Summary
يصف هذا المنشور بروتوكولًا لعزل النوى عن الخلايا الشحمية الناضجة ، والتنقية عن طريق الفرز المُفعّل بالفلور ، و نسخ مستوى الخلية الواحدة.
Abstract
الدهون البنية والبيج هي الأنسجة الدهنية المتخصصة التي تبدد الطاقة لحرارة الثيرموغين من قبل UCP1 (فك البروتين-1)-تعتمد على مسارات مستقلة. حتى وقت قريب، كانت تعتبر الخلايا الدهنية الحرارية سكانية متجانسة. ومع ذلك، أشارت الدراسات الحديثة إلى أن هناك أنواع فرعية أو شعَبَة فرعية متعددة تتميز في الأصل التنموي، واستخدام الركيزة، والنصوص. على الرغم من التقدم في الجينوم وحيد الخلية، كان التحلل غير المتحيز للأنسجة الدهنية في الأنواع الفرعية الخلوية تحديا بسبب الطبيعة الهشة للدهون المليئة بالدهون. وقد تم تطوير البروتوكول المقدم للتحايل على هذه العقبات من خلال العزل الفعال للنيات وحيدة من الأنسجة الدهنية لتطبيقات المصب، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي. ويمكن بعد ذلك تحليل التغاير الخلوي عن طريق تسلسل الحمض النووي الريبي وتحليلات المعلوماتية الحيوية.
Introduction
وقد أظهرت الدراسات أن الأنسجة الدهنية البني (BAT) لديه قدرة ملحوظة لتبديد الطاقة. نوعان من الخلايا الدهنية الحرارية ذات سمات تنموية مميزة موجودة في كل من القوارض والبشر: adipocytes البيج والكلاسيكية البنية الكلاسيكية. بينما توجد الخلايا الدهنية البنية الكلاسيكية في الغالب في مستودعات BAT بين الأغطية، تظهر الخلايا الشحمية البيج بشكل متقطع في الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) استجابة لبعض الإشارات الفسيولوجية، مثل التعرض للبرد المزمن، وهي عملية يشار إليها باسم "براونينغ" أو "beiging". من خلال استخدام التصوير المتقدم ، أصبح من الواضح الآن أن البشر البالغين لديهم مستودعات كبيرة من UCP1+ BAT ، خاصة في المنطقة فوق الاعلى من الاعلى من الاعلى ،,2،3،14. كمية الإنسان الكبار BAT يرتبط عكسيا مع adiposity ويمكن زيادتها عن طريق العظة الخارجية، مثل التعرض للبرد المزمن5،6 أو β3-adrenergic مستقبلاتناهض 7. وقد يوفر الإنفاق على الطاقة بوساطة BAT نهجاً قابلاً للتطبيق لمكافحة السمنة.
حتى وقت قريب، كانت تعتبر الخلايا الدهنية الحرارية سكانية متجانسة. ومع ذلك، فقد كشفت الدراسات عن وجود أنواع فرعية متعددة أو سكانية فرعية متميزة في الأصل التنموي، واستخدام الركيزة، ونسخ8و99و10., على سبيل المثال، تم وصف نوع من adipocyte البيج التي تستخدم بشكل تفضيلي الجلوكوز لthersgenesis، وg-البيج adipocyte، مؤخرا10. يشكل الفهم غير الكامل لأنواع الخلايا في الأنسجة الدهنية البنية والبيج وعدم وجود علامات محددة عائقًا حاسمًا أمام دراسة وظائفها البيولوجية.
وتستند الطرق التقليدية لعزل الاكتظاظ الفرعي للخلايا على التعبير عن جينات قليلة معروفة فقط. إن التطورات الحديثة في الجينومات أحادية الخلية تمكن من استخدام بيانات التعبير الجيني العالمي للخلايا المفردة لتوفير تقدير غير متحيز لعدد السكان الفرعيين في الأنسجة. الهدف النهائي لهذا البروتوكول هو تحديد جميع الأنواع الفرعية الأنسجة الدهنية تحت مختلف المحفزات الحرارية في قرار خلية واحدة. على النقيض من الأنسجة الأخرى وأنواع الخلايا، وتحديد الأنواع الفرعية الخلوية من الأنسجة الدهنية هو التحدي بسبب هشاشة الشحمية الدهنية. هذه الورقة يقدم بروتوكول قوي لعزل النوى واحدة من الأنسجة الدهنية لتطبيق المصب لتسلسل snRNA. الأهم من ذلك ، الأدب الحديث مقارنة مطابقة جيدا تسلسل الحمض النووي الريبي واحد (snRNA - seq) و CELLN -cell تسلسل (SCRNA - seq) كشفت مجموعات البيانات أن snRNA - seq هو مماثل لsرنا - ما بعد في الكشف عن نوع الخلية ، ومتفوقة في التغطية الخلوية لنسيج معقد مثل الدماغ11. يجمع هذا البروتوكول بين أسلوب الطارد المركزي للتدرج الكثافة الأمثل للأنسجة الدهنية بواسطة Rosen etal. 12 مع خطوة "تنظيف" نوية مع فارز السرعة العالية MoFlo XDP. كما رأينا في النتائج التمثيلية، حدد تحليل 7500 نوى واحد من الأنسجة الدهنية البنية بين الماوس بين الكتفين أنواع خلايا متعددة داخل الخلايا الدهنية البني المتجانسة على ما يبدو. وعموما، يمكن تطبيق هذا البروتوكول البسيط والقوية لدراسة تنظيم الأنسجة على مستوى الخلايا الشحمية والخلايا الدهنية المقيمة، وتحديد جينات علامة النوع الفرعي، وتطوير ظاهري من الفئران خروج المغلوب /المعدلة وراثيا الدهنية انتقائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء رعاية الحيوانات والتجريب وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدامها في كلية ألبرت أينشتاين للطب.
1. إعداد هضم الأنسجة والمخازن التحلل
- إعداد العازلة الهضم الأنسجة.
- إعداد ~ 1 مل من العازلة الهضم لكل غرام من الأنسجة الدهنية.
- تزن بها 1.5 U/mL الكولاجين D و 2.4 U/mL dispase الثاني وإضافة الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
- إعداد احتياطي إعداد النوى (NPB).
- إعداد 10 mM HEPES، 1.5 mM كلوريد المغنيسيوم، 10 mM كلوريد البوتاسيوم، 250 mM السكروز، و 0.1٪ NP-40 في المياه الخالية من النوى. مزيج جيد. قد السكروز يستغرق وقتا أطول للذوبان من المكونات الأخرى.
- تحضير 0.5% بولين مصل الألبومين (BSA) حل.
- إعداد 0.5٪ BSA في برنامج تلفزيوني يحتوي على EDTA. فمن المستحسن استخدام العقيمة تصفية خلية ثقافة الصف PBS (انظر جدول المواد).
2. الهضم الانزيمية من الأنسجة الدهنية
- تشريح الفئران لاستخراج الأنسجة الدهنية وفقا لـ Aune وآخرون13. جمع الأنسجة المعزولة في طبق يحتوي على برنامج تلفزيوني. نقل الأنسجة إلى منشفة ورقية لبات الجافة. ثم ضع الأنسجة في طبق نظيف.
- إضافة كلوريد الكالسيوم إلى العازلة الهضم إلى تركيز النهائي من 10 mM. إضافة حجم صغير من عازلة الهضم إلى الطبق ويمرم جيدا الأنسجة الدهنية. حجم العازلة الهضم المطلوبة سوف يستند على كمية من الأنسجة المعزولة. عادة ~ 1 مل أو أقل يستخدم.
- إضافة حوالي نصف كمية من احتياطي الهضم المعدة (على سبيل المثال، ~ 10 مل لخمسة فئران) إلى الأنسجة المفروم. باستخدام ماصة المصلية، نقل العينة إلى أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 50 مل. إضافة أي كمية المتبقية من المخزن لغسل الطبق ونقلها إلى أنبوب 50 مل تحتوي على العينة. الماصات صعودا وهبوطا عدة مرات. ثم احتضان مع اهتزاز في 200-210 دورة في الدقيقة في 37 درجة مئوية لمدة 12-15 دقيقة.
3- العزلة الشحمية
- بعد الحضانة، إضافة 0.5٪ BSA بنسبة 1:1 إلى العينة. تخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات. الطرد المركزي العينة في 300 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) لتدور أسفل كسر الأوعية الدموية stromal (SVF). سيبقى الكسر الشحميّيّ في الطبقة العليا من العينة.
- ضع فلتر الخلايا 40 ميكرومتر فوق أنبوب جهاز طرد مركزي مخروطي 50 مل وتصفية العينة، وجمع الطبقة العليا وترك الـ SVF في أسفل الأنبوب. نقل الطبقة العليا (الكسر الشحمية) إلى أنبوب جديد عن طريق التقليب مرشح رأسا على عقب على أنبوب واستخدام 0.5٪ BSA لعكس غسل المرشح وجمع العينة في أنبوب.
- جلب حجم إجمالي 0.5٪ BSA إلى 10-15 مل على أساس حجم العينة والماصات صعودا وهبوطا مع ماصة المصلية أو يهز لفترة وجيزة صعودا وهبوطا لخلط العينة. الطرد المركزي العينة مرة أخرى في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
4- عزل النوى
- استخدم طرف ماصات واسع الآبار وقم بنقل الطبقة العليا من العينة بعناية إلى مرشح خلية 100 ميكرومتر يوضع فوق أنبوب جديد مُنبس مسبقًا على الجليد، تاركًا وراءه أي SVF متبقي.
- شطف / غسل مرشح مع كمية كافية من NPB وتجاهل مرشح. من هذه الخطوة إلى الأمام لديك عينة على الجليد في كثير من الأحيان ممكن والعمل بسرعة لتجنب تسرب و / أو نوى غير صحية. ومن المفيد أن أنابيب ما قبل التلال microcentuge لاستخدامها في الخطوات المستقبلية على الجليد.
- ضع العينة على الجليد لمدة لا تزيد عن 2 دقيقة مع قلب لطيف متقطع للأنبوب لخلطه. وينبغي تحسين وقت الحضانة على الجليد لحجم العينة ونوع من adipocytes. جهاز طرد مركزي عند 1000 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- إزالة عظمى وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من NPB. نقل العينة إلى أنبوبrifuge الدقيقة النظيفة. أثناء النقل، تجنب لمس جدران الأنبوب، التي تحتوي على الحطام والدهون. إضافة 0.6 U/μL RNase مثبطات للعينة ومزيج. مرة أخرى في جهاز طرد مركزي 1000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: يجب تقليل سرعة الطرد المركزي والوقت في هذه الخطوة للحصول على عينات أصغر. - إزالة افرا و resuspend في 1 مل من نوكلي غسل العازلة (2٪ BSA / PBS + 0.6 U / μL RNase المانع).
- مرشح مزدوج في أنبوب نظيف مع مرشحات 30 ميكرومتر قابلة للتكديس. غسل مرشح مع حجم صغير (~ 300 ميكرولتر) من Nuclei غسل العازلة. بدلا من ذلك، للحصول على عينات أصغر، استخدم مرشح 30 ميكرومتر التي تناسبها في أنبوب microcentrifuge والتصفية مباشرة في ذلك.
- تأكيد نجاح عزل النوى الصحية.
- وصمة عار aliquot صغيرة من العينة مع trypan واستخدام عداد خلية الآلي لتقييم متوسط حجم الميت والخلايا الميتة في المئة. وينبغي أن يتراوح متوسط حجم الميت لعينة تحتوي على معظم النوى بين 7-10 ميكرومتر.
- وصمة عار aliquot صغيرة من العينة مع DAPI وفحص تحت المجهر مع هدف 20X أو أعلى. يجب أن يكون الغشاء النووي سليمًا ويجب أن تكون النوى مستديرة.
5. تنظيف FACS وخطوة تركيز نوات
- انتقل فوراً إلى خطوة FACS لتنظيف النوى وإزالة أي حطام زائد. يجب أن يحتوي المخزن المؤقت للمجموعة على مخزن غسيل Nuclei. أثناء FACS يتم تخفيف المخزن المؤقت. إعداد تركيز أعلى من مثبطات BSA و RNase لحساب التخفيف أثناء الفرز مفيد. يجب أن تكون كتلة مجموعة FACS في وضع التبريد.
- بعد فرز النوى، الطرد المركزي في 500 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية لتركيز العينة. إعادة تشكيل في حجم مناسب من نوكلي غسل العازلة لتحقيق تركيز من 500-1500 نوات / μL. لا تحاول إزالة كل من فوق. وسيؤدي ذلك إلى فقدان النوى.
- استخدام مقياس الهيموسيت و aliquot الملطخة DAPI للعد النهائي وتصور النوى. ثم المضي قدما على الفور مع snRNA-seq وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحتوي النوى الدهنية غير المتنوعة على الحطام والمزدوجة التي تخلق ضوضاء وخلفية عالية في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المصب. وتظهر استراتيجية بوابة FACS التمثيلية في الشكل 1. تم اختيار النوى أولاً بناءً على التشتت الأمامي (FSC) وتشتت الجانب (SSC) (A)، ثم تم اختيار singlets فقط استنادًا إلى الجمع بين العرض والارتفاعات من SSC (B). وأخيراً، تم تحديد الأحداث الإيجابية DAPI فقط وفرزها في مخزن المجموعة المؤقت(C). يوفر هذا سير العمل نواة واحدة عالية النقاء مع مجاميع نووية مصغرة ومخلفات خلوية (الشكل 2).
للتأكد من سلامة النوى فرزها، تم فحص aliquot صغيرة من العينة عن طريق المجهر بعد تلطيخ DAPI. يجب أن يكون الغشاء النووي سليمًا ويجب أن تكون النوى مستديرة (الشكل 2ب). لتأكيد نجاح عملية التنقية، يوصى أيضاً بجمع المُعَدّر (أي مخزن المجموعة) بعد الطرد المركزي وتشغيل qRT-PCR في الوقت الحقيقي من جين العلامة. استخدام مجموعة التمهيدي (تسلسل التمهيدي في الجدول 1)تهدف إلى تضخيم الوليدة، التي تحتوي على UCP1، التي تحتوي على intron، أكد أن عظمى من نواة فرزها لا تحتوي على مستوى قابل للكشف من UCP1 MRNA الوليدة(الشكل 3). يمكن القيام بهذه الخطوة للجينات علامة أخرى وفيرة للغاية في البني، البيج، أو بيضاء adipocytes، مثل Cidea، Pgc1-a، Adipoq، أو Fabp4.
Nuclei معزولة وأكد من خلال هذا البروتوكول يمكن أن تخضع تقريبا أي خلية واحدة على مستوى الجينات منصة التعبير. استخدام منصة الكروم14 (10x الجينوم) تحديد نسخة من 7500 نواة من الأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين من الذكور 8 أسابيع من الفئران C57BL/6(الشكل 4). كشفت t-توزيعها التضمين التضمين (t-SNE) الحد من الأبعاد وK-يعني التجمع سبعة أنواع الخلايا، بما في ذلك الخلايا الدهنية البني، والخلايا البطانية، وخلايا جدارية تميزت Pdgfrb،adipocyte progenitors، والخلايا المناعية. جميع المجموعات أعرب Fabp4، وهو جين عموم adipocyte ، بدرجات متفاوتة (الشكل 4B). وقد عبرت مجموعة فرعية من المجموعات عن مستوى عال من الـ Ucp1 mRNA، في حين أعربت مجموعات أخرى بشكل متقطع عن Ucp1 (الشكل 4ألف وجيم). وهذا يتفق مع دراسة سابقة تبين أن الأنسجة الدهنية البني بين الcapular يحتوي على ما لا يقل عن اثنين من مجموعات متميزة مع ارتفاع وانخفاض التعبير Ucp1 والنشاط الحراري8,9.
الشكل 1: تحليل تدفق التدفق الشعاعي للنوية بواسطة موزلو XDP عالية السرعة فارزر. (A) الحجم و حبيبي. (ب) الكشف عن المجاميع النووية والمضاعفات. (C) بوابة الفرز النهائية اختيار الأحداث الإيجابية فقط DAPI. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صورة تمثيلية للنيات معزولة عن الخلايا الدهنية البنية. (A) قبل و (B) بعد فرز MoFLo XDP. الأسهم البيضاء في A تشير إلى النوى دون غشاء سليم. شريط مقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نتيجة تمثيلية qRT-PCR للنيات المعزولة والماكر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ممثل 10x الكروم snRNA-seq النتائج لsdipocytes البني معزولة عن 8 أسابيع الذكور C57BL/6 الفئران تحت RT. (أ) t-SNE الحد من الأبعاد وK - يعني التجمع ل7500 نواة. ك = 9. تظهر العلامات المتعارف عليها المستخدمة للتعليقات التوضيحية للكتلة في أقواس. (B) MRNA التعبير عن Fabp4، علامة الدهنية الانتقائية ، في A. أبيض = لا تعبير، أحمر = تعبير عالي. (C) التعبير مرنا من UCP1، علامة الحرارة في A. هذه البيانات هي من تجربة واحدة. تم إيداع بيانات snRNA-seq المستخدمة لهذه الأرقام في التعبير الجيني Omnibus (GEO) تحت الرقم GSE144720. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الجينات | الانواع | التمهيدي الأمامي | التمهيدي العكسي |
| Ucp1 (Intron-تحتوي على) | الماوس | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA TAG CAC CCA TTC C |
الجدول 1: تسلسلات التمهيدي لتحليل qPCR في الوقت الحقيقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تقديم طريقة واضحة وقوية لعزل النوى واحدة ودراسة عدم تجانس الأنسجة الدهنية. بالمقارنة مع تسلسل الحمض النووي الريبي الأنسجة بأكملها، يوفر هذا العمل وجهة نظر غير متحيزة من عدم تجانس الخلوية وعلامات السكان محددة. هذا أمر مهم ومبتكر من أجل النهوض بالأحياء الشحمية، والتمثيل الغذائي الجزيئي، وبحوث السمنة.
هذا البروتوكول هو الأمثل خاصة لتطبيق المصب من snRNA-seq. إن خطوة "التنظيف" لتحقيق عزل النوى الصحية مع فارز MoFlo XDP عالي السرعة تزيل تماماً الحطام والمجاميع من التعليق الخام مع الحفاظ على سلامة الغشاء النووي. لذلك ، هذا يزيد من كفاءة التقاط في تكوين القطرات ويسترد الآلاف من النسخ أحادية النوى من تشغيل واحد فقط دون فقدان عدد الجينات المكتشفة. بالإضافة إلى منصات الخلية الواحدة القائمة على القطرات ، والتي توفر عددًا أكبر من النوى أو الخلايا الفردية التي تم مسحها ، يمكن أيضًا استخدام الصوافت الصغير القائم على الفرز ومنصات FluidigmC1 15 للحصول على دقة أكبر وتغطية أكبر للنسخ16. لأن هذا العمل يوفر نوات عالية الجودة، يمكن إجراء مقايسات للكروماتين التي يمكن الوصول إليها من قبل نظام النوبات باستخدام التسلسل (أي تسلسل ATAC) مع الحد الأدنى من التعديلات على بروتوكول scATAC-seq الحالي17.
أحد القيود على هذا البروتوكول هو فقدان المعلومات من إزالة مقصورات غير النوويات، مثل الغشاء الخلوي الخلوي والخليوي. على سبيل المثال، الناشئة متعددة الوسائط وحيدة الخلية التحليلات18،19 التي في وقت واحد قياس التعبير البروتين غشاء الخلية و ينسخ لا يمكن تطبيقها على هذا البروتوكول.
والهدف في المستقبل هو الجمع بين هذا البروتوكول مع multixing nuclei باستخدام الأجسام المضادة الباركود20. سيتم فرز النوى من الأنسجة الدهنية المختلفة في ظل ظروف تجريبية مختلفة يتم إجراء الباركود وتجميعها باستخدام جسم مضاد معقد مضاد للمسام النووية وسيتم تنفيذ snRNA-seq. من خلال تسلسل هذه الباركود جنبا إلى جنب مع النسخ النووية، يمكن تعيين كل نواة لعينتها الأصلية، يمكن تحديد تعدد الالنماذج المتقاطعة بوضوح، ويمكن أن تكون الأنظمة القائمة على القطرات "محملة للغاية" لخفض التكلفة بشكل كبير لكل نواة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نود أن نشكر ديفيد رينولدز من جوهر ألبرت آينشتاين للجينوم وJinghang تشانغ من تدفق Cytometry الأساسية للدعم التقني. نحن نعترف بالدعم من المعاهد القومية للصحة (DK110426) ومنح تجريبية وجدوى من مركز آينشتاين ماونت سيناي لأبحاث السكري (DK020541)، ومركز نيويورك لبحوث السمنة (DK026687) (جميع إلى K.S.). ونود أيضا أن نشكر مركز ألبرت آينشتاين للسرطان (CA013330) على الدعم الأساسي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
