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Biology

एक वयस्क माउस हार्ट से एट्रियल मायोसाइट्स, वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स की एक साथ अलगाव और संस्कृति

Published: June 14, 2020 doi: 10.3791/61224
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1San Diego State University Heart Institute and the Department of Biology, San Diego State University

Summary

एक ही वयस्क माउस दिल के अटरिया और वेंट्रिकल्स दोनों से मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स के एक साथ अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप अत्यधिक व्यवहार्य कार्डियक मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स की लगातार पैदावार होती है और फेनोटाइपिंग और इन विट्रो विश्लेषण के लिए इष्टतम सेल-विशिष्ट संस्कृति की स्थिति का विवरण होता है।

Abstract

कार्डियक फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी की समझ को आगे बढ़ाने के लिए चूहों से कार्डियक मायोसाइट्स का अलगाव और खेती जरूरी रही है । जबकि नवजात माउस दिल से मायोसाइट्स को अलग करना अपेक्षाकृत सीधा है, वयस्क मुरीन दिल से मायोसाइट्स को पसंद किया जाता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि नवजात कोशिकाओं की तुलना में, वयस्क मायोसाइट्स अधिक सटीक रूप से कोशिका कार्य को फिर से रीकैपिटेट करते हैं क्योंकि यह वीवो में वयस्क हृदय में होताहै। हालांकि, आवश्यक मात्रा और व्यवहार्यता में वयस्क माउस कार्डियक मायोसाइट्स को अलग करना तकनीकी रूप से मुश्किल है, जो एक प्रयोगात्मक गतिरोध में योगदान देता है। इसके अलावा, प्रकाशित प्रक्रियाएं एट्रियल और वेंट्रिकुलर गैर-मायोसाइट कोशिकाओं की कीमत पर या तो एट्रियल या वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के अलगाव के लिए विशिष्ट हैं। यहां वर्णित एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट्स दोनों को अलग करने के लिए एक विस्तृत विधि है, साथ ही एट्रियल और वेंट्रिकुलर गैर-मायोसाइट्स के साथ, एक ही माउस दिल से। इसके अलावा प्रदान की इष्टतम सेल विशिष्ट संस्कृति विधियों के लिए विवरण हैं, जो सेल व्यवहार्यता और कार्य को बढ़ाते हैं। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य न केवल वयस्क मुरीन कार्डियक सेल अलगाव की प्रक्रिया में तेजी लानी है, बल्कि एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियक कोशिकाओं की जांच के लिए कोशिकाओं की उपज और व्यवहार्यता को भी बढ़ाना है।

Introduction

प्राथमिक कोशिका संस्कृति एक अभिन्न संसाधन है जो कार्डियक मायोसाइट फ़ंक्शन के विस्तृत मशीनी अध्ययन के लिए एक नियंत्रित वातावरण प्रदान करता है। उनकी अधिक टिकाऊ प्रकृति और अलगाव में आसानी के कारण, नवजात चूहा एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स ऐसी कोशिका संस्कृतियों का आम स्रोत रहा है1। हालांकि, वयस्क माउस एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स (एएमएएमएस और एएमवीएमएस) इन विट्रो अध्ययनों के लिए अत्यधिक वांछनीय हैं, क्योंकि उनकी आणविक और कार्यात्मक विशेषताएं वयस्क हृदय कोशिकाओं की बेहतर नकल करती हैं। इस प्रकार, वे हृदय रोगों से संबंधित अध्ययनों के लिए प्रासंगिक हो गए हैं, जिनमें से अधिकांश वयस्कों में विकसित होते हैं2।

इसके अलावा, ट्रांसजेनिक और रोग माउस मॉडल की उपलब्धता और उपयोग अलग वयस्क कार्डियक मायोसाइट्स की उपयोगिता का विस्तार करता है। लघु और दीर्घकालिक अध्ययनों के लिए माउस एएमवीएम के अलगाव और संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन पिछले कई प्रकाशनों2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11में किया गयाहै। इसकी तुलना में, AMAMs के अलगाव के लिए कुछ प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । इसके अलावा, जिन लोगों का वर्णन किया जाता है, वे मुख्य रूप से अलग-थलग कोशिकाओं के तीव्र अध्ययन के लिए अनुकूलित होते हैं, जिनमें11, 12, 13तारीख तक वर्णित कोईदीर्घकालिकसंस्कृति प्रोटोकॉल नहींहोताहै। जैसे, AMAM अलगाव प्रोटोकॉल को AMVMs के अलगाव और संस्कृति के लिए प्रकाशित प्रोटोकॉल की उपयोगिता और बहुमुखी प्रतिभा प्रदान करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया था। इसके अलावा, जबकि AMAMs और AMVMs के अलगाव के लिए अग्रणी अध्ययन संसाधन साबित कर दिया है, वहां इष्टतम समवर्ती अलगाव और दोनों AMAMs और AMVMs, जो प्रत्येक तैयारी के लिए पूरे दिल के कुशल उपयोग में परिणाम की संस्कृति के लिए कोई प्रोटोकॉल हैं ।

अब तक, प्रकाशित एएमएएम और एएमवीएम आइसोलेशन प्रोटोकॉल दोनों सेल प्रकारों के एक साथ अलगाव के लिए डिज़ाइन नहीं किए गए थे, क्योंकि एट्रियल और वेंट्रिकुलर फ़ंक्शन पर अधिकांश अध्ययनों में एक कक्ष-विशिष्ट ध्यान दिया गया है। उदाहरण के लिए, AMAMs मुख्य रूप से एट्रियल मायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, आंशिक रूप से एट्रियल फिब्रिलेशन (एएफ) में रुचि के कारण, अमेरिका में सबसे आम कार्डियक अतालता हालांकि, वायु सेना एक ऐसी बीमारी नहीं है जो अटरिया को अलग-थलग करने को प्रभावित करती है, और इसे हल्के से गंभीर बाएं वेंट्रिकुलर डिसफंक्शन14में एक कारक भूमिका के रूप में फंसाया गया है। इसके अलावा, संरक्षित इंजेक्शन अंश (एचएफपीईएफ) के साथ दिल की विफलता वाले रोगियों से इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम ने स्पष्ट किया है कि बाएं एट्रियल आकार दिल की विफलता15की संवेदनशीलता के लिए सबसे मजबूत भविष्यवक्ताओं में से एक है।

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और संकुचन में अपनी भूमिका के अलावा, एट्रियम एक एंडोक्राइन अंग भी है, जो कार्डियोकिन्स (यानी, एट्रियल नेट्रियाटिक पेप्टाइड [एएनपी] को स्रावित करता है जो होम्योपैथिक रूप से रक्तचाप और मात्रा16,17को विनियमित करता है। इसके अलावा, एएनपी (संभवतः एट्रियल मायोसाइट्स से) में वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स16, 17में एक प्रमुख सुरक्षात्मक और एंटी-हाइपरट्रोफिक भूमिका है। हालांकि विभिन्न रोग राज्यों में अटरिया और वेंट्रिकल्स के बीच न्यूरोहोर्मोनल संचार का एक मजबूत निहितार्थ है, इस संचार में अंतर्निहित तंत्र पूरी तरह से पता नहीं लगाया गया है । इस बिंदु को रोगग्रस्त हृदय में गैर-मायोसाइट्स (विशेष रूप से कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट और प्रतिरक्षा कोशिकाओं) की भूमिका और 2) पर ध्यान केंद्रित करते हुए अनुसंधान में वृद्धि से आगे उदाहरण दिया जाता है कि रोग के एक समारोह के रूप में कार्डियक रीमॉडलिंग सीधे कार्डियक मायोसाइट व्यवहार्यता और वैश्विक हृदय कार्य18,19,20,21,22को कैसे प्रभावित करता है। इस प्रकार, दोनों अटरिया और वेंट्रिकल्स से हृदय कोशिकाओं का अध्ययन हृदय रोग विज्ञान में अपनी भूमिकाओं की एक और अधिक पूरी तस्वीर हासिल करने के लिए एक आवश्यक दृष्टिकोण है ।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल शारीरिक और रोगविज्ञानी स्थितियों के तहत एक ही माउस दिल से एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स के एक साथ अलगाव का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, यह विधि एट्रियल कार्डियक मायोसाइट्स की संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए आवश्यक इष्टतम स्थितियों का वर्णन करने वाला पहला है, क्योंकि वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स की संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए स्थितियां पहले ही प्रकाशित की जा चुकी हैं।

Protocol

इस पत्र में सूचित चूहों पर किए गए सभी शोध की समीक्षा की गई है और एसडीएसयू संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है और यह राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुरूप है ।

1. अलगाव और संस्कृति मीडिया और चढ़ाना की तैयारी

  1. जोकलिक संशोधित न्यूनतम आवश्यक मीडिया (एमएमईएम) को बाँझ पानी के 1 एल में जोड़कर उपयोग करने से पहले दिल परफ्यूजन मीडिया के 1 एल तैयार करें। पीएच को 10 एन नाओएच के साथ 7.36 पर समायोजित करें, फिर 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: जोलिक एमएमईएम में 112 एमएमएम एनएसीएल, 5.4 एमएमएम केसीएल, 1 एमएमएम एमजीसीएल2,9 एमएमएम एनएएच2पीओ4और 11.1 एमएम डी-ग्लूकोज होते हैं। यह 10 mM HEPES (२.३८ जी/एल), 30 mm taurin (३.७५ ग्राम/एल), 2 mM डी-एल-कार्निटाइन (०.४ ग्राम/एल), 2 mm क्रिएटिन, और 10 m m butanedione मोनोक्सिम (१.०१ ग्राम/एल) के साथ पूरक है ।
  2. पर्फ्यूजन से ठीक पहले पाचन बफर तैयार करें, इस प्रकार: 100 एमएम सीएसीएल 2 के 6.25 माइक्रोन के साथ हृदय परफ्यूजन मीडिया के पूरक50 एमएल (चरण 1.3 देखें) और कोलेजनेस टाइप 2 (एंजाइमेटिक गतिविधि ~ 310-320 यू/एमजी डीडब्ल्यू)।
    नोट: बलिदान से पहले जानवर का वजन करें। पाचन बफर में पूरक कोलेजनेज टाइप 2 की मात्रा जानवर के वजन (शरीर के वजन के प्रति 1 ग्राम 2.25 मिलीग्राम कोलेजनेस प्रकार) से तय होती है।
  3. 100 एमसीएम सीएसीएल2तैयार करने के लिए, आणविक जीव विज्ञान ग्रेड पानी के 1.47 ग्राम सीएसीएल2 से 100 एमएल जोड़ें। भंग होने तक हिलाएं, फिर 0.2 माइक्रोन फिल्टर से गुजरें और 2 महीने तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  4. भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के 10 एमएल और 100 एमसीएम सीएसीएल 2 के 125 माइक्रोन के साथ हार्ट परफ्यूजन बफर के 90 एमएल के पूरक द्वारा मायोसिटे रोक बफर1तैयार करें। 0.2 माइक्रोन फिल्टर से गुजरें और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. एफबीएस के 6 एमएल और 10 एमएमएल सीएसीएल 2 के 150 माइक्रोन के साथ हार्ट परफ्यूजन बफर के 114 एमएल सप्लीमेंट करके माइकोसाइट रोक बफर2तैयार करें । 0.2 माइक्रोन फिल्टर से गुजरें और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. एफबीएस के 4 एमएल के साथ डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 95 एमएल, 100x पेन/स्ट्रेप-ग्लूटामाइन के 1 एमएल, 100x इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम के 1 एमएल और 10 μm dexamoneeth के 1 ml के साथ डल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के पूरक द्वारा पर्फ्यूजन से ठीक पहले एट्रियल मायोसाइट प्लेटिंग माध्यम तैयार करें। 0.2 माइक्रोन फिल्टर से गुजरें और चढ़ाना तक 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. एफबीएस के 4 एमएल के साथ मिनिमम एसेंशियल मीडियम (एमईएम) के 95 एमएल, 100x पेन/स्ट्रेप-ग्लूटामाइन के 1 मिलियन, 1 एम एचईपीईएस सॉल्यूशन की 10 एमएल, 100x इंसुलिन-ट्रांसफर-सेलेनियम की 1 मिलीलीटर और 01 ग्राम बुटानियन मोनोक्सीम के साथ सप्लीमेंट करके वेंट्रिकुलर मायोसिटेट प्लेटिंग मीडियम तैयार करें। 0.2 माइक्रोन फिल्टर से गुजरें और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. 100x इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम, 0.1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 1 एम एचईपीईएस सॉल्यूशन के 10 एमएल और 100x पेन/स्ट्रेपमाइन-ग्लूट के 1 मिलियन के साथ एमईएम के 99 एमएल को सप्लीमेंट करके वेंट्रिकुलर मायोसिटे को बनाए रखने का माध्यम तैयार करें। 0.2 माइक्रोन फिल्टर से गुजरें और 2 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. लैमिनिन-लेपित प्रायोगिक प्लेटें और स्लाइड तैयार करने के लिए, गल माउस लैमिनिन स्टॉक समाधान (1.19 मिलीग्राम/एमएल)। डीएमईएम के प्रत्येक 1 मिलियन के लिए लेमिनिन स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोन जोड़ें, और मिश्रण करें। कोट प्रयोगात्मक प्लेटें और स्लाइड समान रूप से और एक 37 डिग्री सेल्सियस में स्टोर, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर कम से कम 1 घंटे के लिए कम से कम 1 घंटे के लिए संतुलन के लिए अनुमति देने के लिए।
    नोट: लेपित प्रायोगिक प्लेटें और स्लाइड 2 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

2. आइसोलेशन उपकरण

  1. प्रत्येक अलगाव से पहले, बबल ट्रैप को शीर्ष पर भरकर 70% एटोह के तीन पूर्ण वॉश के साथ ट्यूबिंग और सिस्टम के अन्य घटकों को साफ करें (नीचे स्टॉपकॉक को बंद करें और शीर्ष स्टॉपकॉक को खुला रखें)।
  2. बबल ट्रैप को ऊपर से भरकर बाँझ एच2ओ के साथ पूरा सिस्टम 3x कुल्ला (नीचे स्टॉपकॉक को बंद करें और शीर्ष स्टॉपकॉक को खुला रखें)।
  3. दिल परफ्यूजन बफर के साथ पूरा सिस्टम कुल्ला और मीडिया के साथ आधे रास्ते बुलबुला जाल भरें।
  4. परिसंचारी जल स्नान को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
  5. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया के लिए एक पानी स्नान सेट करें।
  6. पेरिस्टाल्टिक पंप ट्यूबिंग में किसी भी हवा के बुलबुले निकालें।
  7. पेरिस्टाल्टिक पंप की प्रवाह दर को 3 एमएल/मिनट में समायोजित करें।

3. सर्जिकल प्रक्रिया (गैर-अस्तित्व)

  1. कम से कम 5 मिनट के लिए 70% EtOH में सर्जिकल उपकरणों सोख।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में दिल परफ्यूजन मीडिया, मायोसाइट रोक बफ़र्स, और पाचन बफर रखें।
  3. एट्रियल मायोसाइट प्लेटिंग माध्यम, वेंट्रिकुलर मायोसाइट प्लेटिंग माध्यम, और वेंट्रिकुलर मायोसाइट को 37 डिग्री सेल्सियस में बनाए रखने वाले माध्यम, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर 1 घंटे का उपयोग करने से पहले और कैप्स को ढीला करने के लिए समानीकरण की अनुमति दें।
  4. 10 सप्ताह पुराने पुरुष या महिला C57b6/j चूहों इंट्रापेरिटोनली (आईपी) के साथ ०.३५ मिलीएल हेपरिन, फॉस्फेट बफर खारा (PBS) में पतला १०० आईयू/एमएल के साथ इंजेक्ट करें । दवा को लगभग 10 मिनट तक प्रभावी होने दें।
    नोट: यदि दो दिलों को इस अलगाव प्रक्रिया के अधीन किया जाना है, तो दूसरे माउस को पहली प्रक्रिया में इस बिंदु पर एनेस्थेटाइज्ड और प्रशासित हेपरिन किया जा सकता है। जानवर पर तनाव को कम करने के लिए, एक हर्मेटिकली सीलबंद प्रेरण कक्ष में 2% आइसोफ्लुन/ऑक्सीजन मिश्रण का उपयोग करके प्रकाश संज्ञाहरण प्रशासित किया जा सकता है।
  5. एनेस्थेटाइज जानवर को 2% आइसोफफ्लोरैन/ऑक्सीजन मिश्रण के साथ और पेंटोबार्बिटल (10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक से 0.3 एमएल) के साथ इंजेक्ट करें, फिर 70% एटोह के साथ स्वैबिंग करके छाती तैयार करें।
  6. परफ्यूजन कैनुला के लिए दिल को लिगेट करने के लिए तैयार होने के लिए एक बंधे 5-0 रेशम सीवन तैयार करें। सर्जिकल माइक्रोस्कोप के ठीक बगल में माउंट कैनुला।
  7. जल्दी से पहले एक मिडलाइन त्वचा चीरा बनाने के द्वारा छाती खोलें, मध्य पेट से जबड़े तक, फिर बड़ी कैंची के साथ पेरिटोनम में प्रवेश करते हैं, डायाफ्राम को कुंद विच्छेदन से दूर करते हैं। फिर, दोनों पक्षों के पार्श्व पहलू पर छाती की दीवार को काटने के साथ कैंची का उपयोग कर रिब पिंजरे को काट दें।
  8. दिल और छाती की दीवार (थाइमस सहित) के बीच रेशेदार कनेक्शन को दूर करें। फिर, रिब पिंजरे को एक साथ काट लें। छोटे संदंश और कैंची का उपयोग करके, धीरे-धीरे शीर्ष द्वारा दिल को उठाएं और दिल के पीछे के पहलू को उजागर करें।
  9. आरोही महाधमनी पर इनोमिनेट धमनी से तुरंत कमतर विच्छेदन करके दिल को हटाएं और तुरंत दिल को बर्फ-ठंडे पीबीएस या ठंडे दिल परफ्यूजन मीडिया में रखें। इसके बाद, जल्दी से बर्फ ठंडे दिल परफ्यूजन मीडिया में explanted दिल से शेष ऊतक विच्छेदन, आरोही महाधमनी को उजागर ।
    नोट: यह एक शारीरिक मील का पत्थर के रूप में उपयोग करने के लिए बरकरार थाइमस के साथ दिल को छुड़ाना उपयोगी है ।
  10. सूक्ष्म विच्छेदन संदंश और कैंची का उपयोग कर अतिरिक्त ऊतक के महाधमनी आसपास के क्षेत्र को साफ करें। ठीक इत्तला दे दी संदंश का उपयोग कर कैनुला पर महाधमनी की स्थिति और एक 5-0 रेशम सीवन के साथ सुरक्षित ।
    नोट: सबसे अच्छा प्लेसमेंट आमतौर पर कैनुला पर लगभग 2 मिमी तक का विस्तार करने वाले महाधमनी के साथ होता है।
  11. 4 मिनट के लिए 3 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर दिल परफ्यूजन मीडिया के साथ cannulated दिल perfuse । फिर मीडिया को दिल के परफ्यूजन मीडिया से पाचन बफर में 15.0−17.5 मिनट के लिए स्विच करें(चित्रा 1A)।
    नोट: कोरोनरी प्रवाह दर की संभावना में वृद्धि होगी, प्रभावी ऊतक पाचन का संकेत (यानी, पीला, सूजन दिल) ।
  12. चरण 5.4 में बाद में उपयोग के लिए परफ्यूजन के अंतिम मिनट के दौरान पाचन बफर प्रवाह के 8 एमएल लीजिए।
  13. कैनुला से दिल निकालें और इसे 60 एमएम प्लास्टिक कल्चर डिश पर रखें। अतिरिक्त ऊतक (यानी, महाधमनी, नसों) को हटा दें और यांत्रिक पृथक्करण की तैयारी में पाचन बफर के 2.5 एमएल में दिल को जलमग्न कर दें।
    नोट: इस बिंदु पर, अटरिया को विच्छेदित कर दिया जाता है, और एक प्रयोगकर्ता को एट्रियल सेल आइसोलेशन प्रोटोकॉल का संचालन करना चाहिए, जबकि एक दूसरे प्रयोगकर्ता को वेंट्रिकुलर सेल अलगाव का संचालन करना चाहिए।

4. एट्रियल सेल अलगाव और संस्कृति

  1. अटरिया को दिल से दूर करें और इसे 30 एमएम प्लास्टिक कल्चर डिश में रखें। यांत्रिक पृथक्करण के लिए पाचन बफर के 0.75 एमएल में इसे जलमग्न करें। 60 मिमी डिश (चरण 3.12) में वेंट्रिकल रखें और अलग अलगाव विधियों को एक साथ ले जाएं (धारा 5, चित्रा 1B)।
    नोट: इस बिंदु पर, अटरिया और वेंट्रिकल्स आगे जुदाई से गुजरना कर सकते है वहां के लिए छोड़ दिया और सही पक्ष कोशिकाओं को अलग करने की जरूरत होनी चाहिए ।
  2. कीमा और अटरिया के अलावा चिढ़ाने के लिए शुरू, शुरू में ठीक टिप सर्जिकल कैंची के साथ और आगे कीमा के लिए ठीक संदंश के बाद । ऊतक आंदोलन से बचें, और तेजी से मांसपेशियों के तंतुओं को अलग न करें।
  3. बाँझ हस्तांतरण पिपेट टिप का उपयोग करके, धीरे-धीरे 15 मिनट के लिए ऊतक को मिलाने और अलग करना जारी रखें। हर 5 मिनट, एक 10x उद्देश्य ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत ऊतक से एट्रियल मायोसाइट असंबद्धता का निरीक्षण करें। के रूप में ऊतक आगे पचा हो जाता है, धीरे मिश्रण और एक छोटे ताकना आकार के साथ एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट टिप का उपयोग कर ऊतक dissociating जारी है ।
  4. 2 एमएल बाँझ माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस मायोसाइट के 0.75 एमएल के साथ 30 मिमी प्लेट कुल्ला बफर 1 को रोकते हुए और सेल निलंबन (अंत मात्रा = 1.5 एमएल) के साथ गठबंधन करें।
  5. एट्रियल मायोसाइट्स को कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा तलछट की अनुमति दें। धीरे से कोशिका निलंबन उत्तेजित करने के लिए शंकु नली के नीचे करने के लिए तलछट के लिए मायोसाइट्स के लिए अनुमति देने के लिए, एक दृश्य गोली बनाने ।
  6. 20 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन सेंट्रलाइज करें। ध्यान से सुपरनिटेंट को हटा दें, जिसमें गैर-मायोसाइट्स शामिल हैं, और एट्रियल मायोसाइट्स के गोली को परेशान किए बिना बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करके 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन शंकु नली में स्थानांतरित करें।
  7. 20,000 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए गैर-मायोसाइट अंश को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और डीएमईएम के 10 एमएल में गैर-मायोसाइट पेलेट को 10% भ्रूण बछड़े सीरम (एफसीएस) के साथ पुन: खर्च करें।
  8. हीमोसाइटोमीटर या अन्य विधि का उपयोग करके गैर-मायोसाइट्स की गणना करें, फिर प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार प्लेट करें, या फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई(चित्रा 1C)के माध्यम से व्यक्तिगत विशिष्ट सेल आबादी में आगे अलग-अलग हों।
  9. एट्रियल मायोसाइट प्लेटिंग माध्यम के 1 एमसीएल में चरण 4.6 से अलग एट्रियल मायोसाइट्स के पेलेट को फिर से रीसस्ट करें और इस निलंबन के 10 माइक्रोन को हीमोसाइटोमीटर पर लागू करें। प्रति क्षेत्र रॉड के आकार के मायोसाइट्स की सेल काउंट करें।
  10. प्रीकोटेड एक्सपेरिमेंटल प्लेट्स/स्लाइड्स से लेमिनिन को एएसपिरेट करें और 25 माइक्रोम ब्लेबिस्टटिन के साथ सप्लीमेंट एट्रियल मायोसाइट प्लेटिंग मीडियम की उचित मात्रा में अलग-अलग एट्रियल मायोसाइट्स को फिर से खर्च करें । प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुसार वांछित घनत्व पर प्लेट(चित्रा 1C)।
    नोट: यहां वर्णित दीर्घकालिक संस्कृति के लिए विशिष्ट चढ़ाना घनत्व चार कक्ष (1.7 सेमी2)ग्लास स्लाइड पर 5 x 105 कोशिकाओं/कक्ष है।

5. वेंट्रिकुलर सेल अलगाव और संस्कृति

  1. कीमा और दिल को चिढ़ाने के अलावा वेंट्रिकुलर ऊतक, पहले ठीक टिप सर्जिकल कैंची के साथ और आगे कीमा(चित्रा 1B)के लिए ठीक संदंश के बाद शुरू करो । मांसपेशियों के तंतुओं को तेजी से खींचकर ऊतक को उत्तेजित करने से बचें।
  2. सेल निलंबन को 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन शंकु नली में स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस मायोसाइट रोकने बफर 1 के 2.5 एमएल के साथ प्लेट कुल्ला और सेल निलंबन (अंत मात्रा = 5 एमएल) के साथ गठबंधन।
  3. बाँझ हस्तांतरण पिपेट टिप का उपयोग करके, धीरे-धीरे 4 मिनट के लिए ऊतक को मिलाना और अलग करना जारी रखें। स्लाइड पर इस सेल निलंबन के 10 माइक्रोन लागू करें और अलगाव की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए रॉड के आकार के मायोसाइट्स की उपस्थिति की कल्पना करें।
  4. 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन शंकु नली में 100 माइक्रोन बाँझ नायलॉन फिल्टर के माध्यम से सेल निलंबन पास करें। बाँझ नायलॉन फिल्टर से किसी भी शेष कोशिकाओं को धोने के लिए चरण 3.12 में एकत्र पाचन बफर के 2 एमएल का उपयोग करें।
  5. कमरे के तापमान पर 6 मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा तलछट के लिए वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स की अनुमति दें। धीरे-धीरे फ़िल्टर सेल निलंबन को उत्तेजित करें ताकि मायोसाइट्स को शंकु के तल पर तलछट करने की अनुमति दी जा सके, एक दृश्यमान गोली का गठन किया जा सके।
  6. वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के गोली को परेशान किए बिना, सुपरनैट (गैर-मायोसाइट्स) को सावधानीपूर्वक हटा दें और बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करके 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन शंकु नली में स्थानांतरित करें। 20,000 x ग्रामपर 5 मिनट के लिए गैर-मायोसाइट अंश को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और डीएमईएम के 10 एमएल में गैर-मायोसाइट पेलेट को 10% एफसीएस के साथ पुनः खर्च करें।
  7. 10% एफसीएस के साथ पूरक डीएमईएम की उचित मात्रा में हीमोसाइटोमीटर और रिसिपेंड का उपयोग करके गैर-मायोसाइट्स की गणना करें। फिर, प्रायोगिक जरूरतों के अनुसार प्लेट, या फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई(चित्रा 1C)के माध्यम से व्यक्तिगत विशिष्ट सेल आबादी में आगे अलग करें।
  8. माइलोट के 2 एमएल में अलग-अलग वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को फिर से खर्च करें बफर 2 को रोकें और हीमोसाइटोमीटर पर सेल सस्पेंशन के 10 माइक्रोन लगाएं। प्रति क्षेत्र रॉड के आकार के मायोसाइट्स की सेल काउंट करें।
  9. एक स्टेपवाइज प्रतिमान का उपयोग करके सीए2 + का पुनः परिचय
    नोट: कैल्शियम पुनर्परिचय कदम वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के लिए विशिष्ट हैं और एट्रियल मायोसाइट्स के लिए नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप सेल की मृत्यु होगी।
    1. वेंट्रिकुलर मायोसाइट सेल सस्पेंशन में 10 एमएमएल सीएसीएल2 के 50 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    2. वेंट्रिकुलर मायोसाइट सेल सस्पेंशन में 10 एमएम सीएसीएल2 का अतिरिक्त 50 माइक्रोल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    3. वेंट्रिकुलर मायोसाइट सेल सस्पेंशन में 10 एमएमएल सीएसीएल2 का अतिरिक्त 100 माइक्रोल जोड़ें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
    4. वेंट्रिकुलर मायोसाइट सेल सस्पेंशन में 100 एमएमएल सीएसीएल2 के 80 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 4 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें।
  10. प्लेटों या स्लाइड से लेमिनिन कोटिंग निकालें और प्रयोगात्मक जरूरतों(चित्रा 1C)के अनुसार वेंट्रिकुलर मायोसाइट प्लेटिंग माध्यम की उचित मात्रा में अलग-अलग वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को फिर से खर्च करें।
    नोट: यहां वर्णित दीर्घकालिक संस्कृति के लिए विशिष्ट चढ़ाना घनत्व चार कक्ष (1.7 सेमी2)ग्लास स्लाइड पर 5 x 105 कोशिकाओं/कक्ष है। 75% से अधिक की घनत्व पर चढ़ाना से बचें, क्योंकि सेलुलर ओवर-डेन्सिफिकेशन सेल झुरमुट को बढ़ावा देता है, जिससे प्लेट के लगाव को बाधित किया जाता है। इसके अलावा, पहले मध्यम परिवर्तन के दौरान बड़ी संख्या में कोशिकाएं खो जाएंगी । अलग-थलग पड़ने के बाद प्लेट कोशिकाएं जल्दी से, क्योंकि एक्सट्रासेलुलर सीए2 + हाइपरकंट्राक्शन और व्यवहार्य मायोसाइट्स की हानि को बढ़ावा देती है।
  11. वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को कम से कम 1 घंटे के लिए व्यवस्थित और पालन करने की अनुमति दें। बाद में मीडिया को 25 माइक्रोन ब्लेबिस्टाटिन के साथ मध्यम पूरक बनाए रखने के लिए वेंट्रिकुलर मायोसाइट में बदलें।
    नोट: μM blebbistatin में चढ़ाना के बाद वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स को 96 घंटे तक सुसंस्कृत किया जा सकता है। ब्लेबिस्टाटिन की अनुपस्थिति में वेंट्रिकुलर मायोसाइट बनाए रखने वाले माध्यम में प्रयोग किए जाने चाहिए।

Representative Results

एक वाइल्डटाइप 10 सप्ताह पुराने C57b6/j माउस दिल आम तौर पर 75,000−150,000 एट्रियल मायोसाइट्स और 1.0−1.5 x 10 6 वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के बीच परिणामदेता है, एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स 18,19के लिए 30%−50% की अनुमानित उपज के बराबर । अलगाव के दौरान और तुरंत बाद, व्यवहार्य हृदय मायोसाइट्स को रॉड के आकार और गैर-अनुबंध दिखाई देना चाहिए। अधिकांश अलग-अलग कार्डियक मायोसाइट्स को इस आकृति विज्ञान को अनुकूलित करना चाहिए, जो प्रभावी परफ्यूजन का संकेत है। रॉड-आकार आकृति विज्ञान भी व्यवहार्यता का कारक हो सकता है। प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक रोगग्रस्त माउस दिल से अलग मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स की उपज और व्यवहार्यता को बढ़ाना है। इसके अलावा, यह दबाव अधिभार प्रेरित दिल की विफलता (डेटा नहीं दिखाया गया है) के एक मॉडल में परीक्षण किया गया है ।

एट्रियल और वेंट्रिकुलर ऊतक से मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स के पर्याप्त और प्रतिकृति अलगाव की पुष्टि करने के लिए, संस्कृति में विभिन्न दिनों में कोशिकाओं को देखा गया और फोटो खिंचवाए गए(चित्रा 2)। इसके अतिरिक्त, मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) उन ट्रांसक्रिप्ट के स्तर को मापने के लिए किया गया था जो सेल प्रकार-विशिष्ट थे। कार्डियक मांसपेशी ट्रोपोनिन टी(Tnnt2)कार्डियक मायोसाइट्स का एक मार्कर है और इसे एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट संस्कृतियों(चित्रा 3 ए)दोनों में मजबूती से व्यक्त किया गया था। इसके विपरीत, एट्रियल नेट्रियेटिक पेप्टाइड(एनपीपीए,जो आमतौर पर शारीरिक परिस्थितियों में वयस्क एट्रियल कार्डियक मायोसाइट्स में विशेष रूप से व्यक्त किया जाता है) और मायोसिन लाइट चेन2 (Myl2,जो एक वेंट्रिकुलर मायोसाइट विशिष्ट जीन है) को क्रमशः क्रमशः एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट संस्कृतियों में मजबूती और विशेष रूप से व्यक्त किया गया था(चित्र 3बी, सी)।

फाइब्रोब्लास्ट मार्कर, ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर 21(टीसीएफ21),प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर ए(पीडीजीएफए)और भेदभाव 68(सीडी68)के मोनोसाइट-व्युत्पन्न सेल मार्कर क्लस्टर को विशेष रूप से गैर-मायोसाइट संस्कृतियों में व्यक्त किया गया था जो एट्रियल और वेंट्रिकुलर कक्षों(चित्रा 3डी−एफ)दोनों से अलग थे। यह अनुमान लगाया गया है कि गैर-मायोसाइट्स सभी हृदय कोशिकाओं के ~ 65% से समझौता करते हैं और इनमें से अधिकांश फाइब्रोब्लास्ट या मोनोसाइट-व्युत्पन्न वंश18,19,23, 24से उत्पन्न होते हैं। इस प्रकार, इन दो वंशों के लिए मार्कर को प्रतिनिधि चुना गया, विभिन्न मॉडलों और हृदय विकृति के इटियोलॉजी के अध्ययन में इन सेलुलर आबादी में रुचि को देखते हुए।

टी-ट्यूबल मार्कर डाइइड्रोपिरिडीन (डीएचपीआर, जो एक वोल्टेज-निर्भर (एल) प्रकार कैल्शियम चैनल है) के साथ-साथ रयानोडीन रिसेप्टर (RYR2) के लिए AMAMs और AMVMs के इम्यूनोस्टेटिंग ने अलगाव और दीर्घकालिक संस्कृति(चित्रा 4ए, बी)में बरकरार टी-ट्यूबल का प्रदर्शन किया । डीएचपीआर और स्थानीयकरण की बहुतायत जो एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स के लिए विशिष्ट और अद्वितीय थी, ने टी-ट्यूबल की उपस्थिति का संकेत दिया। इसके अलावा, RYR2 इम्यूनोस्टेपिंग के साथ डीएचपीआर का कोलोकैलाइजेशन अक्षुण्ण डायड संरचनाओं का संकेतक था। एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट्स में सारकोमेट्रिक प्रोटीन अल्फा-ऐक्टिन के लिए इम्यूनोस्टेटिंग के परिणामस्वरूप अपेक्षित सारकोमेट्रिक स्ट्रीशन पैटर्न हुआ। सरकोमेट्रिक स्ट्रीशन पैटर्न का उपयोग रॉड के आकार के रूपात्मक आकार और टोप्रो-3(चित्रा 4सी, डी,बैंगनी और लाल) के साथ परमाणु धुंधला के साथ अलग-थलग कार्डियक मायोसाइट्स की शुद्धता और व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए किया गया था। जैसा कि उम्मीद थी, वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट्स बड़े थे, जो ~ 150 मिमी की औसत लंबाई का प्रदर्शन करते थे, जबकि एट्रियल कार्डियक मायोसाइट्स का औसत ~ 75 मिमी था। इसके अलावा, इम्यूनोस्टेटिंग विश्लेषण पर, एट्रियल कार्डियक मायोसाइट्स (लेकिन वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट्स नहीं) ने एक धुंधला पैटर्न में एट्रियल नेट्रियूरेटिक पेप्टाइड (एएनपी) की मजबूत अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया जो एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और गुप्त कणिकाओं(चित्रा 4सी, डी,ग्रीन) के लिए स्थानीयकरण की विशेषता थी।

एट्रियल कार्डियक मायोसाइट्स के लिए अद्वितीय एक विशेषता अनुबंध कोशिका के अलावा एक एंडोक्राइन सेल के रूप में इसका वर्गीकरण है। जबकि एट्रियल मायोसाइट्स बेसल स्थितियों के तहत एएनपी को स्रावित करते हैं, स्राव गुप्त (यानी, अल्फा-एड्रेनेर्गिक एगोनिस्ट, फेनिलेफ्रीन [पीई]) के जवाब में बढ़ जाता है। इसके अलावा, एट्रियल कार्डियक मायोसाइट्स एएनपी को स्रावित करते हैं और हार्मोन के एक हिस्से को अपने अग्रदूत राज्य (प्रो-एएनपी, 15 केडी) से उत्पाद पेप्टाइड (एएनपी 3kD)16, 17तक सह-स्रावित करते हैं। इस गुप्त क्षमता को तीव्र पीई उपचार(चित्रा 4E)के जवाब में अलग-थलग एट्रियल कार्डियक मायोसाइट्स के मीडिया में एएनपी के इम्यूनोब्लॉट डिटेक्शन के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता है। एट्रियल कार्डियक मायोसाइट की यह गुप्त और प्रसंस्करण क्षमता खेती की स्थिति के प्रति संवेदनशील पाई गई। इस प्रकार, यह जरूरी है कि एट्रियल मायोसाइट प्लेटिंग माध्यम डेक्सामेथासोन, इंसुलिन, ट्रांसफरिन और सेलेनियम के साथ पूरक हो।

Figure 1
चित्रा 1: प्रतिगामी हृदय परफ्यूजन, पाचन और कोशिका अलगाव का योजनाबद्ध अवलोकन। दिखाया मुख्य दोनों अलिंद और वेंट्रिकुलर कक्षों से एक ही माउस दिल से एक साथ सेल अलगाव में शामिल कदम हैं । (क)आरोही महाधमनी के माध्यम से एक एकल माउस दिल तेजी से कैनलेटेड होता है और प्रतिगामी तरीके से परफ्यूज किया जाता है। (ख)आगे पाचन और शारीरिक अलगाव के लिए दिल को एट्रियल और वेंट्रिकुलर ऊतकों में अलग कर दिया जाता है । (ग)पर्याप्त पाचन के बाद, कोशिकाओं को गुरुत्वाकर्षण निस्पंदन के माध्यम से कुल चार सेलुलर अंशों में अलग किया जाता है जो बाद के प्रयोग के लिए सुसंस्कृत होते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: संस्कृति में अलग-थलग एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट्स और गैर-मायोसाइट्स का रूपात्मक विश्लेषण। (A)अलग वयस्क माउस एट्रियल मायोसाइट्स (एएमएएम),(बी)वयस्क माउस एट्रियल नॉन-मायोसाइट्स (एएमएमएस),(सी)वयस्क माउस वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स (एएमवीएमएस), या(डी)वयस्क माउस वेंट्रिकुलर नॉन-मायोसाइट्स (एएमवीएनएमएस) को संबंधित प्लेटेड मीडिया में चार-कक्ष(1.7 सेमी2)ग्लास स्लाइड पर 5 x 10 5 कोशिकाओं/कक्ष पर चढ़ाया गया था। एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत 10x उद्देश्य का उपयोग करके संस्कृति में इंगित दिनों में चरण छवियां प्राप्त की गई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: अलग सेल संस्कृतियों के प्रतिनिधि qRT-पीसीआर विश्लेषण। आरएनए को हौसले से अलग कार्डियक मायोसाइट्स और नॉन-मायोसाइट्स से निकाला गया था, और सेल-स्पेसिफिक जीन मार्कर के लिए एमआरएनए का स्तर क्यूआरटी-पीसीआर4द्वारा निर्धारित किया गया था । (A) Tnnt2,कार्डियक मांसपेशी ट्रोपोनिन टी (कार्डियक मायोसाइट मार्कर); (ख) एनपीपीए,एट्रियल नेट्रिय्योरेटिक पेप्टाइड (एट्रियल मायोसाइट मार्कर); (ग) Myl2,मायोसिन लाइट चेन 2 (वेंट्रिकुलर मायोसाइट मार्कर); (घ) TCf21,प्रतिलेखन कारक 21 (फाइब्रोब्लास्ट मार्कर); (ई) पीडीजीफ्रा,प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारक रिसेप्टर ए (फाइब्रोब्लास्ट मार्कर); (एफ) सीडी 68,विभेदन 68 का क्लस्टर (मोनोसाइट-व्युत्पन्न सेल मार्कर)। डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं ± एसईएम (*p ≤ 0.05 अन्य सभी मूल्यों से अलग है, जैसा कि न्यूमैन केउल के पोस्ट-हॉक विश्लेषण के बाद एवं नवीन द्वारा निर्धारित किया गया है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: अलग एट्रियल और वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोयक्ट्स के प्रतिनिधि रूपात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण। (A)AMAMs या(B)AMVMs 5 x 105 कोशिकाओं/कक्ष पर चार कक्ष पर चढ़ाया गया (१.७ सेमी2)कांच की स्लाइड संबंधित चढ़ाना मीडिया में 1 घंटे के लिए आसंजन के लिए अनुमति देने के लिए । इसके बाद या तो एट्रियल मायोसाइट प्लेटिंग मीडिया को फिर से रीफीडिंग किया गया या एक अतिरिक्त 16 एच के लिए ब्लेबिस्टिन के साथ पूरक मीडिया को बनाए रखने वाले वेंट्रिकुलर मायोसाइट में बदल दिया गया। संस्कृतियों को बाद में RYR2 (बैंगनी), DHPR (ग्रीन), और परमाणु दाग TOPRO-3 (लाल) के लिए इम्यूनो दाग तय किया गया । (ग)एएमएम या(डी)एएमवीएम को अलग-थलग और चढ़ाया गया, फिर ए-ऐक्टिनिन (बैंगनी), एएनपी (हरा), और टोप्रो-3 (लाल) के लिए इम्यूनोडाड झंडों से सना हुआ था । दिखाया गया है प्रत्येक सेल प्रकार के लिए दो प्रतिनिधि छवियां हैं। (ई)AMAMs 5 x 105 कोशिकाओं पर चढ़ाया गया/अच्छी तरह से अलिंद myocyte चढ़ाना मीडिया में 16 घंटे के लिए एक 12 अच्छी तरह से संस्कृति पकवान पर । AMAMs बाद में वाहन या एएनपी गुप्त (फेनिलेफ्रीन, 50 mM) के साथ 0.5 घंटे के लिए इलाज किया गया इससे पहले कि मीडिया एकत्र किया गया और एएनपी के लिए इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के अधीन था। इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण से पहले, मीडिया के नमूनों को सेलुलर मलबे को हटाने और यह सुनिश्चित करने के लिए 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्री किया गया था कि मनाया गया एएनपी AMAMs से सक्रिय स्राव का परिणाम था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके अलग कोशिकाओं की गुणवत्ता, जैसा कि कोशिका उपज और संस्कृति में कोशिकाओं के समग्र स्वास्थ्य द्वारा निर्धारित किया जाता है, कई नियंत्रणीय कारकों पर निर्भर करता है। माउस से ही शुरू, यह प्रलेखित किया गया है कि जानवर पर लगाया गया तनाव संस्कृति में कोशिका उपज और व्यवहार्यता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है, संभवतः अतिरिक्त प्रणालीगत कोर्टिसोल, कैटेकोलामिन,और कार्डियक ऊतक2,5,7की हाइपरकॉन्टाइल स्थिति के कारण। इन कारणों से बलि देने से पहले जानवर को चिंताजनक ढंग से न करने के उपाय किए जाने चाहिए। इस तरह के उपायों में जानवर के पिंजरे को कवर करना और बलिदान से पहले विवारियम के बाहर समय सीमित करना शामिल है । आमतौर पर इच्छामृत्यु के लिए उपयोग किए जाने वाले हेपरिन और कई बार्बिटुरेट्स सिग्नलिंग रास्तों को प्रभावित कर सकते हैं; इस प्रकार, इच्छामृत्यु की इष्टतम विधि तदनुसार अनुकूलित की जानी चाहिए। जानवर की उम्र का अलग-थलग कोशिकाओं की गुणवत्ता और व्यवहार्यता पर काफी प्रभाव पड़ता है, जो उम्र बढ़ने की प्रक्रिया के साथ समवर्ती रूप से होने वाले इंटरस्टिटियल फाइब्रोसिस के प्रगतिशील संचय के कारण सबसे अधिक संभावना है, जो ऊतक पाचन25को प्रभावित कर सकता है। यहां प्रस्तुत नहीं किए गए आंकड़ों में, जबकि ऊपर वर्णित विधि 78 सप्ताह तक के चूहों में काम करती है, कोशिकाओं की गुणवत्ता इन पुराने जानवरों में कम थी।

वर्णित अलगाव प्रक्रिया में सबसे महत्वपूर्ण कदम, साथ ही प्रतिगामी परफ्यूजन के लिए लैंगेंडोर्फ उपकरण की विशेषता वाले अन्य प्रोटोकॉल, दिल का कैनुलेशन और प्रारंभिक पर्फ्यूजन है। इष्टतम परिणामों के लिए, आरोही महाधमनी के कैनुलेशन और परफ्यूजन की दीक्षा के लिए हृदय उन्मूलन से समय 90 एस से अधिक नहीं लेना चाहिए। समय के अलावा, दो अतिरिक्त महत्वपूर्ण कारक कैनुला की गहराई और परफ्यूजन उपकरण से हवा एम्बोली शुरू करने की संभावना हैं। तदनुसार, कैनुला को आरोही महाधमनी में उन्नत किया जाना चाहिए ताकि महाधमनी जड़ में प्रवेश न किया जा सके और महाधमनी वाल्व में बाधा उत्पन्न न हो, जो कोरोनरी जहाजों के परफ्यूजन को ख़राब कर देगा।

पाचन प्रक्रिया के दौरान, पाचन एंजाइम कोलेजनाज के लंबे समय तक संपर्क में रहने से बचने के लिए दिल की कठोरता का नियमित रूप से परीक्षण करना महत्वपूर्ण है, जो कार्डियक मायोसाइट कैल्शियम सहिष्णुता को कम करता है। अलग वेंट्रिकुलर मायोसिटे संस्कृतियों में कैल्शियम पुनर्परिचय के लिए ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल स्टोर संचालित कैल्शियम चैनलों के माध्यम से अनुचित कैल्शियम प्रवाह के माध्यम से कार्डियक मायोसाइट मौत को सीमित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पछताया कैल्शियम पुनर्परिचय अलग अलिंद मायोसाइट संस्कृतियों के लिए नहीं किया जाना चाहिए, क्योंकि यह लघु और दीर्घकालिक संस्कृति12के दौरान सेल मृत्यु को बढ़ावा देगा। आगे की सावधानी के लिए, यहां उपयोग किए जाने वाले परफ्यूजन और पाचन बफ़र्स में कार्डियक मांसपेशी संकुचन अवरोधक ब्यूटेनेडिएक मोनोक्सीम (बीडीएम) शामिल हैं ताकि अलग-थलग मायोसाइट्स के हाइपरकंट्राशेक्शन से बचा जा सके, साथ ही कैल्शियम विरोधाभास, दोनों ही प्रभाव मायोसाइट व्यवहार्यता26। हालांकि, बीडीएम से ब्लेबिस्टिन में स्विच को नोट किया जाना चाहिए, क्योंकि यह अलग-थलग कार्डियक मायोसाइट्स के लिए मीडिया को बनाए रखने में पसंदीदा एंटी-कॉन्ट्रैक्टाइल एजेंट है। दिखाए गए आंकड़ों में, ब्लेबिस्टिन अलग-थलग कार्डियक मायोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अधिक व्यवहार्यता प्रदान करता है।

अलगाव के तुरंत बाद, हृदय कोशिकाओं, विशेष रूप से मायोसाइट्स की दीर्घकालिक संस्कृति के असर पर विचार करना महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित कार्डियक नॉन-मायोसाइट आइसोलेशन एंड कल्टिंग प्रोटोकॉल सामान्य तरीकों पर आधारित है जो विभिन्न हृदय कोशिकाओं के विभिन्न घनत्व और चिपकने वाले गुणों का लाभ उठाते हैं। गैर-मायोसाइट्स का लाभ संस्कृति में उनकी उच्च विस्तार क्षमता है; इस प्रकार, कार्डियक मायोसाइट्स के विपरीत, वे स्थायीकरण के लिए पासिंग करने के लिए उत्तरदायी हैं। हालांकि, यह ज्ञात है कि एफबीएस के साथ मध्यम पूरकता सहित खेती की स्थिति, कार्डियक मायोसाइट कार्यक्षमता27को प्रभावित कर सकती है। यहां वर्णित संस्कृति मीडिया को व्यवहार्यता को अनुकूलित करने और कार्यात्मक derangements को सीमित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, विशेष रूप से अलग अलिंद मायोसाइट्स के लिए। जबकि ब्लेबिस्टिन पूरकता के अभाव में संस्कृति के बाद अलग-अलग कार्डियक मायोसाइट्स में कोई खुलकर बिगड़ा संकुचन क्षमता नहीं देखी गई थी, अध्ययन जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, संकुचन पर ध्यान केंद्रित करते हैं, और वीवो-आधारित आणविक सिग्नलिंग में अन्य एकल-कोशिका को अलगाव के तुरंत बाद किया जाना चाहिए, जब सारकोमीरिक संरचना और आणविक हस्ताक्षर अभी भी दिल की नकल करता है।

एट्रियल मायोसाइट की एक बानगी विशेषता उनके संकुचन समारोह के अलावा, अपार गुप्त क्षमता के साथ एक अंतःस्रावी कोशिका के रूप में चांदनी करने की क्षमता है। शारीरिक परिस्थितियों में, एट्रियल मायोसाइट्स बड़ी मात्रा में एएनपी का उत्पादन करते हैं, जो एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में संग्रहित होता है और बड़े घने-कोर स्रावित कणिकाओं में उत्तेजना16,17प्राप्त करने पर विनियमित एक्सोसाइटोसिस के लिए तैयार होता है। जबकि कई अलग-अलग एट्रियल मायोसाइट अध्ययन उनके अद्वितीय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, यह संस्कृति मीडिया डिजाइन करने वाला पहला अध्ययन है। यह दीर्घकालिक व्यवहार्यता के साथ-साथ अलिंद मायोसाइट्स के एंडोक्राइन और संकुचन गुणों के बनाए गए कार्यों को बढ़ावा देने की अनुमति देता है। खेती के लिए यह उपन्यास विधि, साथ ही एक ही माउस दिल से एट्रियल और वेंट्रिकुलर कक्षों से सभी कोशिका प्रकारों का एक साथ अलगाव, एट्रियल और वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स दोनों के शारीरिक और रोगविज्ञानी गुणों पर अध्ययन के लिए उपयोगी और प्रभावोत्पादक होगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

ईए.B को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (1F31HL140850), एआरसीएस फाउंडेशन, इंक, सैन डिएगो अध्याय द्वारा समर्थित किया गया था, और एक रीस-चुरा रिसर्च फाउंडेशन फिलिप्स गॉसेविट्ज, एसडीएसयू हार्ट इंस्टीट्यूट के एमडी स्कॉलर हैं। ईए.B और एएस .B को इनमोरी फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था। CCG द्वारा (NIH) अनुदान R01 HL135893, R01 HL141463 और HL149931 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(-)-Blebbistatin Sigma-Aldrich B0560
1 Liter Water Jacketed Reservoir Radnoti 120142-1
2,3-Butanedione monoxime Sigma-Aldrich B0753
5-0 Silk Suture Thread Fine Science Tools 18020-50
Adenosine Sigma-Aldrich A9251
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A6003
Bubble Trap Compliance Chamber Radnoti 130149
Calcium Chloride Anhydrous Fisher Scientific C614-500
Carnitine hydrochloride Sigma-Aldrich C9500
Collagenase type 2 Worthington Biochemical Corporation LS004176
Creatine Sigma-Aldrich C0780
Dexamethasone Sigma-Aldrich D2915
DMEM/F12 (1:1; 1X) Gibco 11330-032
Dumont #7 - Fine Forceps Fine Science Tools 11274-20
Epifluorescent micropscpe Olympus X70 IX70
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) Omega Scientific FB-12 Lot# 206018
Fine Scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-09
Graefe Forceps Fine Science Tools 11051-10
Headband Magnifiers Fine Science Tools 28030-04
Hemacytometer (Bright-Line) Hausser Scientific 1475
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Inosine Sigma-Aldrich I4125
Insulin-Transferrin-Selenium-X Gibco 51500-056
Isotemp 105 Water Bath Fisher Scientific NC0858659
Isotemp 3006 Fisher Scientific 13-874-182
Joklik Modified Minimum Essential Media Sigma-Aldrich M-0518
Laminin (Natural, Mouse) Gibco 1795024 Lot# 1735572
L-Glutamine Sigma-Aldrich G8540
Masterflex C/L Single-Channel Variable-Speed Compact Pump Cole-Palmer EW-77122-24
Minimum Essential Medium (MEM 1X) Gibco 12350-039
Molecular Biology Grade Water Corning 46-000-CM
Pen Strep Glutamine (100X) Gibco 10378-016
Spring Scissors - 6mm Cutting Edge Fine Science Tools 15020-15
Taurine Sigma-Aldrich T-8691

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References

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Blackwood, E. A., Bilal, A. S.,… More

Blackwood, E. A., Bilal, A. S., Azizi, K., Sarakki, A., Glembotski, C. C. Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart. J. Vis. Exp. (160), e61224, doi:10.3791/61224 (2020).

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