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Biochemistry

Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular

doi: 10.3791/61229 Published: June 18, 2020

Summary

Este protocolo describe la evaluación del estado redox subcelular específico del compartimento dentro de la célula. Una sonda fluorescente sensible al redox permite un análisis ratiométrico conveniente en las células intactas.

Abstract

La medición del equilibrio de oxidación/reducción intracelular proporciona una visión general del estado redox fisiológico y/o fisiopatológico de un organismo. Los tioles son especialmente importantes para iluminar el estado redox de las células a través de sus proporciones reducidas de ditiool y disulfuro oxidado. Las proteínas fluorescentes que contienen cisteína de diseño abren una nueva era para los biosensores sensibles al redox. Una de ellas, la proteína fluorescente verde sensible al redox (roGFP), se puede introducir fácilmente en las células con transducción adenoviral, lo que permite evaluar el estado redox de los compartimentos subcelulares sin interrumpir los procesos celulares. Las ciisteínas reducidas y las cistinas oxidadas de roGFP tienen máximas de excitación a 488 nm y 405 nm, respectivamente, con emisión a 525 nm. La evaluación de las proporciones de estas formas reducidas y oxidadas permite el cálculo conveniente del equilibrio redox dentro de la célula. En este artículo del método, se utilizaron células de cáncer de mama de triple negativo humano inmortalizados (MDA-MB-231) para evaluar el estado de redox dentro de la célula viva. Los pasos del protocolo incluyen la transducción de línea celular MDA-MB-231 con adenovirus para expresar roGFP citosólico, el tratamiento con H2O2y la evaluación de la relación de cisteína y cistina con citometría de flujo y microscopía de fluorescencia.

Introduction

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El estrés oxidativo fue definido en 1985 por Helmut Sies como "una alteración en el equilibrio prooxidante-antioxidante a favor de la primera"1, y se ha llevado a cabo una plétora de investigación para obtener enfermedad-, nutrición-, y el envejecimiento-específico estado redox de los organismos1,2,3. Desde entonces, la comprensión del estrés oxidativo se ha vuelto más amplia. Probar las hipótesis del uso de antioxidantes contra enfermedades y/o envejecimiento ha demostrado que el estrés oxidativo no sólo causa daño, sino que también tiene otras funciones en las células. Además, los científicos han demostrado que los radicales libres desempeñan un papel importante en la transducción de señales2. Todos estos estudios refuerzan la importancia de determinar los cambios en la relación reducción-oxidación (redox) de las macromoléculas. La actividad enzimática, antioxidantes y/o oxidantes, y los productos de oxidación se pueden evaluar con varios métodos. Entre estos, los métodos que determinan la oxidación del tiol son posiblemente los más utilizados porque informan sobre el equilibrio entre antioxidantes y proxóxidos en las células, así como los organismos4. Específicamente, las relaciones entre el disulfuro de glutatión (GSH)/glutatión (GSSG) y/o cisteína (CyS)/cistina (CySS) se utilizan como biomarcadores para controlar el estado de redox de los organismos2.

Los métodos utilizados para el ensayo del equilibrio entre prooxidantes y antioxidantes dependen principalmente de los niveles de proteínas reducidas/oxidadas o moléculas pequeñas dentro de las células. Las manchas occidentales y la espectrometría de masas se utilizan para evaluar ampliamente las proporciones de macromoléculas reducidas/oxidadas (proteínas, lípidos, etc.), y las proporciones GSH/GSSG se pueden evaluar con espectrofotometría5. Una característica común de estos métodos es la perturbación física del sistema por lelisis celular y/o homogeneización tisular. Estos análisis también se vuelven desafiantes cuando es necesario medir el estado de oxidación de diferentes compartimentos celulares. Todas estas perturbaciones causan artefactos en el entorno de ensayo.

Las proteínas fluorescentes sensibles a redox abrieron una era ventajosa para evaluar el equilibrio redox sin causar una perturbación en las células6. Pueden apuntar a diferentes compartimentos intracelulares, permitiendo la cuantificación de actividades específicas del compartimiento (por ejemplo, el ensayo del estado redox de las mitocondrias y el citosol) para investigar la interferencia entre los orgánulos celulares. Meyer y sus colegas6revisan la proteína fluorescente amarilla (YFP), la proteína fluorescente verde (GFP) y las proteínas HyPeR. Entre estas proteínas, GFP sensible al redox (roGFP) es único debido a las diferentes lecturas fluorescentes de sus residuos CyS (por ejemplo, 488 nm/em. 525 nm) y CySS (por ejemplo, 405 nm/525 nm), que permite el análisis ratiométrico, a diferencia de otras proteínas sensibles al redox como YFP7,,8. La salida ratiométrica es valiosa porque contrarresta las diferencias entre los niveles de expresión, las sensibilidades de detección y el fotoblanqueo8. Los compartimentos subcelulares de las células (citosol, mitocondrias, núcleo) u diferentes organismos (bacterias, así como células de mamíferos) pueden ser objetivo mediante la modificación de roGFP7,9,10.

Los ensayos roGFP se llevan a cabo utilizando técnicas de imagen fluorescente, especialmente para experimentos de visualización en tiempo real. Los análisis citométricos de flujo de roGMP también son posibles para experimentos con puntos de tiempo predeterminados. El artículo actual describe tanto el uso de la microscopía fluorescente como la citometría de flujo para realizar una evaluación ratiométrica del estado de redox en las células de los mamíferos que sobreexpresan el roGFP (dirigido al citosol) a través de la transducción adenoviral.

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Protocol

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NOTA: Este protocolo se optimizó para celdas MDA-MB-231 confluentes del 70% al 80%. Para otras líneas celulares, se debe reoptimizar el número de células y la multiplicidad de infección (MOI).

1. Preparación de células (día 1)

  1. Mantener la línea celular MDA-MB-231 en matraces de 75 cm2 con 10 ml del medio águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con un 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 oC en una atmósfera humidificada de 5% CO2.
    NOTA: DMEM complementado con 10% FBS, 37 oC, y una atmósfera humidificada 5% CO2 se utilizan para todas las incubaciones de apego y tratamiento a lo largo de todo el protocolo.
  2. Prepare las células MDA-MB-231 para el experimento.
    1. Aspirar el medio dentro del matraz, separar las células con 2 ml de solución de trippsina-EDTA al 0,25% durante 2 min, e inactivar la actividad de tripsina con 6 ml de medio completo (DMEM con 10% FBS). Centrifugar las células a 150 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y suspender las células en 5 ml de medio completo.
    2. Mezcla una suspensión celular de igual volumen y un 0,4% de color azul trypan. Tome 10 l de esta mezcla y cuente las células con el contador de células automatizado.
      NOTA: También se puede utilizar un contador Coulter o un hemociclometro para el recuento de células.
    3. Siembra las células en una placa de 6 pozos para análisis de citometría de flujo y siembra 150.000 células en 1 ml de medio por pozo. Espere 16 h para el accesorio de celda.
    4. Siembra las células en un portaobjetos de cámara de 4 pozos para imágenes fluorescentes y siembra 25.000 células en 0,5 ml de medio por pozo. Espere 16 h para el accesorio de celda.
      NOTA: Los pozos de control de semillas además de los pozos de tratamiento. Utilice uno de los pozos de control para determinar el número de celda (opcional: si el período de unión para las celdas es más corto que el tiempo de duplicación, se puede suponer que el número de celda es el mismo que la densidad de siembra) y el otro para un control no infectado (0 MOI).

2. Transducción adenoviral roGFP (días 2 y 3)

ADVERTENCIA: Los adenovirus pueden causar enfermedades. Mientras transduzca las células, utilice puntas filtradas y descontamine las puntas, las pipetas Pasteur y los tubos de microcentrífuga con 10% de lejía.

NOTA: Este protocolo se demostró con roGFP específico de citosol, pero otros compartimentos celulares (por ejemplo, mitocondrias o espacio intermembrano mitocondrial) pueden ser dirigidos con este mismo protocolo.

  1. Generar una curva de dosis-respuesta para que el MOI obtenga la mayor eficiencia de transducción calculando el volumen de adenovirus (ml) necesario para cada valor MOI para la línea celular MDA-MB-231 (Tabla 1):
    Equation 1
    NOTA: El título funcional de cada lote de stock adenoviral, que se expresa como unidad de conformado de placa (PFU) por ml, es proporcionado por la empresa. El MOI óptimo para la transducción difiere entre los tipos de células. Para la mayoría de las células de mamíferos, el rango óptimo de MOI está entre 10 y 300. De acuerdo con la respuesta celular, los valores de MOI deben ser recalculados (por ejemplo, el rango de MOI debe reducirse si las células tienen respuesta citotóxica, o el rango debe aumentarse si las células tienen baja eficiencia de transducción).
  2. Haga una dilución 1:100 de 6 x 1010 PFU/ml solución roGFP adenoviral con medio de cultivo celular (DMEM con 10% FBS) para pipeteo confiable.
  3. Pipetear y añadir 0,0125 ml (12,5 l), 0,025 ml (25 l), 0,05 ml (50 ml) de dilución roGFP adenoviral en cada pocóver de la placa de 6 pozos para transducir las 150.000 células con 50, 100 y 200 MOI respectivamente para el análisis de citometría de flujo (Tabla 1).
  4. Pipetear y añadir 0,0042 ml (4,2 l) de dilución roGFP adenoviral en los pocillos deslizantes de 4 cámaras para transducir 25.000 células con 100 MOI para imágenes de fluorescencia (Tabla 1).
    NOTA: Se debe utilizar una cantidad mínima de medio en los pozos para garantizar la mayor interacción entre la construcción adenoviral roGFP y las células. El contenido sérico del medio de cultivo puede necesitar ser disminuido para diferentes líneas celulares porque los altos niveles de suero pueden afectar negativamente la eficiencia de la transducción en algunos tipos celulares.
  5. Incubar células durante 16–24 h bajo las condiciones de mantenimiento celular. Al día siguiente (día 3), cambiar el medio de cultivo medio a celular (DMEM con 10% FBS) para permitir la recuperación celular durante 24 h adicionales. Visualizar células bajo un microscopio para evaluar su morfología; las células pueden expresar roGFP incluso si tienen cambios morfológicos.
    NOTA: En el día 3, las células deben comenzar a expresar roGFP; por lo tanto, la eficiencia de la transducción puede controlarse mediante microscopía de fluorescencia (filtros con ex. 488/em. 525). Para obtener resultados consistentes en el ensayo, tenga en cuenta y documente los cambios morfológicos bajo el microscopio de contraste de fase y observe la morfología mientras evalúa la eficiencia de la transducción.
  6. Construir una curva de respuesta a la dosis utilizando las muestras de 50, 100 y 200 MOI preparadas en el paso 2.3 y sus resultados de eficiencia de transducción obtenidos del análisis de citometría de flujo (pasos 3.1 y 4.1). Evalúe la eficiencia óptima de la transducción con la documentación de los cambios morfológicos (paso 2.5) y la curva dosis-respuesta del MOI.
    NOTA: Aunque más del 98% de la población celular en 100 MOI y 200 MOI express roGFP (ver resultados representativos), 200 MOI grupo mostró cambios sustanciales en la morfología celular de las células MDA-MB-231. En consecuencia, se determinó que el MOI más eficaz para las células MDA-MB-231 era de 100 MOI.
  7. Después de MOI óptimo (aquí, 100 MOI) fue elegido para la línea celular MDA-MB-231, llevar a cabo un experimento con materiales de prueba (10 m H2O2 y su vehículo 0.1% agua desionizada).
    1. Preparar y sembrar las células de acuerdo con la sección 1. Utilizando el volumen de transducción adenoviral para 100 MOI calculado en el paso 2.1, repita los pasos 2.2 a 2.4 para 100 transducción adenoviral MOI de células. A continuación, incubar la placa y los portaobjetos de la cámara de acuerdo con el paso 2.5.

3. Adquisición del saldo CyS/CySS

  1. Citometría de flujo (día 4)
    1. En el día 4, incubar las células del paso 2.7.1 con 10 m H2O2 durante 1 h.
      NOTA: Se utilizaron 10 m H2O2 como sustancia de ensayo y se utilizó agua desionizada al 0,1% como tratamiento vehiculoso en este protocolo. Otros agentes oxidantes se pueden utilizar como controles positivos aquí.
    2. Aspirar los medios de la placa de 6 pozos, reemplazarlo con 750 l de solución de trippsina-EDTA al 0,25% y esperar 2 minutos para que las células se desprendan. Inactivar la trippsina con 2 ml de medio completo (DMEM con 10% FBS) y recoger el volumen en tubos cónicos de 15 ml.
    3. Centrifugar los tubos a 150 x g durante 5 min a 4oC. Deseche el sobrenadante y suspenda las células en 500 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    4. Repita el paso 3.1.3
    5. Filtrar las suspensiones celulares en tubos compatibles con citometría de flujo utilizando malla de 40 m. Mantenga los tubos sobre hielo y lejos de la luz y siga el paso 4.1 para el análisis de datos.
  2. Imágenes microscópicas (día 4)
    1. En el día 4, tratar las células con 10 m H2O2, adquirir imágenes inmediatamente (punto de tiempo 0) y 1 h después del tratamiento y seguir el paso 4.2 para el análisis de datos.

4. Análisis de datos

  1. Cuantificación de la citometría de flujo
    1. Establecer el método de citometría de flujo para 3 análisis diferentes a través del software de adquisición de muestras (ver Tabla de Materiales):dispersión hacia adelante (FCS) en eje x y dispersión lateral (SSC) en el eje Y para evaluar el tamaño de la célula y la complejidad de las células (SSC se puede utilizar para la identificación aproximada de células muertas y vivas); ex. 488 nm/em. Filtro de paso de banda de 525 nm (isotiocianato de fluoresceína [FITC]) en el eje X y SSC en el eje Y para evaluar CyS-roGFP; ex. 405 nm/em. Filtro de paso de banda de 525 nm (Violeta brillante 510 [BV510]) en el eje X y SSC en el eje Y para evaluar CySS-roGFP.
    2. Adquiera 0 MOI control y visualice celdas con software de adquisición de muestras. Repita este paso para las muestras restantes (50, 100, 200 grupos de MOI y más tarde 10 M H2O2 células tratadas y células tratadas con vehículos). Guarde los archivos para el análisis de datos.
    3. Abra el software deanálisis de datos (consulte Tabla de materiales ) y abra el archivo de ejemplo MOI 0. Evaluar la población celular de interés (Puerta 1). Configure las siguientes gatings para minimizar la fluorescencia de fondo para ex. 488 nm/em. 525 nm (puerta 2) y ex. 405 nm/em. Filtros de paso de banda de 525 nm (puerta 3) con las celdas de control no infectadas (0 MOI).
    4. Abra 50, 100 y 200 archivos de muestra MOI dentro del software de análisis de datos para evaluar la curva de dosis-respuesta. Analice las intensidades medias de fluorescencia con las puertas 2 y 3 para cada muestra. Repita este paso para las muestras de prueba (células tratadas con 10 m H2O2 y células tratadas con vehículos).
    5. Calcule la relación media de intensidad fluorescente entre las formas oxidadas frente a las reducidas de roGFP con la siguiente ecuación.

Equation 2

  1. Evaluación de la imagen
    1. Utilice un microscopio que contenga filtros de fluorescencia para CyS-roGFP y CySS-roGFP (por ejemplo, 488 nm/em. 525 nm y ex. 405 nm/em. filtros de 525 nm, respectivamente).
    2. En cada pozo de la diapositiva de la cámara, elija 4 áreas aleatorias para adquirir imágenes, utilizando el objetivo 4x para visualizar áreas más grandes.
      NOTA: El objetivo 20x también se puede utilizar para las visualizaciones de imágenes.
    3. Abra la imagen con el software ImageJ11. Aplicar Análisis ? Mida los comandos para cada imagen y utilice la ecuación en el paso 4.1.5 para cuantificar los datos.
      NOTA: La cuantificación de las imágenes es ratiométrica; por lo tanto, el protocolo no incluye la resta de fondo. Sin embargo, para poder comparar imágenes, brillo, contraste y saturación debe ser el mismo para cada imagen. La significación estadística se evaluó con el análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) y la prueba post hoc de Tukey.

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Representative Results

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El estado redox de CyS/CySS se ensaya fácilmente con roGPPs transducidos. La sonda fluorescente cuantifica la relación entre las formas reducidas y oxidadas (longitudes de onda de excitación 488 nm y 405 nm, respectivamente). Los datos de fluorescencia se pueden obtener mediante citometría de flujo y microscopía.

Un gran número de células se pueden adquirir de manera consistente y conveniente utilizando la citometría de flujo. El análisis consta de 3 pasos principales: 1) seleccionar la población celular de interés con el filtro de área FSC (Figura 1A); 2) puertas de las celdas que expresan roGFP con ex. 488/em. 525 nm con un filtro de paso de banda selectivo(Figura 1B); y 3) enuerce las células oxidadas que contienen roGFP de las células que expresan roGFP con ex. 405 nm/em. Filtro de paso de banda de 525 nm(Figura 1C).

Cada nueva línea celular debe evaluarse para la eficiencia óptima de transducción adenoviral de los roGMP. La eficiencia de la transducción debe evaluarse ndo con una evaluación morfológica de las células y análisis de expresión roGFP con citometría de flujo y/o microscopía fluorescente. Este protocolo utiliza la citometría de flujo para determinar la curva dosis-respuesta para los análisis de roGFP y para seleccionar la entrada MOI más eficiente(Figura 2AaH). Según la curva moI dosis-respuesta(Figura 2I), 200 MOI dio la expresión roGFP más alta, pero la morfología celular se vio afectada, lo que sugiere citotoxicidad. Por lo tanto, se determinó que la eficiencia óptima de transducción era con 100 MOI.

Para evaluar la eficacia del método, H2O2 se utilizó como un control positivo para la oxidación. Cien MOI se utilizaron para una transducción óptima. Después del período de recuperación, las células fueron tratadas con 10 m H2O2 durante 1 h para obtener la relación de fluorescencia a través de la citometría de flujo. Oxidado (ej. 405 nm/em. 525nm) y reducido (por ejemplo, 488 nm/em. 525 nm) se obtuvieron intensidades de fluorescencia medias de roGFP a partir de análisis de fluorescencia de flujo para los tratamientos del vehículo (Figura 3A, B) y 10 m H2O2 (Figura 3C, D) tratamientos. Los histogramas superpueste representan el desplazamiento en los números de celda de 10 m H2O2 y grupos tratados con vehículos para roGFP reducidos (Figura 3E) y oxidados (Figura 3F). La relación entre roGFP oxidado y reducido muestra que 10 m H2O2 causó un aumento de 3 veces en la oxidación de roGFP en comparación con el tratamiento del vehículo(Figura 3G).

También se realizaron imágenes fluorescentes de células con 10 m H2O2 bajo el microscopio durante 1 h. Se tomaron imágenes bajo el objetivo 4x, y se tomaron imágenes representativas bajo el objetivo 20x (Figura 4A). Las intensidades fluorescentes se evaluaron con el software ImageJ, y se calcularon las relaciones. Se detectó un aumento del estado estacionario en la oxidación inducida porH2 O2(Figura 4B); la incubación con H2O2 durante 1 h aumentó la oxidación de los cicinos roGFP, que exhibieron cambios significativos entre los controles del vehículo.

Figure 1
Figura 1: Configuración de gating para intensidades fluorescentes de residuos roGFP que contienen CyS (reducido) y roGFP (oxidados) que contienen CySS con células MDA-MB-231 no transducidas. (A) La población celular de interés se seleccionó como Puerta 1 con filtros de área SSC y FSC. (B) las células de expresión roGFP se seleccionaron de acuerdo con celdas no expresantes como puerta 2 con el ex. 488/em. Filtro de paso de banda de 525 nm. (C) Las células oxidadas (cistina) que contienen roGFP se ensupusaron con los ex 405 nm/em. Filtro de paso de banda de 525 nm de la población que expresa roGFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Evaluación de la curva de dosis-respuesta MOI con análisis de citometría de flujo para la línea celular MDA-MB-231. (A,B) Células no infectadas y (C,D) 50 MOI, (E,F) 100 MOI, y (G,H) 200 poblaciones de células expresas ROGFP MOI adquiridas para la configuración de gating, respectivamente. (I) Las células transducidas se evaluaron y trazaron como un porcentaje según la población celular de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de la citometría de flujo del balance CyS/CySS en la línea celular MDA-MB-231 transducida por roGFP. Las células tratadas con vehículos se evaluaron como células que expresan(A) % de células expresas roGFP, y (B) % se evaluaron células oxidadas que expresan roGFP y el tratamiento H2O2 con los mismos parámetros en los paneles (C) y (D) respectivamente. Los histogramas de recuento celular del vehículo y el tratamiento H2O2 se superaron para (E) reducido roGFP ex. 488/em. Filtro de paso de banda 525 y (F) roGFP oxidado ex. 405/em. Filtro de paso de banda 525. (G) Las proporciones medias de intensidad de fluorescencia entre formas oxidadas/reducidas se trazaron en un gráfico de barras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagen fluorescente del MDA-MB-231 transducido por roGFP. (A) Imágenes representativas después de 1 h de tratamiento con vehículo o H2O2. (B) Las proporciones entre formas oxidadas/reducidas se evaluaron en 4 áreas elegidas aleatoriamente, y las barras representan la media de la desviación estándar. Significación estadística entre grupos indicados como *(p < 0.05), **(p < 0.01) o ***(p < 0.005). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tipo de análisis Número de celda por pozo Adenoviral roGFP PFU/mL 1:100 dilución de adenoviral roGFP PFU/mL Moi Volumen de transducción (ml)
Citometría de flujo 150,000 6 x 1010 6 x 108 0 0
50 0.0125
100 0.025
200 0.05
Microscopía de fluorescencia 25,000 6 x 1010 6 x 108 100 0.0042

Tabla 1: Cálculo de los valores MOI.

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Discussion

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El equilibrio tiol/disulfuro en un organismo refleja el estado redox de las células. Los organismos vivos tienen glutatión, cisteína, tioles proteicos y tioles de bajo peso molecular, todos los cuales se ven afectados por el nivel de oxidación y se hacen eco del estado redox de las células4. Los roGRP diseñados permiten la cuantificación no disruptiva del equilibrio tiol/disulfuro a través de sus residuos CyS7. La propiedad ratiométrica de roGFP proporciona mediciones fiables de redox para células de mamíferos. el roGFP se puede introducir fácilmente en las células con métodos de transfección y/o vectores de transducción, pero la transducción adenoviral tiene una mayor eficiencia.

El estado redox de las células se ve fácilmente afectado por el entorno celular (por ejemplo, confluencia de células y volumen de medio). Para este protocolo, se determinó que la confluencia optimizada de siembra de celdas era del 60%-70%, con 15.000 células por cm2; el día del análisis, las células eran del 70%-80% confluentes. Sin embargo, la morfología celular y el tiempo de duplicación difieren entre las líneas celulares. Por esta razón, si el investigador tiene la intención de utilizar otra línea celular, la confluencia celular debe ajustarse al adquirir mediciones con citometría de flujo y/o microscopía de fluorescencia; esto asegurará resultados precisos basados en su diseño experimental y sus necesidades.

los roGMP se pueden introducir fácilmente en las células con múltiples métodos de transfección y/o vectores de transducción. El protocolo actual utiliza la construcción roGFP específica del citosol, que se trans induce a las células con un adenovirus. Antes de iniciar un experimento, es esencial determinar la dosis-respuesta MOI para una línea celular; esto permite determinar la máxima eficiencia de transducción con una toxicidad celular mínima para diseñar el protocolo óptimo y reproducible.

El estado CyS/CySS de las células transducidas por roGFP se puede evaluar tanto con imágenes fluorescentes como con citometría de flujo. Ambos análisis tienen sus pros y sus contras; la citometría de flujo permite evaluar rápidamente una población celular más grande, pero las imágenes por fluorescencia tienen una mayor sensibilidad a las células específicas de roGFP. Además, también confirma la correcta localización subcelular de la GFP (por ejemplo, citosólica frente a mitocondrial). Aquí, tanto la citometría de flujo como las imágenes fluorescentes fueron utilizadas por los investigadores. Aunque H2O2 se considera un oxidante débil para la construcción7de roGFP, el protocolo demostró que ambos métodos son lo suficientemente sensibles como para detectar cambios ratiométricos entre las formas oxidadas y reducidas de roGFP después del tratamiento con H2O2.

Este protocolo roGFP se puede utilizar para determinar el estado redox de diferentes tipos de células de mamíferos. Para entender la muerte por cardiomiocitos inducido por menadiona en el contexto del equilibrio prooxidante/antioxidante, Loor y sus colegas utilizaron el etiquetado roGFP citosólico y mitocondrial en cardiomiocitos12. roGFP permite la visualización del estado redox de las células mientras están vivas, y la segmentación específica del compartimiento permite una mejor comprensión de las enfermedades. Esposito y sus colegas revisaron el uso de roGFP para determinar el estado redox de las células en enfermedades neurodegenerativas13. Debido a que la transducción de roGFP en diferentes organismos, incluyendo plantas14 y bacterias9, se logra fácilmente, el monitoreo del estado de redox de las células bacterianas y del huésped durante los estados de la enfermedad podría facilitar enfoques de tratamiento innovadores. Además, los estudios in vivo realizados con roGFP específico del compartimento en animales transgénicos podrán arrojar luz sobre el estado redox de los organismos15,16.

Sin embargo, en ciertas situaciones, el biosensor roGFP es inadecuado para investigar los cambios de redox fisiológicamente relevantes5 y H2O2 oxidación7 dentro de las células. La selectividad de la peroxidasa para H2O2 se utilizó para diseñar sondas más sensibles6. La levadura peroxidasa ORP1 se vinculó a roGFP para permitir la delicada medición de H2O2-oxidación mediada de tiol17,18,19. Del mismo modo, la incorporación de la glutaredoxina humana (Grx1) en el sensor roGFP monitorea específicamente el equilibrio GSH/GSSG dentro de los compartimentos celulares6,,18,,19.

Este protocolo fácilmente aplicable permite a los investigadores monitorear el estado de redox específico del compartimento en células intactas, minimizando la oxidación artefacto debido al estrés físico durante la homogeneización celular. El protocolo actual muestra 2 métodos de cuantificación: citometría de flujo (beneficioso para análisis rápidos de grandes poblaciones celulares) y microscopía fluorescente (permitiendo imágenes continuas de lapso de tiempo y determinando la morfología de las células).

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

El adenovirus constructor y recombinante para expresar roGFP específico de citosol en células se generó en el laboratorio de Paul T. Schumacker, PhD, Freiberg School of Medicine, Northwestern University y ViraQuest Inc., respectivamente. Este estudio fue apoyado por el Centro de Estudios de Respuesta Anfitriona a la Terapia del Cáncer subvención P20GM109005 a través del NIH National Institute of General Medical Sciences Centers of Biomedical Research Excellence (COBRE NIGMS), National Institute of General Medical Sciences Systems Pharmacology and Toxicology Training Program grant T32 GM106999, UAMS Foundation/Medical Research Endowment Award AWD00053956, UAMS Year-End Chancellor's Awards AWD00053484. La instalación del núcleo de citometría de flujo fue apoyada en parte por el Centro de Patogénesis Microbiana y Respuestas Inflamatorias anfitrionas otorgadaS P20GM103625 a través del COBRE NIGMS. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los NIH. ATA fue apoyada por la beca 2214-A del Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TUBITAK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco by Life Sciences 25200-056 Cell culture
4-well chamber slide Thermo Scientific 154526 Cell seeding material for fluorescent imaging
5 ml tubes with cell strainer cap Falcon 352235 Single cell suspension tube for flow cytometry analysis
6-well plate Corning 353046 Cell seeding material for flow cytometry analysis
15 ml conical tubes MidSci C15B Cell culture
75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks Corning 4306414 Cell culture
Adenoviral cytosol specific roGFP ViraQuest VQAd roGFP roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker
Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet Thermo Scientific 1300 Series A2 Cell culture
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting
Countess cell counter chamber slides Invitrogen C10283 Cell counting
DMEM Gibco by Life Sciences 11995-065 Cell culture
FBS Atlanta Biologicals S11150 Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 20 µl Fisherbrand 02-717-161 Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl Fisherbrand 02-717-166 Cell culture
Flow Cytometer BD Biosciences LSRFortessa Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses
Fluorescent Microscope Advanced Microscopy Group (AMG) Evos FL Fluorescent imaging
Hydrogen Peroxide 30% Fisher Scientific H325-100 Positive control
Light Cube, Custom Life Sciences CUB0037 Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)
Light Cube, GFP Thermo Scientific AMEP4651 Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)
MDA-MB-231 American Tissue Culture Collection HTB-26 Human epithelial breast cancer cell line
Microcentrifuge tubes, 2 ml Grenier Bio-One 623201 Cell culture
PBS Gibco by Life Sciences 10010-023 Cell culture
Pipet controller Drummond Hood Mate Model 360 Cell culture
Serologycal pipet, 1 ml Fisherbrand 13-678-11B Cell culture
Serologycal pipet, 5 ml Fisherbrand 13-678-11D Cell culture
Serologycal pipet, 10 ml Fisherbrand 13-678-11E Cell culture
Tissue Culture Incubator Thermo Scientific HERACell 150i CO2 incubator for cell culture
Trypan blue stain 0.4% Invitrogen T10282 Cell counting

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References

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Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular
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Tascioglu Aliyev, A., LoBianco, F., Krager, K. J., Aykin-Burns, N. Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein. J. Vis. Exp. (160), e61229, doi:10.3791/61229 (2020).More

Tascioglu Aliyev, A., LoBianco, F., Krager, K. J., Aykin-Burns, N. Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein. J. Vis. Exp. (160), e61229, doi:10.3791/61229 (2020).

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