Summary
Cette publication décrit un protocole pour l’isolement des noyaux des adipocytes matures, la purification par le tri activé par fluorescence, et la transcriptomique de niveau unicellulaire.
Abstract
Les graisses brunes et beiges sont des tissus adipeux spécialisés qui dissipent l’énergie pour la thermogenèse par ucp1 (Uncoupling Protein-1) --voies indépendantes. Jusqu’à récemment, les adipocytes thermogéniques étaient considérés comme une population homogène. Cependant, des études récentes ont indiqué qu’il existe plusieurs sous-types ou sous-populations qui sont distincts dans l’origine développementale, l’utilisation du substrat, et le transcriptome. Malgré les progrès de la génomique unicellulaire, la décomposition impartiale des tissus adipeux en sous-types cellulaires a été difficile en raison de la nature fragile des adipocytes remplis de lipides. Le protocole présenté a été développé pour contourner ces obstacles par l’isolement efficace des noyaux simples des tissus adipeux pour les applications en aval, y compris le séquençage de l’ARN. L’hétérogénéité cellulaire peut ensuite être analysée par séquençage de l’ARN et des analyses bioinformatiques.
Introduction
Des études ont montré que le tissu adipeux brun (BAT) a une capacité remarquable de dissiper l’énergie. Deux types d’adipocytes thermogéniques avec des caractéristiques développementales distinctes existent chez les rongeurs et les humains : les adipocytes beiges et les adipocytes bruns classiques. Alors que les adipocytes bruns classiques sont situés principalement dans les dépôts de BAT interscapulaires, les adipocytes beiges émergent sporadiquement dans le tissu adipeux blanc (WAT) en réponse à certains indices physiologiques, tels que l’exposition chronique au froid, un processus appelé « brunissement » ou « beiging ». Grâce à l’utilisation de l’imagerie avancée, il est maintenant clair que les humains adultes ont des dépôts substantiels de UCP1+ BAT, en particulier dans la région supraclaviciculaire1,2,3,4. La quantité de BAT humain adulte est inversement corrélée avec l’adiposité et peut être augmentée par des signaux externes, tels que l’exposition chronique au froid5,,6 ou β3-adrénergique récepteur agoniste7. Les dépenses énergétiques sous médiation du BAT peuvent offrir une approche viable pour lutter contre l’obésité.
Jusqu’à récemment, les adipocytes thermogéniques étaient considérés comme une population homogène. Cependant, des études ont révélé l’existence de plusieurs sous-types ou sous-populations distincts dans l’origine développementale, l’utilisation du substrat et le transcriptome8,9,10. Par exemple, un type d’adipocyte beige qui utilise de préférence le glucose pour la thermogenèse, l’adipocyte g-beige, a été récemment décrit10. La compréhension incomplète des types de cellules dans les tissus adipeux bruns et beiges et l’absence de marqueurs spécifiques constituent une barrière critique à l’étude de leurs fonctions biologiques.
Les méthodes traditionnelles d’isolement des sous-populations de cellules sont basées sur l’expression de quelques gènes marqueurs connus. Les progrès récents en génomique unicellulaire permettent l’utilisation de données d’expression génique globale de cellules uniques pour fournir une estimation impartiale du nombre de sous-populations dans un tissu. Le but ultime de ce protocole est de déterminer tous les sous-types de tissus adipeux sous divers stimuli thermogéniques à une résolution unicellulaire. Contrairement à d’autres tissus et types de cellules, la détermination des sous-types cellulaires du tissu adipeux est difficile en raison de la fragilité des adipocytes remplis de lipides. Cet article introduit un protocole robuste pour isoler les noyaux simples du tissu adipeux pour l’application en aval au séquençage de l’ARN. Fait important, la littérature récente comparant le séquençage de l’ARN uni-noyaux (snRNA-seq) et les ensembles de données de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ont révélé que le snRNA-seq est comparable au scRNA-seq dans la détection de type cellulaire, et supérieur dans la couverture cellulaire pour un tissu complexe comme le cerveau11. Ce protocole combine une méthode de centrifugation de gradient de densité optimisée pour les tissus adipeux par Rosen et al.12 avec une étape de « nettoyage » de noyaux avec un trieur à grande vitesse MoFlo XDP. Comme on le voit dans les résultats représentatifs, une analyse de 7 500 noyaux simples provenant du tissu adipeux brun intercapulaire de souris a identifié plusieurs types de cellules dans des adipocytes bruns apparemment homogènes. Dans l’ensemble, ce protocole simple et robuste peut être appliqué à l’organisation au niveau tissulaire des adipocytes et des cellules adipose-résidentes, à l’identification des gènes marqueurs spécifiques au sous-type et au phénotypage de développement des souris adipeuses sélectives par KO/transgéniques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les soins et l’expérimentation des animaux ont été effectués selon les procédures approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Albert Einstein College of Medicine.
1. Préparation des tampons de digestion des tissus et de lyse
- Préparer le tampon de digestion des tissus.
- Préparer ~1 mL de tampon de digestion pour chaque gramme de tissu adipeux.
- Peser 1,5 collagènease U/mL D et 2,4 U/mL dispase II et ajouter la solution saline tamponnée de phosphate (PBS).
- Préparer le tampon de préparation des noyaux (CNLC).
- Préparer 10 mM HEPES, 1,5 mM de chlorure de magnésium, 10 mM de chlorure de potassium, 250 mM de saccharose et 0,1 % de NP-40 dans de l’eau sans nucléase. Bien mélanger. Le saccharose peut prendre plus de temps à se dissoudre que les autres composants.
- Préparer une solution d’albumine de sérum bovin (BSA) à 0,5 %.
- Préparer 0,5 % de BSA en PBS contenant de l’EDTA. Il est recommandé d’utiliser la culture cellulaire filtrée stérile grade PBS (voir Tableau des matériaux).
2. Digestion enzymatique du tissu adipeux
- Disséquer les souris pour extraire le tissu adipeux selon Aune et al.13. Recueillir des tissus isolés dans un plat contenant du PBS. Transférer le tissu dans un essuie-tout pour le sécher. Ensuite, placez le tissu dans un plat propre.
- Ajouter du chlorure de calcium au tampon de digestion à une concentration finale de 10 mM. Ajouter un petit volume de tampon de digestion au plat et hacher soigneusement le tissu adipeux. Le volume de tampon de digestion requis sera basé sur la quantité de tissu isolé. Habituellement ~ 1 mL ou moins est utilisé.
- Ajouter environ la moitié de la quantité de tampon de digestion préparée (p. ex., ~10 mL pour cinq souris) au tissu haché. À l’aide d’une pipette sérologique, transférer l’échantillon dans un tube conique de 50 mL. Ajouter toute quantité restante de tampon pour laver le plat et transférer dans le tube de 50 ml contenant l’échantillon. Pipette de haut en bas plusieurs fois. Incuber ensuite en secouant à 200-210 tr/min à 37 °C pendant 12-15 min.
3. Isolement des adipocytes
- Après incubation, ajoutez 0,5 % de BSA à un ratio de 1:1 à l’échantillon. Bien mélanger en faisant monter et descendre plusieurs fois. Centrifuge l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à température ambiante (RT) pour faire tourner la fraction vasculaire stromale (SVF). La fraction d’adipocyte restera dans la couche supérieure de l’échantillon.
- Placez un filtre à cellules de 40 μm au-dessus d’un tube de centrifugeuse conique de 50 m L et filtrez l’échantillon, en recueillant la couche supérieure et en laissant derrière vous le SVF au fond du tube. Transférer la couche supérieure (fraction d’adipocyte) dans un nouveau tube en renversant le filtre à l’envers sur le tube et en utilisant 0,5% de BSA pour inverser le lavage du filtre et recueillir l’échantillon dans le tube.
- Porter le volume total de 0,5 % de BSA à 10-15 mL en fonction de la taille de l’échantillon et de la pipette de haut en bas avec une pipette sérologique ou secouer brièvement de haut en bas pour mélanger l’échantillon. Centrifuge de l’échantillon à nouveau à 300 x g pendant 5 min à RT.
4. Isolement des noyaux
- Utilisez une pointe de pipette à large forage et transférez soigneusement la couche supérieure de l’échantillon vers un filtre à cellules de 100 μm placé sur un nouveau tube préchilled sur la glace, laissant derrière vous tout SVF résiduel.
- Rincer/laver le filtre avec une quantité suffisante de CNLC et jeter le filtre. De ce pas en avant, ayez l’échantillon sur la glace aussi souvent que possible et travaillez rapidement pour éviter les noyaux qui fuient et/ou malsains. Il est utile de préchill tubes microcentrifuge à utiliser dans les prochaines étapes sur la glace.
- Placer l’échantillon sur la glace pendant pas plus de 2 min avec l’inversion douce intermittente du tube pour mélanger. Le temps d’incubation sur la glace doit être optimisé pour la taille de l’échantillon et le type d’adipocytes. Centrifugeuse à 1 000 x g à 4 °C pendant 10 min.
- Retirer le supernatant et resuspender le granulé dans 1 mL de la CNLC. Transférer l’échantillon dans un tube de microcentrifuge propre. Lors du transfert, évitez de toucher les parois du tube, qui contiennent des débris et des lipides. Ajouter l’inhibiteur de 0,6 RNase U/μL à l’échantillon et mélanger. Centrifugeuse à nouveau à 1000 x g à 4 °C pendant 10 min.
REMARQUE : La vitesse et le temps de centrifugement devraient être diminués à cette étape pour les échantillons plus petits. - Retirez le supernatant et resuspendez dans 1 mL de tampon de lavage de noyaux (2% BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase inhibiteur).
- Double filtre dans un tube propre avec des filtres empilables de 30 μm. Lavez le filtre avec un petit volume (~300 μL) de tampon de lavage de noyaux. Alternativement, pour les échantillons plus petits, utilisez un filtre de 30 μm qui s’insère dans un tube de microcentrifuge et filtrez directement dedans.
- Confirmez l’isolement réussi des noyaux sains.
- Tacher un petit aliquot de l’échantillon avec trypan et utiliser un compteur cellulaire automatisé pour évaluer la taille morte moyenne et pour cent de cellules mortes. La taille morte moyenne d’un échantillon contenant principalement des noyaux devrait varier entre 7 et 10 μm. La taille des noyaux est habituellement d’environ 8 μm.
- Tacher un petit aliquot de l’échantillon avec DAPI et examiner au microscope avec un objectif 20x ou plus. La membrane nucléaire doit être intacte et les noyaux doivent être ronds.
5. Étape de nettoyage et de concentration des noyaux FACS
- Passez immédiatement à l’étape facs pour nettoyer les noyaux et enlever tout débris excédentaire. La mémoire tampon de collecte doit contenir le tampon de lavage nuclei. Pendant le FACS, la mémoire tampon est diluée. Il est utile de préparer une concentration plus élevée d’inhibiteur de la BSA et de la RNase pour tenir compte de la dilution pendant le tri. Le bloc de collecte FACS doit être en mode de refroidissement.
- Après le tri des noyaux, la centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 °C pour concentrer l’échantillon. Reconstituer dans un volume approprié de tampon de lavage des noyaux pour atteindre une concentration de 500 à 1 500 noyaux/μL. N’essayez pas d’enlever tous les supernatants. Cela entraînera la perte de noyaux.
- Utilisez un hémocytomètre et un aiquot taché DAPI pour un décompte final et pour visualiser les noyaux. Ensuite, procéder immédiatement avec snRNA-seq selon le protocole du fabricant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les noyaux d’adipocytes non triés contiennent des débris et des doublets qui créent du bruit et un fond élevé dans le séquençage de l’ARN unicellulaire en aval. La stratégie représentative de porte FACS est indiquée à la figure 1. Les noyaux ont d’abord été sélectionnés en fonction de la diffusion vers l’avant (FSC) et de la dispersion latérale (SSC) (A),puis, seuls les singlets ont été sélectionnés en fonction de la combinaison de la largeur et des hauteurs de SSC (B). Enfin, seuls les événements positifs du DAPI ont été sélectionnés et classés dans la mémoire tampon de collecte (C). Ce flux de travail fournit des noyaux uniques hautement purifiés avec des agrégats nucléaires et des débris cellulaires réduits au minimum (Figure 2).
Pour confirmer l’intégrité des noyaux triés, un petit aliquot de l’échantillon a été inspecté au microscope après la coloration DAPI. La membrane nucléaire doit être intacte et les noyaux doivent être ronds (Figure 2B). Pour confirmer le succès de la purification, il est également recommandé de recueillir des supernatants (c’est-à-dire tampon de collecte) après centrifugation et exécuter en temps réel qRT-PCR d’un gène marqueur. L’utilisation d’un ensemble d’amorces (séquences d’amorces du tableau 1)conçu pour amplifier ucp1 naissant contenant de l’intron1 a confirmé que le supernatant des noyaux triés ne contenait pas de niveau détectable d’ARNm Ucp1 naissant (figure 3). Cette étape peut être faite pour d’autres gènes marqueurs très abondants dans les adipocytes bruns, beiges ou blancs, tels que Cidea, Pgc1-a, Adipoq, ou Fabp4.
Les noyaux isolés et confirmés grâce à ce protocole peuvent être soumis à pratiquement n’importe quelle plate-forme d’expression génique à un seul niveau cellulaire. L’utilisation de la plate-forme de chrome14 (10x Génomique) a déterminé un transcriptome de 7 500 noyaux provenant de tissus adipeux bruns interscapulaires provenant de souris C57BL/6 mâles de 8 semaines (figure 4). la réduction de la dimensionnalité et le regroupement des k-moyens ont révélé sept types de cellules, dont les adipocytes bruns, les cellules endothéliales, les cellules murales marquées par le Pdgfrb,les progéniteurs d’adipocytes et les cellules immunitaires. Tous les groupes ont exprimé Fabp4, un gène pan-adipocyte, à des degrés divers (Figure 4B). Un sous-ensemble de grappes a exprimé un niveau élevé d’ARNm Ucp1, tandis que d’autres grappes ont exprimé sporadiquement ucp1 (Figure 4A,C). Ceci est compatible avec une étude précédente montrant que le tissu adipeux brun intercapulaire contient au moins deux populations distinctes avec l’expression d’Ucp1 élevée et basse et l’activité thermogénique8,9.
Figure 1 : Analyse de cytométrie de débit représentative des noyaux par MoFlo XDP High Speed Sorter. (A) Taille et granularité. (B) Détection des agrégats et des multiplets nucléaires. (C) Porte de tri finale sélectionnant uniquement les événements positifs DAPI. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Image représentative des noyaux isolés des adipocytes bruns. (A) Avant et (B) après le tri MoFLo XDP. Les flèches blanches en A indiquent des noyaux sans membrane intacte. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 : Résultat qRT-PCR représentatif pour les noyaux isolés et le supernatant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Résultats représentatifs 10x chromium snRNA-seq pour les adipocytes bruns isolés de souris mâles C57BL/6 de 8 semaines sous RT. (A) réduction de dimensionnelle t-SNE et regroupement de K-Means pour 7 500 noyaux. k = 9. Les marqueurs canoniques utilisés pour les annotations de cluster s’affichent entre parenthèses. (B) expression d’ARNm de Fabp4, un marqueur adipocyte-sélectif, dans A. Blanc = aucune expression, rouge = haute expression. (C) expression d’ARNm d’Ucp1, marqueur thermogénique dans A. Ces données proviennent d’une seule expérience. les données snRNA-seq utilisées pour ces chiffres ont été déposées dans le Gene Expression Omnibus (GEO) sous le numéro d’adhésion des superséries GSE144720. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Gène | Espèces | Amorce avant | Amorce inversée |
| Ucp1 (contenant de l’intron) | Souris | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA TAG CAC CCA TTC C |
Tableau 1 : Séquences d’amorce pour l’analyse qPCR en temps réel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Une méthode simple et robuste pour isoler les noyaux simples et étudier l’hétérogénéité des tissus adipeux est présentée. Comparé au séquençage de l’ARN des tissus entiers, ce flux de travail offre une vue impartiale de l’hétérogénéité cellulaire et des marqueurs spécifiques à la population. Ceci est significatif et novateur pour l’avancement de la biologie des adipocytes, du métabolisme moléculaire et de la recherche sur l’obésité.
Ce protocole est particulièrement optimisé pour l’application en aval du snRNA-seq. L’étape de « nettoyage » pour parvenir à l’isolement des noyaux sains avec le Trieur à grande vitesse MoFlo XDP élimine complètement les débris et les agrégats de la suspension brute tout en maintenant l’intégrité de la membrane nucléaire. Par conséquent, cela augmente l’efficacité de capture dans la formation de gouttelettes et récupère des milliers de transcriptomes mononucléaires d’une seule course sans perte du nombre de gènes détectés. En plus des plates-formes unicellulaires à base de gouttelettes, qui fournissent un plus grand nombre de noyaux ou de cellules uniques étudiés, les plates-formes de tri à base de microplaque et de Fluidigm C115 peuvent également être utilisées pour obtenir une plus grande résolution et une plus grande couverture du transcriptome16. Étant donné que ce flux de travail offre des noyaux de haute qualité, les tests pour la chromatine transposée accessible à la chromatine utilisant le séquençage (c.-à-d. le séquençage ATAC) peuvent également être effectués avec des modifications minimales au protocole17scATAC-seq existant.
L’une des limites de ce protocole est la perte d’information provenant de l’enlèvement des compartiments non noyaux, tels que le cytosol et la membrane cellulaire. Par exemple, les analyses monocellulaires multimodales émergentes18,19 qui mesurent simultanément l’expression de protéine de membrane cellulaire et le transcriptome ne peuvent pas être appliquées à ce protocole.
L’objectif futur est de combiner ce protocole avec le multiplexage de noyaux à l’aide d’anticorps à code-barres20. Les noyaux triés de différents tissus adipeux dans différentes conditions expérimentales seront codés à barres et mis en commun à l’aide d’un anticorps complexe de pores antinucléaires et le snRNA-seq seront exécutés. En séquençant ces codes à barres à côté du transcriptome nucléaire, chaque noyaux peut être affecté à son échantillon d’origine, les multiplets à échantillons croisés peuvent être clairement identifiés, et les systèmes à base de gouttelettes peuvent être « superchargés » pour une réduction significative des coûts par noyaux.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier David Reynolds du noyau Albert Einstein Genomics et Jinghang Zhang du Flow Cytometry Core pour son soutien technique. Nous reconnaissons le soutien des National Institutes of Health (NIH) (DK110426) et des subventions pilotes et de faisabilité du Centre de recherche sur le diabète Einstein-Mount Sinai (DK020541) et du New York Obesity Research Center (DK026687) (tous à K.S.). Nous tenons également à remercier Albert Einstein Cancer Center (CA013330) pour le soutien de base.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
