Summary
Dette papiret rapporterer at tillegg av Y-27632 til TIVA medium kan øke utbyttet av melanocytter fra voksen hudvev.
Abstract
Isolasjonen og kulturen til primære melanocytter fra hudvev er svært viktig for biologisk forskning og har vært mye brukt til kliniske applikasjoner. Isolere primære melanocytter fra hudvev ved den konvensjonelle metoden tar vanligvis ca 3 til 4 uker å passere tilstrekkelig. Enda viktigere, vevet som brukes er vanligvis nyfødte forhuder, og det er fortsatt en utfordring å effektivt isolere primære melanocytter fra voksent vev. Vi har nylig utviklet en ny isolasjonsmetode for melanocytter som legger Y-27632, en Rho kinase hemmer, til det første kulturmediet i 48 h. Sammenlignet med den konvensjonelle protokollen, øker denne nye metoden dramatisk utbyttet av melanocytter og forkorter tiden som kreves for å isolere melanocytter fra forhudsvev. Vi beskriver nå denne nye metoden mer detaljert ved hjelp av voksen epidermis for å effektivt kultur primære melanocytter. Viktigere viser vi at melanocytter hentet fra voksent vev utarbeidet av denne nye metoden kan fungere normalt. Denne nye protokollen vil betydelig nytte studier av pigmentering defekter og melanomer ved hjelp av primære melanocytter utarbeidet fra lett tilgjengelig voksen hud vev.
Introduction
Målet med denne studien var å utvikle en enkel og effektiv protokoll for å isolere melanocytter fra epidermis av voksen hud for biologisk forskning og kliniske applikasjoner. Melanocytter, som ligger i basal epidermis i huden og i hårsekkene, spiller en viktig rolle i pigmentering av hud og hår ved å produsere melanin1. Den resulterende hudpigmentering fra epidermale melanocytter fungerer som et ultrafiolett strålingsfilter som reduserer/forhindrer DNA-skade på underliggende celler i huden2. Unormal spredning av melanocytter i huden er ganske vanlig, for eksempel i dannelsen av godartede nevi (mol) der melanocytter potensielt forvandles til onkogen vekst etterfulgt av cellulær senescence3.
Siden 1957 har isolasjonen og den påfølgende kulturen av humane primære melanocytter vært mulig4, men bare siden 1982 har det vært en effektiv metode som kan reproduserende etablere kulturer av menneskelige melanocytter fra epidermis5. Den konvensjonelle metoden for å isolere primære melanocytter fra epidermis innebærer en to-trinns enzymatisk fordøyelse. Kort, huden er i utgangspunktet fordøyd med dispase å skille epidermis fra dermis, hvoretter epidermis er fordøyd med trypsin å produsere suspensjoner som inneholder melanocytter og keratinocytter, som deretter kan selektivt dyrkes i forskjellige medier. For tiden tar den første kulturen vanligvis ca 3 til 4 uker for melanocytter for å nå samløpet ved hjelp av den konvensjonelle metoden, noe som sannsynligvis skyldes den lave effektiviteten av isolasjonen. Derfor, øke den første produksjonen av melanocytter fra voksen hud vev ville være ganske nyttig for både laboratorieforskning og kliniske applikasjoner.
Mange vekstfaktorer, hvorav de fleste har vist seg å være utskilt av keratinocytter (f.eks. α-MSH, ACTH, bFGF, NGF, ET-1, GM-CSF, HGF, LIF og SCF)5-8, regulere differensiering og spredning av pattedyr melancytter. I fravær av materlag fører mangelen på disse vekstfaktorene til redusert spredning av melanocytter og deres økte apoptose9. Co-kulturen av keratinocytter som mater celler og melanocytter kan føre til akselerert melanocytt spredning og redusert apoptose. Imidlertid krever co-kultur metoden ikke bare mer hudvev for å forberede keratinocytter, som ikke er praktisk, men heller ikke kunne fungere effektivt fordi kulturforholdene som kreves av melanocytter ikke favoriserer keratinocyttvekst, og omvendt.
Tidligere studier har rapportert at tillegg av Y-27632, en ROCK-hemmer, inn i vekstmediet kan forbedre utbyttet av menneskelige primære epidermale celler fra hudvev10-14. Derfor ville det være interessant å teste om isolering av menneskelige primære melanocytter ville ha nytte av tilstedeværelsen av Y-27632. Faktisk, tillegg av Y-27632 i inokulasjonen TIVA medium15, som inneholder TPA, IBMX, Na3VO4 og dbcAMP, betydelig økt utbyttet av primære melanocytter isolert fra forhudsvev i de første kulturer16. Sammenlignet med den konvensjonelle protokollen, er denne nye protokollen betydelig mer effektiv i å øke utbyttet av melanocytter16. Derfor beskriver denne protokollen den nye metoden i detalj ved hjelp av voksent hudvev basert på en tidligere studie16 for å fremme anvendelsen i grunnleggende og anvendt biologisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruken av voksent forhudsvev i denne protokollen er godkjent av Human Research Ethics Committee (nr. 2015120401, dato: 12. mai 2015).
MERK: Utfør alle følgende prosedyrer i et sterilt miljø for å forhindre kontaminering av celler og kulturer.
1. Forberedelser
- Samle fersk voksen forhud vev fra omskjæring operasjoner i 15 ml rør som inneholder 10 ml fosfat buffer saltvann (PBS) og lagre i 4 °C.
MERK: Skill vevet som beskrevet nedenfor innen 24 timer etter utskjæringen. - Forbered reagenser og kulturmedium.
- Forbered 3 % P/S (penicillin/streptomycin) som vaskeoppløsning. Bland 50 ml PBS med 1,5 ml penicillin (100 E/ml) og streptomycin (100 mg/l) (P/S).
- Forbered avslutningsløsningen (nøytraliseringsløsning) for nøytralisering av enzymatisk fordøyelse. Supplere 1% P / S, 10% foster storfe serum (FBS) i DMEM medium.
- Forbered TIVA medium til kultur melanocytter: Ham's F12; 10% FBS; 1x P/S/glutamin; 50 ng/ml 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetat (TPA); 1 x 10-4 M 3-isobutyl-1-metyl xanthine (IBMX); 1 μM Na3VO4; 1 x 10-3 M N-6,2′-O-dibutyryladenosine-3′,5′-syklisk monofosfat (dbcAMP).
2. Den konvensjonelle metoden
- Forbehandling av hudvev
- Skyll hvert voksent forhudsvev én gang med 10 ml 75 % etanol (alkohol) i 30 s, og skyll deretter to ganger med 10 ml vaskeoppløsning (3 % P/S), i 5 min hver.
MERK: Vask forhudsvev med 10 ml PBS i begynnelsen hvis det er mye blod. Alle vasker er tilberedt i 100 mm cellekulturretter. - Skrap hvert forhudsvev med et kirurgisk blad for å fjerne subkutan fettvev og løse bindevev i dekselet på en 100 mm cellekulturrett.
MERK: Bruk en skalpell til å skrape fettlagene bort til bare den tynne epidermis og tett dermis forblir. - Overfør hver voksen forhud til en annen 100 mm kulturrett med dermis-siden ned.
MERK: Skjær hvert voksenforhudsvev i 3-4 mm brede strimler ved hjelp av et skalpellblad for å få despase til å fungere mer effektivt. - Tilsett 2,5 mg/ml dispase til hver 100 mm kulturrett med voksent forhudsvev og inkuber i 16 til 20 timer ved 4 °C.
MERK: Hvert gram vev fordøyes med 10 ml dispaseløsning.
- Skyll hvert voksent forhudsvev én gang med 10 ml 75 % etanol (alkohol) i 30 s, og skyll deretter to ganger med 10 ml vaskeoppløsning (3 % P/S), i 5 min hver.
- Separasjon av epidermis fra voksen forhudsvev
- Etter fordøyelsen i 16 til 20 timer, skille epidermis fra dermis ved hjelp av pinsett. Ta tak i den ene siden av den dermale kanten av vevet med en pinsett og tilsvarende posisjon av epidermaldelen med en annen pinsett og forsiktig skrelle av epidermis.
- Vask epidermis 3x med vaskeløsning (3% P / S), og overfør deretter epidermis til et rør.
- Senk epidermis ved å tilsette 5 ml 0,05 % trypsin i røret og inkubere i et vannbad i 30 min ved 37 °C.
MERK: Rist røret for å sikre at epidermis er helt nedsenket før inkubasjon.
- Samling og kultur av primærceller
- Legg til et likt volum av avslutningsløsning (10 % FBS, 1 % P/S i DMEM) for å nøytralisere trypsin og pipette løsningen opp og ned 10-15 ganger for å skille epidermale celler.
- Før cellefjæringen i et nytt 50 ml rør gjennom et 100 μm nettingfilter for å fjerne rusk.
- Sentrifuge ved 200 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og tilsett 10 ml inokulasjon TIVA medium for å resuspepend cellene.
- Frø de resuspended cellene i en 100 mm kulturrett.
- Kultur i en 37° C inkubator med 5% CO2.
- Endre mediet annenhver dag.
- Passasjeceller når de når 80% samløpet.
3. Den nye metoden
MERK: Prosedyren for vevsforberedelse og fordøyelse i den nye metoden er den samme som beskrevet ovenfor for den konvensjonelle metoden, den eneste forskjellen er at de isolerte friske cellene er resuspended i 10 ml TIVA medium som inneholder 10 μM Y-27632.
- To dager etter seeding, erstatte media med normal TIVA medium uten Y-27632. Etter det er kulturforholdene de samme mellom de nye og de konvensjonelle metodene.
4. Cellepassing
- Fjern TIVA-mediet og skyll hver kulturrett to ganger med PBS.
- Tilsett 2 ml 0,05% trypsin per 100 mm cellekulturrett.
MERK: Rist parabolen for å sikre tilstrekkelig kontakt mellom fordøyelsesenzymer og bunnen av parabolen. - Fordøy i en 37 °C inkubator i 2 min.
- Bruk et mikroskop til å sjekke cellene, og sørg for at de fleste celler har dissosiert fra cellekulturretten.
MERK: Trykk forsiktig på fatet for å frigjøre cellene for å runde opp og flyte i løsningen. Forleng fordøyelsestiden hvis de fleste celler ikke suspendert etter tapping, men ikke mer enn 5 min. - Overfør melanocytter til et 15 ml rør etter nøytralisering av trypsinaktiviteten ved å legge til 2 ml avslutningsløsning. Sentrifuge ved 200 x g i 5 min.
- Resuspend hver celle pellet med 10 ml TIVA medium etter langsomt å fjerne supernatant, og deretter telle antall melanocytter.
- Plate ca 1 x 106 melanocytter i 10 ml TIVA medium per 100 mm cellekultur parabolen.
- Forny cellekulturmediet hver 48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et skjematisk diagram som sammenligner de konvensjonelle og de nye metodene. Prosedyren for vevsforberedelse og fordøyelse med den nye metoden er den samme som prosedyren for den konvensjonelle metoden, den eneste forskjellen er at de isolerte cellene er resuspended i 10 ml TIVA medium i nærvær av 10 μM Y-27632. To dager etter seeding, erstatte media med normal TIVA medium uten Y-27632. Den konvensjonelle metoden for å isolere primære melanocytter fra hudvev krever vanligvis ca 3 til 4 uker for melanocytter å vokse i tilstrekkelig antall til passasje, men enda viktigere, vevet kommer vanligvis fra nyfødte babyer, og det er svært vanskelig å isolere primære melanocytter fra voksen hudvev. Men ved hjelp av den nye metoden observeres melanocytter fra voksent vev i betydelig større antall enn melanocytter isolert ved hjelp av den konvensjonelle metoden. Mikroskopiske visninger ble tatt ved dag 3, 6 og 8 når du isolerer melanocytter fra voksent hudvev ved hjelp av den konvensjonelle metoden og den nye metoden (Figur 2A). I disse mikroskopiske synspunktene økte den nye metoden signifikant utbyttet av melanocytter ved dag 6 og 8. Melanocytttall ble deretter kvantifisert ved å telle minst 10 forskjellige mikroskopiske felt ved dag 3, 6 og 8. Resultatene viste at antall melanocytter isolert ved hjelp av den nye metoden er mye høyere enn antall melanocytter isolert ved hjelp av den konvensjonelle metoden ved dag 6 og 8 (Figur 2B). Etter 8 dager med kultur ble melanocytter høstet ved hjelp av trypsin og deretter regnet med en automatisert celleteller i hver enkelt 100 mm tallerken, som avslørte at den nye metoden økte melanocyttutbyttet med omtrent fem ganger (Figur 2C). Mikroskopiske visninger tatt på dag 9, en dag etter passaging, viste at de passasjene melanocytter proliferated normalt (Figur 2D), som ble bekreftet av Ki67 farging (Figur 2E).
Den forbedrede utbyttet av melanocytter av Y-27632 under den første kulturen etter isolasjon har blitt vist gjennom regulering av keratinocytter i en tidligere publikasjon16. Som vist i figur 3økte ikke Y-27632 veksten og spredningen av passasjen av melanocytter (figur 3A-B) og hemmet ikke apoptose av melanocytter (figur 3C-D). Imidlertid økte Y-27632 signifikant keratinocyttvedlegg (figur 3E-H) og fremmet også sin overlevende (Figur 3I) i mecytt-kulturen TIVA media. Enten co-kultur med keratinocytter i nærvær av Y-27632 eller betinget medium avledet fra Y-27632 behandlet keratinocytter kan betydelig øke veksten av melanocytter (Figur 3J).
For ytterligere å karakterisere melanocytter isolert ved hjelp av den nye metoden, ble MITF, en bestemt melanocyttmarkør, analysert ved hjelp av immunofluorescens (IF) farging for å kontrollere renheten av melanocytter etter første passaging. Figur 4A viser at prosentandelen av celler som uttrykker MITF ved passering 1 var nesten 100%, noe som indikerer at rene melanocytter ble oppnådd etter den første passasjen ved den nye metoden, som ligner på den konvensjonelle metoden. For å teste om melanocytter isolert ved hjelp av den nye metoden kan fungere normalt, ble de behandlet med forskolin (FSK) i 2 dager in vitro, som induserte nivåene av pigmentering av melanocytter (Figur 4B). Samlet tyder disse dataene på at melanocytter isolert ved hjelp av den nye metoden kan fungere normalt og kan produsere pigment.
Figur 1: Sammenligning av den nye metoden og den konvensjonelle metoden. Denne ordningen viser en sammenligning av den konvensjonelle metoden med den nye isolasjonsmetoden. Den eneste forskjellen er at de isolerte friske cellene er resuspended i 10 ml TIVA medium i nærvær av 10 μM Y-27632. To dager etter seeding erstattes mediet med normalt TIVA-medium uten Y-27632. Den nye metoden oppnår vanligvis en tetthet av melanocytter egnet for passaging på rundt dag 8, mens den konvensjonelle metoden vanligvis tar ca 20 dager å vokse tilstrekkelig antall melanocytter for passaging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Den nye isolasjonsmetoden øker produksjonen av primære melanocytter. (A) Representative bilder av melanocytter utarbeidet av den konvensjonelle metoden (øverste rad) og ved den nye metoden (nederste rad) på dag 3, 6 og 8 etter den første inokulasjonen. (B) Kvantifisering av melanocytttall utarbeidet ved hjelp av den konvensjonelle metoden og den nye metoden ved å telle melanocytttall i minst 10 forskjellige mikroskopiske felt (cellenummer / syn) ved dag 3, 6 og 8. Alle eksperimenter ble utført i triplicate og resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig antall celler per mikroskopisk felt. (C) Etter kultur i 8 dager ble melanocytter høstet ved hjelp av trypsin og antall melanocytter utarbeidet ved hjelp av den konvensjonelle metoden og den nye metoden ble regnet ved hjelp av en celletellingsplate. Antall celler ble beregnet ut fra triplicate eksperimenter, og resultatene viser gjennomsnittlig antall celler per 100 mm fat. (D) Etter å ha talt antall melanocytter ved hjelp av en automatisert celleteller, ble melanocytter tilberedt ved hjelp av den konvensjonelle metoden eller den nye metoden seeded i nye retter og mikroskopiske bilder ble tatt på dag 9. (E) Melanocytter isolert ved hjelp av den nye metoden ved passasje 0 eller ved passasje 1 ble festet og farget med Ki67 antistoff (rød) og DAPI (kjerner, blå). (B-C),Student t-testble brukt til å analysere forskjeller mellom den nye og den konvensjonelle metoden, ** P < 0,01, ***P < 0,005. Alle skalalinjer representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Y-27632 forbedrer mecyttvekst gjennom regulering av keratinocytter. (A) Rene melanocytter (passasje 3) ble behandlet med 10 μM Y-27632 for 12, 24, 48 og 60 timer og antall melanocytter ble analysert av CCK-8 analyse. (B) Rene melanocytter (passasje 3) ble behandlet med 10 μM Y-27632 for 48h og deretter ble løst for Ki67 farging. Kvantifisering av prosentandel av Ki67 positive celler blant totale levende celler indikert med DAPI kjernefysisk farging. - Jeghar ikke noe valg. Rene melanocytter (passasje 3) ble behandlet med 10 μM Y-27632 i 48 timer og deretter ble enten farget for apoptotiske celler med Annexin V-FITC og propidiumjodid etterfulgt av FACS analyse(C)eller festet for TUNEL analyse. (E) Isolert epidermis etter trypsin fordøyelsen ble belagt med TIVA medium med eller uten Y-27632 (10 μM) og 2 dager senere immunofluorescensanalyse av keratinocytes ble utført med en pan-cytokeratin antistoff (pan-ck). (F) Kvantifisering av keratinocytter i Y-27632-behandlede og kontrollretter fra (E) som prosentandel av keratinocytter i totalt 500 celler telles. (G) Ren passasje 3 keratinocytter ble seeded i TIVA medium med eller uten Y-27632 (10 μM). Bilder av epidermale celler vises på en dag etter seeding. (H) Kvantifisering av vedlagte keratinocytter i Y-27632-behandlede og kontrollretter fra (G) som prosentandel av vedlagte celler i totalt 5000 celler seeded. (I)Ren passasje 3 keratinocytter ble belagt med TIVA medium i nærvær eller fravær av Y-27632. De mikroskopiske bildene ble innhentet ved 24 timer (J) Venstre panel: Like mange rene passasje 3 melanocytter ble belagt med TIVA medium i 4 grupper med tillegg som indikert: 1) Y-27632 (10 10 10 10 10 27632 (10 10 27632 (10 10 10 27632 (10 10 10 27632 (10 10 10 24μM) alene (Y i graf), 2) passasje 3 keratinocytter alene, 3) keratinocytter og Y-27632 (10 μM) (K + Y) og 4) ingen tillegg (negativ kontroll, e.-er en av de Relative fold endringer i melanocytt spredning sammenlignet med den negative kontrollen ble bestemt ved å telle antall melanocytter på 24 t og 48 t etter plating. Høyre panel: Betinget TIVA media ble hentet fra de 4 gruppene av passasje 3 melanocytt kulturer i (venstre panel) på 48 h etter plating. Deretter ble like mange passasje 3 melanocytter belagt i 4 grupper, hver med en av de betingede mediene. Relative fold endringer i melanocytt spredning sammenlignet med den negative kontrollen ble bestemt ved å telle antall melanocytter på 24 t og 48 t etter plating. - Jeghar ikke noe å gjøre. Alle eksperimenter har blitt gjentatt i 3 ganger, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0.005. Alle stolper i bildene representerer 100 μm. Figuren er modifisert fra Mi et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Karakterisering av melanocytter isolert ved hjelp av den nye metoden. (A) Representative bilder av immunofluorescens farging av MITF (rød) i melanocytter utarbeidet ved hjelp av den nye eller konvensjonelle metoden. DAPI flekker kjerner (blå). (B) Cellepellets ble samlet inn fra melanocytter tilberedt ved hjelp av den nye metoden og ble behandlet i 2 dager med forskolin (FSK) eller DMSO kjøretøy som en kontroll (con). Alle skalalinjer representerer 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som er beskrevet her var basert på en nylig publikasjon16. Noe oppmerksomhet bør rettes mot følgende kritiske trinn for å oppnå de beste resultatene med den nye metoden. Først er vellykket separasjon av epidermis og dermis avgjørende. Skjær det voksne forhudsvevet i 3-4 mm brede strimler ved hjelp av et skalpellblad for å få dispase til å fungere grundigere og lettere for å skille epidermis fra dermis. For det andre, når du skiller disse to lagene, bør forurensning av dermis unngås siden dermal fibroblaster også kan vokse i melanocyttkulturmedium. For det tredje bør trypsinfordringstrinnet være mindre enn 30 min; Ellers vil det redusere levedyktigheten til de isolerte cellene betydelig.
Denne nye metoden forkorter betydelig tiden som trengs for mecyttisolasjon. Humane epidermale melanocytter produserer melanin, noe som beskytter huden mot solbestrålingsskade. Eisinger og Marko foreslo den første praktiske metoden for kulturen av menneskelige melanocytter fra epidermis5. Viktigst, vevet som brukes vanligvis kommer fra nyfødte babyer, og det er svært vanskelig å isolere primære melanocytter fra voksen hudvev. Rho-assosiert protein kinase hemmer Y-27632 forbedrer effektiviteten av epidermal stamcelleisolasjon11-13. I tillegg rapporterte vi også en metode for å isolere humane primære epidermale celler fra hudvev i nærvær av Y-2763210,11. I denne protokollen ble Y-27632 vist å effektivt øke utbyttet av primære melanocytter. Ved hjelp av den konvensjonelle metoden har en lav celle utvinning rate og trenger rundt 3 til 4 uker med kultur for melanocytter å vokse i tilstrekkelig antall til passasje. Denne nye metoden, der Y-27632 legges til TIVA vekstmedium, økt melanocytt utbytte med omtrent fem ganger, og melanocytter oppnådd kan spre seg normalt. Vi testet også den nye metoden ved hjelp av et kommersielt medium og fant lignende resultater. Når det gjelder mekanismen som er involvert, viste en nylig studie at effekten av Y-27632 for å øke effektiviteten av melanocyttisolasjon forekommer hovedsakelig gjennom keratinocytter16.
Viktigere, vi fikk rene melanocytter med normal funksjon ved hjelp av den nye metoden. Passasjen 1 (P1) melanocytter var nesten alle farget for MITF-uttrykk som indikerer at rene melanocytter oppnås etter den første passasjen. Primære melanocytter med høyt vekstpotensial er svært viktig for biologisk forskning og kliniske applikasjoner. Melanocytter isolert ved hjelp av den nye metoden kan induseres til pigment etter behandling med forskolin, en aktivator av adenylat cyklass som øker sykliske AMP nivåer, indikerer disse melanocytter kan fungere normalt, noe som vil være nyttig for å studere pigmentering defekter og melanom14.
Oppsummert ble en svært effektiv metode etablert for å isolere primære melanocytter fra voksent hudvev. Denne forbedrede metoden kan bidra til å gi tilstrekkelig antall melanocytter på en rask måte for biologisk forskning og for kliniske applikasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen interesse for konflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av The National Key Research and Development Program of China (2017YFA0104604), The General Program of National Natural Science Foundation of China (81772093), Military Logistics Research Project (AWS17J005), Nøkkelprogrammet i Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) og The Key Research and Development Program of Shandong Province (2019GSF108107) til X.W. Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (2019A1515110833) og Fundamental Research Funds of Shandong University (2019GN043) til J.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa fluor-594 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A21203 | For Immunofluorescence |
| Alexa fluor-594 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | R37119 | For Immunofluorescence |
| Cell Culture Dish | Eppendorf | 30702115 | For cell culture |
| Cell Strainer | Corning incorporated | 431792 | Cell filtration |
| 15 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| 50 mL Centrifuge Tube | KIRGEN | 171003 | For cell centrifuge |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026333 | For cell incubating |
| Constant Temperature Shaker | Shanghai Boxun | 150036 | For water bath |
| DAPI | Abcam | ab104139 | For Immunofluorescence |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | For melanocyte isolation |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Component of neutralization medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1AC5 | Component of neutralization medium |
| Fluorescence microscope | Olympus | 5E44316 | For Immunofluorescence |
| Forskolin | MCE | HY-15371 | Induce pigmentation |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | melanocyte culture medium |
| Ham's F12 | Thermo Scientific | 11330032 | melanocyte culture medium |
| Inverted microscope | Olympus | 5C42258 | For cell microscopic observation |
| 3-isobutyl-1-methyl xanthine (IBMX) | Sigma | 17018 | melanocyte culture medium |
| mouse anti-human MITF | Abcam | ab12039 | For Immunofluorescence |
| Na3VO4 | Sigma | S6508 | melanocytes culture medium |
| N6,2'-O-dibutyryladeno-sine 3',5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) | Sigma | D0627 | melanocyte culture medium |
| 12-O-tetradecanoyl phorbol-13-acetate (TPA) | Sigma | 79346 | melanocyte culture medium |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotics |
| rabbit anti-human Ki-67 | Abcam | ab15580 | For Immunofluorescence |
| Phosphate buffered solution | Solarbio Life Science | P1020-500 | Washing solution |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004380 | Cell centrifugation |
| TC20TM automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Automatic cell counting |
| 0.05% Trypsin | Life Technologies | 25300-062 | For melanocyte dissociation |
| Y-27632 | Sigma | Y0503 | For melanocyte isolation |
References
- Costin, G. E., Hearing, V. J. Human skin pigmentation: melanocytes modulate skin color in response to stress. FASEB Journal. 21 (4), 976-994 (2007).
- Battyani, Z., Xerri, L., Hassoun, J., Bonerandi, J. J., Grob, J. J. Tyrosinase gene expression in human tissues. Pigment Cell Research. 6 (6), 400-405 (1993).
- Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
- Hu, F., Staricco, R. J., Pinkus, H., Fosnaugh, R. P. Human melanocytes in tissue culture. Journal of Investigative Dermatology. 28 (1), 15-32 (1957).
- Eisinger, M., Marko, O. Selective proliferation of normal human melanocytes in vitro in the presence of phorbol ester and cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (6), 2018-2022 (1982).
- Hirobe, T. Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Research. 18 (1), 2-12 (2005).
- Halaban, R., et al. Basic fibroblast growth factor from human keratinocytes is a natural mitogen for melanocytes. Journal of Cell Biology. 107 (4), 1611-1619 (1988).
- Kunisada, T., et al. Keratinocyte expression of transgenic hepatocyte growth factor affects melanocyte development, leading to dermal melanocytosis. Mechanisms of Development. 94 (1-2), 67-78 (2000).
- Hirobe, T., Shinpo, T., Higuchi, K., Sano, T. Life cycle of human melanocytes is regulated by endothelin-1 and stem cell factor in synergy with cyclic AMP and basic fibroblast growth factor. Journal of Dermatological Science. 57 (2), 123-131 (2010).
- Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), 1251-1255 (2018).
- Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments. (138), e7862 (2018).
- Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
- Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin. Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
- Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C, Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
- Yokoyama, S., et al. Pharmacologic suppression of MITF expression via HDAC inhibitors in the melanocyte lineage. Pigment Cell & Melanoma Rresearch. 21 (4), 457-463 (2008).
- Mi, J., et al. A ROCK inhibitor promotes keratinocyte survival and paracrine secretion, enhancing establishment of primary human melanocytes and melanocyte-keratinocyte co-cultures. Pigment Cell & Melanoma Research. 33 (1), 16-19 (2020).
