Summary
Diese Veröffentlichung beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus ausgereiften Adipozyten, zur Reinigung durch fluoreszenzaktivierte Sortierung und zur einzelligen Transkriptomik.
Abstract
Braunes und beiges Fett sind spezialisierte Fettgewebe, die Energie für die Thermogenese durch UCP1 (Uncoupling Protein-1) abhängige und unabhängige Wege ableiten. Bis vor kurzem galten thermogene Adipozyten als homogene Population. Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass es mehrere Subtypen oder Subpopulationen gibt, die sich in Entwicklungsherkunft, Substratverwendung und Transkriptom unterscheiden. Trotz der Fortschritte in der einzelligen Genomik war die unvoreingenommene Zersetzung von Fettgeweben in zelluläre Subtypen aufgrund der zerbrechlichen Natur von lipidgefüllten Adipozyten eine Herausforderung. Das vorgestellte Protokoll wurde entwickelt, um diese Hindernisse durch eine effektive Isolierung einzelner Kerne aus Fettgewebe für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich der RNA-Sequenzierung, zu umgehen. Die zelluläre Heterogenität kann dann durch RNA-Sequenzierung und bioinformatische Analysen analysiert werden.
Introduction
Studien haben gezeigt, dass braunes Fettgewebe (BAT) eine bemerkenswerte Fähigkeit hat, Energie abzuleiten. Zwei Arten von thermogenen Adipozyten mit unterschiedlichen Entwicklungsmerkmalen existieren sowohl bei Nagetieren als auch beim Menschen: Beige-Adipozyten und klassische braune Adipozyten. Während sich klassische braune Adipozyten meist in interscapularen BVT-Depots befinden, entstehen beige adipozyten sporadisch in weißem Fettgewebe (WAT) als Reaktion auf bestimmte physiologische Hinweise, wie chronische Kälteexposition, ein Prozess, der als "Browning" oder "Beiging" bezeichnet wird. Durch den Einsatz von fortgeschrittener Bildgebung ist nun klar, dass erwachsene Menschen über erhebliche Depots von UCP1+ BAT verfügen, insbesondere in der supktoicularen Region1,2,3,4. Die Menge der erwachsenen menschlichen BAT korreliert umgekehrt mit Fettleibigkeit und kann durch externe Hinweise erhöht werden, wie chronische Kälteexposition5,6 oder 3-adrenergen Rezeptoragonisten7. DIE von BVT vermittelten Energieausgaben können einen praktikablen Ansatz zur Bekämpfung von Fettleibigkeit bieten.
Bis vor kurzem galten thermogene Adipozyten als homogene Population. Studien haben jedoch die Existenz mehrerer Subtypen oder Subpopulationen aufgedeckt, die sich in Entwicklungsherkunft, Substratnutzung und Transkriptom8,,9,10unterscheiden. Zum Beispiel wurde kürzlich eine Art von Beige-Adipozyten beschrieben, die bevorzugt Glukose für die Thermogenese verwendet, die g-beige adipocyte, vor kurzem10beschrieben. Das unvollständige Verständnis von Zelltypen in braunem und beigeem Fettgewebe und das Fehlen spezifischer Marker stellen ein kritisches Hindernis für die Untersuchung ihrer biologischen Funktionen dar.
Herkömmliche Methoden zur Isolierung von Subpopulationen von Zellen basieren auf der Expression nur einiger bekannter Markergene. Jüngste Fortschritte in der einzelzelligen Genomik ermöglichen die Verwendung globaler Genexpressionsdaten einzelner Zellen, um eine unvoreingenommene Schätzung der Anzahl der Subpopulationen in einem Gewebe zu liefern. Das Endziel dieses Protokolls ist es, alle Fettgewebe-Subtypen unter verschiedenen thermogenen Reizen in einer einzelzelligen Auflösung zu bestimmen. Im Gegensatz zu anderen Geweben und Zelltypen ist die Bestimmung zellulärer Subtypen von Fettgewebe aufgrund der Fragilität von lipidgefüllten Adipozyten eine Herausforderung. Dieses Papier führt ein robustes Protokoll ein, um einzelne Kerne aus Fettgewebe für die nachgeschaltete Anwendung zur SnRNA-Sequenzierung zu isolieren. Wichtig ist, dass aktuelle Literatur, die gut aufeinander abgestimmte Single-Nuklei-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) und einzellige RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) vergleicht, zeigte, dass snRNA-seq mit scRNA-seq in der Zelltyp-Detektion vergleichbar ist und in der zellulären Abdeckung für ein komplexes Gewebe wie das Gehirnüberlegen ist 11. Dieses Protokoll kombiniert eine Dichtegradientenzentrifugationsmethode, die von Rosen et al.12 für Fettgewebe optimiert wurde, mit einem "Cleanup"-Schritt der Kerne mit einem MoFlo XDP High Speed Sorter. Wie in den repräsentativen Ergebnissen zu sehen ist, identifizierte eine Analyse von 7.500 einzelnen Kernen aus dem interskapulären braunen Fettgewebe der Maus mehrere Zelltypen in scheinbar homogenen braunen Adipozyten. Insgesamt kann dieses einfache und robuste Protokoll angewendet werden, um die Organisation von Adipozyten und adipose-residenten Zellen auf Gewebeebene, die Identifizierung subtypspezifischer Markergene und die Entwicklung von Phänotypisierung von adipose-selektiven Knockout/transgenen Mäusen zu untersuchen.
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Protocol
Tierpflege und Experimente wurden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutionellen Tierpflege- und Nutzungsausschuss der Albert Einstein College of Medicine genehmigt wurden.
1. Vorbereitung von Gewebeverdauungs- und Lysepuffern
- Bereiten Sie den Gewebeverdauungspuffer vor.
- Bereiten Sie für jedes Gramm Fettgewebe einen Verdauungspuffer von 1 ml vor.
- 1,5 U/ml Kollagennase D und 2,4 U/ml Dispase II abwägen und Phosphatgepufferte Saline (PBS) hinzufügen.
- Vorbereiten des Kernvorbereitungspuffers (NPB).
- Bereiten Sie 10 mM HEPES, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 10 mM Kaliumchlorid, 250 mM Saccharose und 0,1% NP-40 in nukleasefreiem Wasser vor. Gut mischen. Saccharose kann mehr Zeit in Anspruch nehmen, um sich aufzulösen als die anderen Komponenten.
- Bereiten Sie 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) Lösung vor.
- 0,5% BSA in PBS mit EDTA-haltigem Ziel vorbereiten. Es wird empfohlen, sterilgefilterte Zellkultur-PBS zu verwenden (siehe Materialtabelle).
2. Enzymatische Verdauung von Fettgewebe
- Sezieren Sie Mäuse, um Fettgewebe nach Aune et al.13zu extrahieren. Sammeln Sie isoliertes Gewebe in einer Schüssel, die PBS enthält. Übertragen Sie das Gewebe auf ein Papiertuch, um trocken zu klopfen. Dann legen Sie das Gewebe in eine saubere Schale.
- Calciumchlorid in den Verdauungspuffer zu einer Endkonzentration von 10 mM geben. Fügen Sie ein kleines Volumen des Verdauungspuffers in die Schale und gründlich Hackfleisch das Fettgewebe. Das benötigte Volumen des Verdauungspuffers basiert auf der Menge des isolierten Gewebes. In der Regel werden 1 ml oder weniger verwendet.
- Fügen Sie etwa die Hälfte des vorbereiteten Verdauungspuffers (z. B. 10 ml für fünf Mäuse) in das gehackte Gewebe ein. Mit einer serologischen Pipette die Probe in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr übertragen. Fügen Sie eine beliebige verbleibende Menge an Puffer hinzu, um die Schale zu waschen und in das 50 ml-Rohr mit der Probe zu übertragen. Pipette mehrmals rauf und runter. Dann mit Schütteln bei 200-210 Rpm bei 37 °C für 12-15 min bebrüten.
3. Adipozyten-Isolierung
- Fügen Sie nach der Inkubation 0,5% BSA im Verhältnis 1:1 zur Probe hinzu. Mischen Sie gut, indem Sie mehrmals nach oben und unten. Zentrifuge die Probe bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT), um die stromale Gefäßfraktion (SVF) zu drehen. Der Adipozytenanteil verbleibt in der obersten Schicht der Probe.
- Legen Sie einen 40-m-Zellfilter auf ein 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr und filtern Sie die Probe, sammeln Sie die obere Schicht und lassen Sie den SVF an der Unterseite des Rohres zurück. Übertragen Sie die obere Schicht (Adipozytenfraktion) in ein neues Rohr, indem Sie den Filter auf den Kopf über das Rohr kippen und 0,5% BSA verwenden, um den Filter umzukehren und die Probe im Rohr zu sammeln.
- Bringen Sie das Gesamtvolumen von 0,5 % BSA auf 10-15 ml basierend auf Probengröße und Pipette nach oben und unten mit einer serologischen Pipette oder schütteln Sie kurz nach oben und unten, um die Probe zu mischen. Zentrifugieren Sie die Probe bei 300 x g für 5 min bei RT wieder.
4. Kernisolierung
- Verwenden Sie eine Breitbohrpipettenspitze und übertragen Sie vorsichtig die obere Schicht der Probe auf einen 100-m-Zellfilter, der auf einem neuen vorgekühlten Rohr auf Eis platziert wird, wodurch Rest-SVF zurückbleibt.
- Spülen/waschen Sie den Filter mit einer ausreichenden Menge NPB und entsorgen Sie den Filter. Von diesem Schritt vorwärts haben die Probe auf Eis so oft wie möglich und arbeiten schnell, um undichte und/oder ungesunde Kerne zu vermeiden. Es ist hilfreich, Mikrozentrifugenrohre vorzukühlen, die in zukünftigen Schritten auf Eis verwendet werden.
- Legen Sie die Probe auf Eis für nicht mehr als 2 min mit intermittierenden sanften Inverting der Röhre zu mischen. Die Inkubationszeit auf Eis sollte für die Probengröße und die Art der Adipozyten optimiert werden. Zentrifuge bei 1.000 x g bei 4 °C für 10 min.
- Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 1 ml NPB wieder auf. Übertragen Sie die Probe in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr. Vermeiden Sie beim Übertragen das Berühren der Wände des Rohres, die Schmutz und Lipid enthalten. Fügen Sie der Probe 0,6 U/L-RNase-Inhibitor hinzu und mischen Sie sie. Zentrifugieren Sie wieder bei 1.000 x g bei 4 °C für 10 min.
HINWEIS: Zentrifugationsgeschwindigkeit und -zeit sollten bei kleineren Proben in diesem Schritt verringert werden. - Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie sich in 1 ml Nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS + 0,6 U/L RNase-Inhibitor) wieder auf.
- Doppelfilter in ein Randrohr mit stapelbaren 30-mm-Filtern. Waschfilter mit einem kleinen Volumen (ca. 300 l) Nuclei Wash Buffer. Alternativ können Sie für kleinere Proben einen 30-mm-Filter verwenden, der in ein Mikrozentrifugenrohr passt und direkt hineinfiltert.
- Bestätigen Sie die erfolgreiche Isolierung gesunder Kerne.
- Färben Sie ein kleines Aliquot der Probe mit Trypan und verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die durchschnittliche totabgestorbene Größe und prozentuale abgestorbene Zellen zu bewerten. Die durchschnittliche Totgröße für eine Probe, die hauptsächlich Kerne enthält, sollte zwischen 7-10 m liegen. Die Größe der Kerne liegt in der Regel bei etwa 8 m.
- Färben Sie ein kleines Aliquot der Probe mit DAPI und untersuchen Sie unter dem Mikroskop mit einem 20-fachen Objektiv oder höher. Die Kernmembran sollte intakt sein und die Kerne sollten rund sein.
5. FACS Reinigungs- und Kernkonzentrationsschritt
- Gehen Sie sofort zum FACS-Schritt, um Die Kerne zu säubern und überschüssigen Schmutz zu entfernen. Der Auflistungspuffer sollte Nuclei Wash Buffer enthalten. Während FACS wird der Puffer verdünnt. Die Vorbereitung einer höheren Konzentration von BSA- und RNase-Inhibitoren zur Berücksichtigung der Verdünnung während der Sortierung ist hilfreich. Der FACS-Sammelblock sollte sich im Kühlmodus befinden.
- Nach dem Sortieren der Kerne zentrifugieren Sie bei 500 x g für 5 min bei 4 °C, um die Probe zu konzentrieren. Rekonstituieren Sie sich in einem geeigneten Volumen von Nuclei Wash Buffer, um eine Konzentration von 500-1.500 Kernen/L zu erreichen. Versuchen Sie nicht, alle Überstandzuerkennen zu entfernen. Dies führt zum Verlust von Kernen.
- Verwenden Sie ein Hämozytometer und ein DAPI-gefärbtes Aliquot für eine endgültige Zählung und um die Kerne zu visualisieren. Fahren Sie dann sofort mit snRNA-seq gemäß dem Herstellerprotokoll fort.
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Representative Results
Unsortierte Adipozytenkerne enthalten Trümmer und Doublets, die bei der nachgeschalteten einzelzelligen RNA-Sequenzierung Rauschen und hohen Hintergrund erzeugen. Die repräsentative FACS-Gate-Strategie ist in Abbildung 1dargestellt. Die Kerne wurden zuerst auf der Grundlage von Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) (A) ausgewählt, dann wurden nur Singlets auf der Grundlage der Kombination von Breite und Höhen von SSC (B) ausgewählt. Schließlich wurden nur DAPI-positive Ereignisse ausgewählt und in Denauflistungspuffer sortiert (C). Dieser Workflow bietet hochgereinigte Einzelkerne mit minimierten Kernaggregaten und zellulären Ablagerungen (Abbildung 2).
Um die Integrität der sortierten Kerne zu bestätigen, wurde ein kleines Aliquot der Probe nach DAPI-Färbung mit dem Mikroskop untersucht. Die Kernmembran sollte intakt sein und die Kerne sollten rund sein (Abbildung 2B). Um den Erfolg der Reinigung zu bestätigen, wird auch empfohlen, Überstand (d.h. Sammelpuffer) nach Zentrifugation zu sammeln und in Echtzeit qRT-PCR eines Markergens auszuführen. Die Verwendung eines Primer-Sets (Primersequenzen in Tabelle 1), das zur Verstärkung des entstehenden, intronhaltigen UCP1 entwickelt wurde, bestätigte, dass der Überstand sortierter Kerne keinen nachweisbaren Gehalt an entstehender Ucp1 mRNA enthielt (Abbildung 3). Dieser Schritt kann für andere Markergene durchgeführt werden, die in braunen, beigeoder oder weißen Adipozyten, wie Cidea, Pgc1-a, Adipoqoder Fabp4, sehr reichlich vorhanden sind.
Kerne, die durch dieses Protokoll isoliert und bestätigt werden, können praktisch jeder Single-Zell-Level-Genexpression-Plattform unterzogen werden. Die Verwendung der Chromium-Plattform14 (10x Genomics) ermittelte ein Transkriptom von 7.500 Kernen aus interscapularem braunem Fettgewebe von 8 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen (Abbildung 4). t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) Dimensionality Reduction and K-means clustering revealed seven cell types, including brown adipocytes, endothel cells, mural cells marked by Pdgfrb, adipocyte progenitors, and immune cells. Alle Cluster exprimierten Fabp4, ein Pan-Adipozyten-Gen, in unterschiedlichem Ausmaß (Abbildung 4B). Eine Teilmenge von Clustern drückte einen hohen Grad an Ucp1 mRNA aus, während andere Cluster sporadisch Ucp1 (Abbildung 4A,C) exprimierten. Dies steht im Einklang mit einer früheren Studie, die gezeigt hat, dass interscapuläres braunes Fettgewebe mindestens zwei verschiedene Populationen mit hoher und niedriger Ucp1-Expression und thermogener Aktivität8,9enthält.
Abbildung 1: Repräsentative Durchflusszytometrieanalyse von Kernen durch MoFlo XDP High Speed Sorter. (A) Größe und Granularität. (B) Nachweis von Kernaggregaten und Multiplets. (C) Endgültiges Sortiertor, das nur DAPI-positive Ereignisse auswählt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentatives Bild der aus braunen Adipozyten isolierten Kerne. (A) Vor undBnach moFLo XDP Sortierung. Weiße Pfeile in A zeigen Kerne ohne intakte Membran an. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentatives qRT-PCR-Ergebnis für isolierte Kerne und den Überstand. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative 10x Chrom snRNA-seq Ergebnisse für braune Adipozyten, die von 8 Wochen alten männlichen C57BL/6-Mäusen unter RT isoliert wurden. (A) t-SNE-Dimensionsreduktion und K-Means-Clustering für 7.500 Kerne. k = 9. Kanonische Marker, die für Clusteranmerkungen verwendet werden, werden in Klammern angezeigt. (B) mRNA-Expression von Fabp4, einem adipozytenselektiven Marker, in A. Weiß = kein Ausdruck, rot = hoher Ausdruck. (C) mRNA-Expression von Ucp1, thermogenem Marker in A. Diese Daten stammen aus einem einzigen Experiment. snRNA-seq-Daten, die für diese Zahlen verwendet wurden, wurden im Gene Expression Omnibus (GEO) unter der Superserien-Beitrittsnummer GSE144720 hinterlegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gen | Spezies | Vorwärtsgrundierung | Reverse Primer |
| Ucp1 (Intron-haltige) | Maus | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA TAG CAC CCA TTC C |
Tabelle 1: Primersequenzen für die QPCR-Echtzeitanalyse.
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Discussion
Es wird eine einfache und robuste Methode zur Isolierung einzelner Kerne und zur Untersuchung der Heterogenität des Fettgewebes vorgestellt. Im Vergleich zur Sequenzierung der gesamten Gewebe-RNA bietet dieser Workflow einen unvoreingenommenen Blick auf die zelluläre Heterogenität und populationsspezifische Marker. Dies ist signifikant und innovativ für die Weiterentwicklung der Adipozytenbiologie, des molekularen Stoffwechsels und der Adipositasforschung.
Dieses Protokoll ist speziell für die nachgeschaltete Anwendung von snRNA-seq optimiert. Der "Cleanup"-Schritt zur Isolierung gesunder Kerne mit dem MoFlo XDP High Speed Sorter entfernt vollständig Schmutz und Aggregate aus der rohen Suspension unter Beibehaltung der Integrität der Kernmembran. Daher erhöht dies die Erfassungseffizienz in der Tröpfchenbildung und erholt Tausende von Single-Nuklei-Transkriptomen aus nur einem Lauf ohne Verlust der Anzahl der nachgewiesenen Gene. Zusätzlich zu den tropfenbasierten Einzelzellenplattformen, die eine höhere Anzahl von untersuchten Einzelkernen oder Zellen bieten, können sorterbasierte Mikroplatten und Fluidigm C1-Plattformen15 auch verwendet werden, um eine höhere Auflösung und Abdeckung des Transkriptoms16zu erhalten. Da dieser Workflow hochwertige Kerne bietet, können assays für transposase-accessible chromatin mittels Sequenzierung (d.h. ATAC-Sequenzierung) auch mit minimalen Änderungen am vorhandenen scATAC-seq-Protokoll17durchgeführt werden.
Eine Einschränkung dieses Protokolls ist der Verlust von Informationen aus der Entfernung von nichtnuklearen Kompartimenten, wie z. B. Zytosol und Zellmembran. So können beispielsweise aufkommende multimodale einzellige Analysen18,19, die gleichzeitig die Zellmembranproteinexpression messen, und das Transkriptom nicht auf dieses Protokoll angewendet werden können.
Das zukünftige Ziel ist es, dieses Protokoll mit Kernmultiplexing mit Barcode-Antikörpern20zu kombinieren. Sortierte Kerne aus verschiedenen Fettgeweben unter verschiedenen experimentellen Bedingungen werden mit einem antinuklearen Porenkomplex-Antikörper und snRNA-seq gepoolt und gepoolt. Durch die Sequenzierung dieser Barcodes neben dem nuklearen Transkriptom kann jeder Kern seiner ursprünglichen Probe zugeordnet werden, Kreuzprobenmultipleten können eindeutig identifiziert werden, und Tröpfchen-basierte Systeme können "supergeladen" werden, um eine signifikante Kostensenkung pro Kerne zu erreichen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Wir danken David Reynolds vom Albert Einstein Genomics Core und Jinghang Zhang vom Flow Cytometry Core für die technische Unterstützung. Wir würdigen die Unterstützung der National Institutes of Health (NIH) (DK110426) und Pilot- und Machbarkeitsstipendien vom Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) und dem New York Obesity Research Center (DK026687) (alle nach K.S.). Wir danken auch Albert Einstein Cancer Center (CA013330) für die Kernunterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
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