’exocytose réglée à la réception d’un stimulus16,17. Alors que de nombreuses études isolées sur les myocytes auriculaires se concentrent sur leurs propriétés électrophysiologiques uniques, il s’agit de la première étude à concevoir un média culturel. Cela permet une viabilité à long terme ainsi que la promotion des fonctions maintenues des propriétés endocriniennes et contractiles des myocytes auriculaires. Cette nouvelle méthode de culture, ainsi que l’isolement simultané de tous les types de cellules des chambres auriculaires et ventriculaires d’un seul cœur de souris, seront utiles et efficaces pour des études sur les propriétés physiologiques et pathophysiologiques des myocytes auriculaires et ventriculaires.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
E.A.B. a été soutenu par les National Institutes of Health (1F31HL140850), la Fondation ARCS, Inc., Section de San Diego, et est une Fondation de recherche Rees-Stealy Phillips Gausewitz, M.D. Scholar du SDSU Heart Institute. E.A.B. et A.S.B. ont été soutenus par la Fondation Inamori. La GCC accorde des subventions r01 HL135893, R01 HL141463 et HL149931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| 1 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti | 120142-1 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5-0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti | 130149 | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Scientific | C614-500 | |
| Carnitine hydrochloride | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| Collagenase type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| DMEM/F12 (1:1; 1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Dumont #7 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Epifluorescent micropscpe | Olympus X70 | IX70 | |
| Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Omega Scientific | FB-12 | Lot# 206018 |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Headband Magnifiers | Fine Science Tools | 28030-04 | |
| Hemacytometer (Bright-Line) | Hausser Scientific | 1475 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Inosine | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | Gibco | 51500-056 | |
| Isotemp 105 Water Bath | Fisher Scientific | NC0858659 | |
| Isotemp 3006 | Fisher Scientific | 13-874-182 | |
| Joklik Modified Minimum Essential Media | Sigma-Aldrich | M-0518 | |
| Laminin (Natural, Mouse) | Gibco | 1795024 | Lot# 1735572 |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump | Cole-Palmer | EW-77122-24 | |
| Minimum Essential Medium (MEM 1X) | Gibco | 12350-039 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 46-000-CM | |
| Pen Strep Glutamine (100X) | Gibco | 10378-016 | |
| Spring Scissors - 6mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T-8691 |
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