Summary
Denne publikation beskriver en protokol for isolering af kerner fra modne adipocytter, rensning ved fluorescensaktiveret sortering og enkeltcelleniveausekripteromics.
Abstract
Brunt og beige fedt er specialiserede fedtvæv, der spreder energi til termogenese ved UCP1 (Afkobling Protein-1)-afhængige og uafhængige veje. Indtil for nylig blev termogeniske adipocytter betragtet som en homogen population. Nylige undersøgelser har imidlertid vist, at der er flere undertyper eller delpopulationer, der er forskellige i udviklingsmæssig oprindelse, substratbrug og transskription. På trods af fremskridt inden for encellede genomforskning har uvildig nedbrydning af fedtvæv i cellulære undertyper været udfordrende på grund af den skrøbelige karakter af lipidfyldte adipocytter. Den fremlagte protokol blev udviklet for at omgå disse hindringer ved effektiv isolering af enkelte kerner fra fedtvæv til downstream-applikationer, herunder RNA-sekvensering. Cellulær heterogenitet kan derefter analyseres ved RNA-sekvensering og bioinformatikanalyser.
Introduction
Undersøgelser har vist, at brunt fedtvæv (BAT) har en bemærkelsesværdig evne til at sprede energi. Der findes to typer termogeniske adipocytter med forskellige udviklingsmæssige træk hos både gnavere og mennesker: beige adipocytter og klassiske brune adipocytter. Mens klassiske brune adipocytter er placeret for det meste i interscapular BAT depoter, beige adipocytter sporadisk dukke op i hvidt fedtvæv (WAT) som reaktion på visse fysiologiske signaler, såsom kronisk kold eksponering, en proces benævnt "bruning" eller "beiging". Ved hjælp af avanceret billeddannelse står det nu klart, at voksne mennesker har betydelige depoter af UCP1+ BAT, især i den supraclavicular region1,,2,,3,4. Mængden af voksne humane BAT omvendt korrelerer med adiposity og kan øges ved eksterne signaler, såsom kronisk kold eksponering5,,6 eller β3-adrenerge receptor agonist7. BAT-medieret energiforbrug kan være en holdbar tilgang til bekæmpelse af fedme.
Indtil for nylig er termogeniske adipocytter blevet betragtet som en homogen population. Undersøgelser har imidlertid vist, at der findes flere undertyper eller delpopulationer, der er forskellige i udviklingsmæssig oprindelse, substratbrug og transskription8,9,10. For eksempel, en type beige adipocyt, der fortrinsvis bruger glukose til termogenese, den g-beige adipocyt, blev for nylig beskrevet10. Den ufuldstændige forståelse af celletyper i brunt og beige fedtvæv og manglen på specifikke markører udgør en kritisk hindring for at studere deres biologiske funktioner.
Traditionelle metoder til at isolere delpopulationer af celler er baseret på ekspression af kun nogle få kendte markørgener. Nylige fremskridt inden for encellet genomforskning gør det muligt at anvende globale genekspressionsdata for enkelte celler for at give et objektivt skøn over antallet af delpopulationer i et væv. Det endelige mål med denne protokol er at bestemme alle fedtvævsundertyper under forskellige termogeniske stimuli ved en enkelt celleopløsning. I modsætning til andre væv og celletyper, bestemmelse cellulære undertyper af fedtvæv er udfordrende på grund af skrøbelighed lipid-fyldte adipocytter. Dette papir introducerer en robust protokol til at isolere enkelte kerner fra fedtvæv til downstream ansøgning til snRNA sekventering. Det er vigtigt, at den seneste litteratur, der sammenligner velmatchede single-nuclei RNA-sekvensering (snRNA-seq) og enkeltcelle-RNA-sekvensering (scRNA-seq) datasæt, viste, at snRNA-seq kan sammenlignes med scRNA-seq i celletypedetektion og overlegen i cellulær dækning for et komplekst væv som hjernen11. Denne protokol kombinerer en tæthed gradient centrifugering metode optimeret til fedtvæv af Rosen et al.12 med en kerne "oprydning" trin med en MoFlo XDP High Speed Sorter. Som det ses i de repræsentative resultater, en analyse af 7.500 enkelt kerner fra mus interscapular brun fedtvæv identificeret flere celletyper inden tilsyneladende homogene brune adipocytter. Samlet set kan denne enkle og robuste protokol anvendes til at studere væv-niveau organisering af adipocytter og fedt-hjemmehørende celler, identifikation af subtype-specifikke markør gener, og udvikling fænotypebestemmelse af fedt-selektiv knockout / transgene mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrepleje og eksperimenter blev udført i henhold til procedurer, der er godkendt af institutional animal care and use udvalg på Albert Einstein College of Medicine.
1. Forberedelse af vævsfordøjelse og lysisbuffere
- Forbered væv fordøjelse buffer.
- Forbered ~ 1 ml fordøjelse buffer for hvert gram fedtvæv.
- 1,5 U/ml collagenase D og 2,4 U/ml dispase II afvejes, og der tilsættes fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Forbered kerner forberedelse buffer (NPB).
- Der fremstilles 10 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumchlorid, 10 mM kaliumchlorid, 250 mM saccharose og 0,1% NP-40 i nukleasefrit vand. Bland godt. Saccharose kan tage længere tid at opløse end de andre komponenter.
- Klargør 0,5% bovin serum albumin (BSA) opløsning.
- Forbered 0,5% BSA i PBS indeholdende EDTA. Det anbefales at bruge steril filtreret cellekultur kvalitet PBS (se Tabel over Materialer).
2. Enzymatisk fordøjelse af fedtvæv
- Dissekere mus til at udtrække fedtvæv i henhold til Aune et al.13. Opsaml isoleret væv i en skål, der indeholder PBS. Overfør vævet til en køkkenrulle til at klappe tør. Derefter placeres vævet i en ren skål.
- Der tilsættes calciumchlorid til fordøjelsesbufferen til en endelig koncentration på 10 mM. Tilsæt en lille mængde fordøjelse buffer til fadet og grundigt hakke fedtet væv. Mængden af fordøjelsesbuffer, der kræves, vil være baseret på mængden af væv isoleret. Normalt ~ 1 ml eller mindre bruges.
- Der tilsættes ca. halvdelen af mængden af forberedt fordøjelsesbuffer (f.eks. ~10 ml for fem mus) til hakket væv. Prøven overføres med en serologisk pipette til et konisk centrifugerør på 50 ml. Der tilsættes eventuel resterende buffer til vask af skålen, og der overføres den til 50 ml, der indeholder prøven. Pipette op og ned flere gange. Inkuber derefter med omrystning ved 200-210 omdrejninger ved 37 °C i 12-15 min.
3. Adipocyt isolation
- Efter inkubationen tilsættes 0,5% BSA ved et 1:1-forhold til prøven. Bland godt ved pipettering op og ned flere gange. Prøven centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT) for at dreje den stromale vaskulære fraktion (SVF) ned. Adipocytbraktionen forbliver i prøvens øverste lag.
- Et 40 μm-cellefilter anbringes oven på et konisk centrifugerør på 50 ml, og prøven filtreres, det øverste lag opsamleres og efterlades bag svf'en i bunden af røret. Det øverste lag (adipocytfraktion) overføres til et nyt rør ved at vende filteret på hovedet over røret og bruge 0,5% BSA til at vende vaske filteret og opsamle prøven i røret.
- Det samlede volumen på 0,5% BSA bringes op og ned på 10-15 ml baseret på prøvestørrelse og pipette op og ned med en serologisk pipette eller rystes kortvarigt op og ned for at blande prøven. Prøven centrifugeres igen ved 300 x g i 5 min ved RT.
4. Nuklei isolation
- Brug en bred pipettespids, og overfør forsigtigt prøvens øverste lag til et 100 μm-cellefilter, der er placeret oven på et nyt forstoppet rør på is, og som efterlader eventuelle resterende SVF.
- Skyl/vask filteret med en tilstrækkelig mængde NPB, og kassér filteret. Fra dette skridt fremad har prøven på is så ofte som muligt og arbejde hurtigt for at undgå utætte og / eller usunde kerner. Det er nyttigt at prechill microcentrifuge rør, der skal anvendes i fremtidige trin på is.
- Prøven anbringes på is i højst 2 minutter med intermitterende, skånsom invertering af røret, så den blandes. Inkubationstiden på is skal optimeres til prøvestørrelse og type adipocytter. Centrifuge ved 1.000 x g ved 4 °C i 10 min.
- Supernatanten fjernes, og pelleten tages op igen i 1 ml NPB. Prøven overføres til et rent mikrocentrifugerør. Under overførslen skal du undgå at røre ved væggene i røret, som indeholder snavs og lipid. Der tilsættes 0,6 U/μL RNase-inhibitor til prøven, og der blandes. Centrifuge igen ved 1.000 x g ved 4 °C i 10 min.
BEMÆRK: Centrifugeringshastighed og -tid bør reduceres ved dette trin for mindre prøver. - Supernatanten fjernes og opslæmmes i 1 ml Nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS + 0,6 U/μL RNase-hæmmer).
- Dobbelt filter i et rent rør med stabelbare 30 μm filtre. Vask filter med et lille volumen (~300 μL) af Nuclei Wash Buffer. Alternativt kan du for mindre prøver bruge et 30 μm filter, der passer ind i et mikrocentrifugerør og filtreres direkte ind i det.
- Bekræft vellykket isolering af sunde kerner.
- Plette en lille aliquot af prøven med trypan og bruge en automatiseret celle tæller til at vurdere den gennemsnitlige døde størrelse og procent døde celler. Gennemsnitlig død størrelse for en prøve, der hovedsagelig indeholder kerner, bør ligge mellem 7-10 μm. Kernerstørrelse er normalt omkring 8 μm.
- Plette en lille aliquot af prøven med DAPI og undersøge under et mikroskop med en 20x mål eller højere. Den nukleare membran skal være intakt, og kernerne skal være runde.
5. FACS-oprydnings- og kernekoncentrationstrin
- Fortsæt straks til FACS trin for at rydde op i kerner og fjerne overskydende snavs. Indsamlingsbufferen skal indeholde Nuclei Wash Buffer. Under FACS fortyndes bufferen. Det er nyttigt at forberede en højere koncentration af BSA- og RNase-hæmmer for at tage højde for fortynding under sortering. FACS-indsamlingsblokken skal være i køletilstand.
- Efter sortering af kernerne centrifugeres der ved 500 x g i 5 min. ved 4 °C for at koncentrere prøven. Rekonstitueres i et passende volumen af Nuclei Wash Buffer for at opnå en koncentration på 500-1.500 kerner/μL. Forsøg ikke at fjerne alle supernatanten. Dette vil resultere i tab af kerner.
- Brug et hemocytometer og en DAPI-plettet aliquot til en endelig optælling og til at visualisere kernerne. Fortsæt derefter straks med snRNA-seq i henhold til producentens protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usorterede adipocytkerner indeholder snavs og doublets, der skaber støj og høj baggrund i downstream enkeltcelledeRNA-sekvensering. Den repræsentative FACS gate-strategi er vist i figur 1. Kernerne blev først udvalgt baseret på fremadgående scatter (FSC) og side scatter (SSC) (A), derefter blev der kun valgt singlets baseret på kombinationen af bredde og højder af SSC (B). Endelig blev kun DAPI-positive hændelser udvalgt og sorteret i indsamlingsbufferen (C). Denne arbejdsgang giver højt rensede enkeltkerner med minimerede nukleare aggregater og cellulære rester (Figur 2).
For at bekræfte integriteten af de sorterede kerner blev en lille aliquot af prøven inspiceret ved mikroskop efter DAPI-farvning. Den nukleare membran skal være intakt, og kernerne skal være runde (figur 2B). For at bekræfte rensningens succes anbefales det også at indsamle supernatant (dvs. indsamlingsbuffer) efter centrifugering og køre realtids qRT-PCR af et markørgen. Anvendelse af et primersæt (primersekvenser i tabel 1), der er designet til at forstærke den spirende, intronholdige UCP1, bekræftede, at supernatanten af sorterede kerner ikke indeholdt et påviseligt niveau af spirende Ucp1 mRNA (Figur 3). Dette trin kan gøres for andre markør gener meget rigelige i brun, beige, eller hvide adipocytter, såsom Cidea, Pgc1-a, Adipoq, eller Fabp4.
Nuclei isoleret og bekræftet gennem denne protokol kan underkastes stort set enhver enkelt celle niveau genekspression platform. Anvendelse af Chrom-platformen14 (10x Genomics) bestemte et transskription på 7.500 kerner fra interscapular brunt fedtvæv fra 8 uger gamle mandlige C57BL/6 mus (Figur 4). t-distribueret stokastiske nabo indlejring (t-SNE) dimensionalitet reduktion og K-midler klyngedannelse afslørede syv celletyper, herunder brune adipocytter, endotelceller, vægmaleri celler præget af Pdgfrb, adipocyt stamfæder, og immunceller. Alle klynger udtrykte Fabp4, et pan-adipocyt-gen, i varierende grad (figur 4B). En delmængde af klynger udtrykte et højt niveau af Ucp1 mRNA, mens andre klynger sporadisk udtrykte Ucp1 (Figur 4A,C). Dette er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse , der viser , at interscapular brun fedtvæv indeholder mindst to forskellige populationer med høj og lav Ucp1-ekspression og termogenisk aktivitet8,9.
Figur 1: Repræsentativ flowcytometrianalyse af kerner af MoFlo XDP High Speed Sorter. (A) Størrelse og granularitet. B) Påvisning af nukleare aggregater og multiplets. (C) Endelig sorteringsport, der kun vælger DAPI-positive hændelser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentativt billede af kerner isoleret fra brune adipocytter. (A) Før og (B) efter MoFLo XDP-sortering. Hvide pile i A angiver kerner uden en intakt membran. Vægtlinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Repræsentativt qRT-PCR-resultat for isolerede kerner og supernatanten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative 10x krom snRNA-seq-resultater for brune adipocytter isoleret fra 8 uger gamle mandlige C57BL/6 mus under RT. (A) t-SNE dimensionalitet reduktion og K-Means klyngedannelse for 7.500 kerner. k = 9. Kanoniske mærker, der bruges til klyngeanmærkninger, vises i parentes. (B) mRNA-udtryk for Fabp4, en adipocyt-selektiv markør, i A. Hvid = intet udtryk, rød = højt udtryk. cC) mRNA-udtryk for Ucp1, termogen markør i A. Disse data er fra et enkelt eksperiment. snRNA-seq-data, der blev anvendt til disse tal, blev deponeret i Gene Expression Omnibus (GEO) under superseries tiltrædelsesnummer GSE144720. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Gen | Arter | Fremadrettet primer | Omvendt primer |
| Ucp1 (Intron-holdige) | Musen | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA TAG CAC CCA TTC C |
Tabel 1: Primer sekvenser til real-time qPCR analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enkel og robust metode til at isolere enkelte kerner og studere fedtvæv heterogenitet præsenteres. Sammenlignet med hele væv RNA sekventering, denne arbejdsgang giver en upartisk visning af cellulære heterogenitet og befolkningsspecifikke markører. Dette er vigtigt og innovativt for fremme af adipocyt biologi, molekylær metabolisme, og fedme forskning.
Denne protokol er især optimeret til downstream anvendelse af snRNA-seq. Den "oprydning" skridt for at opnå isolering af sunde kerner med MoFlo XDP High Speed Sorter helt fjerner snavs og aggregater fra den rå suspension og samtidig opretholde nukleare membran integritet. Derfor øger dette fange effektiviteten i dråbeformationen og genvinder tusindvis af single-nuclei transskriptioner fra blot én kørsel uden tab af antallet af fundne gener. Ud over dråbebaserede enkeltcelleplatforme, som giver et større antal undersøgte enkeltkerner eller celler, kan sorteringsbaserede mikroplader og Fluidigm C1-platforme15 også bruges til at opnå større opløsning og dækning af transkriptionen16. Da denne arbejdsgang tilbyder kerner af høj kvalitet, kan analyser for transponeret chromatin ved hjælp af sekvensering (dvs. ATAC-sekvensering) også udføres med minimum ændringer af den eksisterende scATAC-seq protokol17.
En begrænsning af denne protokol er tab af oplysninger fra fjernelse af ikke-nukleare rum, såsom cytosol og cellulære membran. For eksempel kan nye multimodale enkeltcelleanalyser18,19, der samtidig måler cellemembranproteinudtryk og transskriptionen, ikke anvendes på denne protokol.,
Det fremtidige mål er at kombinere denne protokol med kerner multiplexing ved hjælp af stregkodede antistoffer20. Sorterede kerner fra forskellige fedtvæv under forskellige eksperimentelle forhold vil blive stregkodet og samlet ved hjælp af et antinuklear porekompleks antistof, og der vil blive udført snRNA-seq. Ved at sekventere disse stregkoder sammen med den nukleare transskription, kan hver kerne tildeles til sin oprindelige prøve, cross-sample multiplets kan tydeligt identificeres, og dråbe-baserede systemer kan være "super-loaded" for betydelig omkostningsreduktion pr kerner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke David Reynolds fra Albert Einstein Genomics kerne og Jinghang Zhang fra Flow Cytometry Core for teknisk support. Vi anerkender støtte fra National Institutes of Health (NIH) (DK110426) og Pilot og Feasibility Grants fra Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) og New York Obesity Research Center (DK026687) (alt sammen til K.S.). Vi vil også gerne takke Albert Einstein Cancer Center (CA013330) for kernestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
