Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד

Published: June 12, 2020 doi: 10.3791/61230
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Departments of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Departments of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Fleischer Institute of Diabetes and Metabolism

Summary

פרסום זה מתאר פרוטוקול לבידוד של גרעינים מאדיפוציטים בוגרים, טיהור על-ידי מיון המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית ורמת תא בודדת מופעלת.

Abstract

שומן חום ו-בז ' הם ברקמות אדיפוז מיוחדות המודקות את האנרגיה לתרמוגנזה על ידי UCP1 (חלבון בלתי מצמד-1)-שבילים תלויים ועצמאיים. עד לאחרונה, adipocytes התרמוגניים נחשבו לאוכלוסיה הומוגנית. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ישנם תתי-סוגי מספר או תת אוכלוסיות נפרדות ממוצא התפתחותי, שימוש במצע, ו transcript. למרות ההתקדמות בגנומיקה תא יחיד, התפרקות לא משוחדת של רקמות האדיפוז לתוך סוגי התאים הסלולריים כבר מאתגרת בגלל האופי השברירי של adipocytes מלא השומנים. הפרוטוקול המוצג פותח כדי לעקוף מכשולים אלה על ידי בידוד אפקטיבי של גרעין יחיד מרקמת האדיפוז עבור יישומי במטה, כולל רצפי RNA. טרוגניות הסלולר ניתן לנתח על ידי רצפי RNA וניתוחים ביולוגיים.

Introduction

מחקרים הראו כי רקמת השומן החום (BAT) יש יכולת יוצאת דופן לפרוק אנרגיה. שני סוגים של adipocytes התרמוגניים עם תכונות התפתחותיות ברורים להתקיים הן מכרסמים ובני אדם: אדיפוציטים בז ' ו הקלאסי חום. בעוד adipocytes חום קלאסי ממוקמים בעיקר בתוך מחסני עטלפים העטלף, בצבע אדיפוציטים בז ' מופיע ברקמת השומן הלבן (WAT) בתגובה לרמזים פיסיולוגיים מסוימים, כגון חשיפה כרונית קר, תהליך המכונה "בראונינג" או "בייגינג". באמצעות הדמיה מתקדמת, כעת ברור כי בני אדם בוגרים יש מחסני משמעותית של UCP1+ BAT, במיוחד באזור הגדול של1su, 1,2,3,4. כמות העטלף האנושי המבוגר מתואם בצורה מושלמת ויכול להיות מוגבר על ידי רמזים חיצוניים, כגון חשיפה כרונית לקור5,6 או β3-אדרררגיות קולטן אגוניסט7. ההוצאה האנרגטית של בת-תיווך עשויה להציע גישה מעשית ללוחמה בהשמנה.

עד לאחרונה, adipocytes התרמוגניים נחשבו לאוכלוסיה הומוגנית. עם זאת, מחקרים חשפו את קיומם של תת-סוגי או אוכלוסיות מרובות, כי הם ברורים ממוצא התפתחותי, שימוש במצע, ו transcript8,9,10. למשל, סוג של adipocyte בז ' כי מעדיפים בשימוש גלוקוז עבור התרמוגנזה, g-בז ' אדיפוציט, תיאר לאחרונה10. ההבנה הבלתי מלאה של סוגי התאים ברקמת השומן בחום ובבז ' והיעדר סמנים ספציפיים מהווים מכשול קריטי לחקר תפקודיו הביולוגיים.

שיטות מסורתיות לבידוד אוכלוסיות משנה של תאים מבוססות על ביטוי של רק כמה גנים הסמן הידוע. ההתקדמות האחרונה בגנומיקה של תא בודד מאפשרת את השימוש בנתוני הביטוי הגנטי הגלובלי של תאים בודדים כדי לספק אומדן לא משוחדת של מספר אוכלוסיות המשנה ברקמה. המטרה האולטימטיבית של פרוטוקול זה היא לקבוע את כל סוגי הרקמה האדיפוז תחת גירויים תרמוגניים שונים ברזולוציה של תא בודד. בניגוד לרקמות אחרות וסוגי תאים, קביעת תת-סוגי תאית של רקמת האדיפוז מאתגרת עקב שבריאת האדיפוציטים מלאות השומנים. נייר זה מציג פרוטוקול חזק כדי לבודד גרעינים בודדים מרקמת האדיפוז עבור יישום המטה לרצף snRNA. חשוב לעשות זאת, הספרות האחרונות השוואת התאמה היטב-גרעיני ברצף RNA (snRNA-seq) ו-תא יחיד ברצף RNA (scRNA-seq) datasets חשף כי snRNA-seq הוא המקבילה scRNA-seq בזיהוי סוג התא, ומעולה בכיסוי הסלולר עבור רקמה מורכבת כמו המוח11. פרוטוקול זה משלב מעבר הדרגתי צנטריפוגה שיטה ממוטבת עבור הרקמה האדיפוז על ידי רוזן ואח '12 עם גרעין "ניקוי" צעד עם מיון מהירות גבוהה של מופלו xdp. כפי שנראה תוצאות הנציג, ניתוח של 7,500 גרעיני יחיד מתוך העכבר רקמת שומן חום מזוהה מספר סוגי תאים בתוך adipocytes לכאורה חום הומוגנית. בסך הכל, פרוטוקול זה פשוט ויציב ניתן להחיל על המחקר ברמת רקמת הארגון של אדיפוציטים ותאים תושב אדיפוז, זיהוי של גנים סמן תת-סוג ספציפי, ופנוטיפים לפיתוח של אדיפוז-בררנית העכברים/טרנסגניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

טיפול בבעלי חיים וניסויים בוצעו על פי הליכים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים במכללת אלברט איינשטיין לרפואה.

1. הכנת מאגרי עיכול ולפירוק רקמות

  1. הכן את מאגר. העיכול לרקמות
    1. הכן ~ 1 מ ל של מאגר העיכול עבור כל גרם של רקמת השומן.
    2. שקול החוצה 1.5 U/mL קולוראז D ו 2.4 U/mL dispase II ולהוסיף מלוחים מאגור פוספט (PBS).
  2. הכן מאגר הכנה לגרעינים (NPB).
    1. הכינו 10 מ"מ HEPES, 1.5 מ"מ מגנזיום כלוריד, 10 מ"מ אשלגן כלוריד, 250 mM סוכות, ו 0.1% NP-40 במים ללא שכירות. . תערבב היטב סוכרוז עלולה להימשך זמן רב יותר מאשר הרכיבים האחרים.
  3. הכינו 0.5% בתמיסה של סרום (BSA).
    1. הכינו 0.5% BSA ב-PBS המכיל EDTA. מומלץ להשתמש מסונן מסוננים תרבות התא כיתה PBS (ראה טבלת חומרים).

2. העיכול האנזימטי של רקמת האדיפוז

  1. מנתחים עכברים כדי לחלץ רקמת אדיפוז על פי Aune ואח '13. לאסוף רקמה מבודדת בתבשיל המכיל PBS. להעביר את הרקמה למגבת נייר ללטף יבש. ואז למקם את הרקמה בתוך צלחת נקייה.
  2. הוסף סידן כלוריד לחוצץ העיכול לריכוז סופי של 10 מ"מ. הוסף נפח קטן של מאגר העיכול למנה והכה ביסודיות את רקמת השומן. הנפח של מאגר העיכול נדרש יהיה מבוסס על כמות רקמות מבודדים. בדרך כלל, נעשה שימוש ב-1 מ"ל או בפחות.
  3. הוסיפו כמחצית מכמות מאגר העיכול המוכן (למשל, ~ 10 מ"ל לחמישה עכברים) לרקמה הקצוצה. העבירו את הדגימה לצינור. הצנטריפוגה של 50 mL הוסף את כמות המאגר הנותרת כדי לשטוף את הצלחת ולהעביר לצינור 50 mL המכיל את המדגם. . הפיפטה עולה ויורד מספר פעמים לאחר מכן דגירה עם טלטול ב 200-210 rpm ב 37 ° צ' עבור 12-15 דקות.

3. בידוד אדיפוציט

  1. לאחר הדגירה, להוסיף 0.5% BSA ביחס 1:1 למדגם. מערבבים היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה מספר פעמים. צנטריפוגה את המדגם ב 300 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי לסובב את שבר כלי הדם סטרומה (svf). שבר adipocyte יישאר בשכבה העליונה של המדגם.
  2. מקום מסנן תא 40 יקרומטר על גבי שפופרת צנטריפוגה של 50 mL ומסנן את המדגם, איסוף השכבה העליונה ולהשאיר מאחורי svf בתחתית הצינור. העבר את השכבה העליונה (שבר adipocyte) לצינור חדש על ידי היפוך מסנן הפוך מעל הצינור באמצעות 0.5% BSA כדי להפוך לשטוף את המסנן ולאסוף את המדגם בצינור.
  3. הביאו את עוצמת הקול הכוללת של 0.5% BSA ל 10-15 mL בהתבסס על גודל המדגם והפיפטה למעלה ולמטה באמצעות מפית סרוולוגית או בקצרה לנער למעלה ולמטה כדי לערבב את המדגם. צנטריפוגה את המדגם שוב ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.

4. גרעיני בידוד

  1. השתמש בעצת פיפטה רחבה ובזהירות להעביר את השכבה העליונה של המדגם למסנן תא 100 יקרומטר ממוקם על גבי צינור חדש מקורר על הקרח, משאיר מאחורי כל שרידי svf.
  2. לשטוף/לשטוף את המסנן עם כמות מספיקה של NPB ולמחוק את המסנן. משלב זה קדימה יש את המדגם על קרח לעתים קרובות ככל האפשר ולעבוד במהירות כדי למנוע דליפה ו/או בריא גרעיני. זה מועיל כדי לצנן מיקרוצנטריפוגה צינורות לשמש בעתיד בצעדים על הקרח.
  3. מניחים את המדגם על הקרח עבור לא יותר 2 דקות עם היפוך עדין לסירוגין של הצינור לערבב. זמן הדגירה על הקרח צריך להיות מותאם עבור גודל דגימה וסוג של adipocytes. צנטריפוגה ב 1,000 x g ב 4 ° צ' עבור 10 דקות.
  4. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של NPB. העבר את הדגימה. לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי בעת העברת, להימנע מלגעת בקירות של הצינור, אשר מכילים פסולת ליפיד. הוסף 0.6 U/μL RNase מעכב למדגם ולערבב. צנטריפוגה שוב ב 1,000 x g ב 4 ° צ' עבור 10 דקות.
    הערה: יש להקטין את מהירות הצנטריפוגה והזמן בשלב זה עבור דגימות קטנות יותר.
  5. הסר את supernatant ולהשעות מחדש 1 מ ל של מאגר שטיפת גרעינים (2% BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase מעכב).
  6. מסנן כפול לתוך צינור נקי עם הערמה 30 יקרומטר מסננים. שטוף מסנן עם כרך קטן (~ 300 μL) של מאגר שטיפת גרעינים. לחילופין, עבור דגימות קטנות יותר, השתמש במסנן של 30 יקרומטר המתאים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה ומסנן ישירות לתוכו.
  7. אשר בידוד מוצלח של גרעינים בריאים.
    1. להכתים מונה קטן של המדגם עם טרימין ולהשתמש במונה תאים אוטומטיים כדי להעריך גודל ממוצע מתים ואחוז תאים מתים. גודל ממוצע מת עבור מדגם המכיל בעיקר גרעינים צריך לנוע בין 7-10 μm. גודל גרעינים הוא בדרך כלל סביב 8 μm.
    2. כתם מדגם קטן של המדגם עם DAPI ובדוק תחת מיקרוסקופ עם מטרה 20x או גבוה יותר. הקרום הגרעיני אמור להיות שלם. והגרעינים צריכים להיות עגולים

5. מכונות ניקוי והגרעין של FACS

  1. המשך מיד לשלב ה-FACS כדי לנקות את הגרעינים ולהסיר את כל הפסולת העודפת. מאגר האוסף צריך להכיל מאגר שטיפת גרעינים. במהלך FACS המאגר מדולל. הכנת ריכוז גבוה יותר של BSA ו-RNase מעכב לחשבון עבור דילול במהלך המיון הוא מועיל. בלוק האיסוף של FACS צריך להיות במצב קירור.
  2. לאחר מיון גרעינים, צנטריפוגה ב 500 x g עבור 5 דקות ב 4 ° צ' כדי לרכז את המדגם. מהווים כמות מתאימה של מאגר שטיפת גרעינים כדי להשיג ריכוז של 500-1500 גרעינים/μL. אל תנסו להסיר את כל הסופרנטאנט. פעולה זו תגרום לאבדן גרעינים.
  3. השתמש בהוציטומטר ומוכתם DAPI לספירה סופית ולדמיין את הגרעינים. לאחר מכן המשך מיד עם snRNA-seq לפי פרוטוקול היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

גרעיני adipocyte ללא מיון מכילים פסולת ו doublets ליצור רעש ורקע גבוה במורד הזרם ברצף RNA של תא יחיד. אסטרטגיית שער ה-FACS הייצוגית מוצגת באיור 1. הגרעינים נבחרו לראשונה בהתבסס על פיזור הקדמי (FSC) ופיזור בצד (למעלה) (א), אז, רק סינגטים נבחרו בהתבסס על שילוב של רוחב וגבהים של מדינת האס. אס. אס (ב). לבסוף, רק אירועים DAPI-חיוביים נבחרו וממוינים לתוך מאגר אוסף (C). זרימת עבודה זו מספקת מאוד מטוהרים גרעין יחיד עם ממוזער אגרגטים גרעיניים ופסולת סלולרית (איור 2).

כדי לאשר את השלמות של גרעין ממוין, מדגם קטן של המדגם נבדק על ידי מיקרוסקופ לאחר צביעת DAPI. הממברנה הגרעינית צריכה להיות שלמה והגרעינים צריכים להיות עגולים (איור 2ב). כדי לאשר את הצלחת הטיהור, מומלץ גם לאסוף סופרנטאנט (כלומר, מאגר גבייה) לאחר צנטריפוגה ולהפעיל רביעיית בזמן אמת-PCR של גן סמן. השימוש בקבוצה תחל (רצפים תחל בטבלה 1) שנועד להגביר את המתהווה, intron המכיל UCP1, אישר את supernatant של גרעינים ממוינים לא מכילים רמה לזיהוי של המתהווה UCP1 mrna (איור 3). שלב זה יכול להיעשות עבור גנים סמן אחרים בשפע בחום, בז ', או adipocytes לבן, כגון Cidea, Pgc1-a, Adipocytes, או Fabp4.

גרעינים מבודדים ואישר את הפרוטוקול הזה יכול להיות נתון כמעט כל תא יחיד ברמת ביטוי גנטי פלטפורמת. השימוש בפלטפורמת כרום14 (גנומיקה של 10x) קבע הטרנססקריפט של 7,500 גרעיני מרקמת השומן החום הבין-שבועי של גבר בן 8 C57BL/6 עכברים (איור 4). t-הפצת שכנים סטוכסטיים שכנו (t-SNE) הפחתה מימדית ו-K-אמצעי האשכולות חשף שבעה סוגי תאים, כולל adipocytes חום, תאים אנדותל, תאי קיר המסומנים על ידי Pdgfrb, adipocyte ושלתי, ותאים חיסוניים. כל האשכולות הביעו Fabp4, גן פאן-אדיפוציט, לתארים שונים (איור 4ב'). תת-ערכה של אשכולות הביעה רמה גבוהה של Ucp1 mrna, בעוד שאשכולות אחרים מבוטאים בUcp1 (איור 4א, ג). זה מתאים למחקר הקודם מראה כי רקמת השומן בראון חום מכיל לפחות שתי אוכלוסיות נפרדות עם Ucp1 ביטוי גבוהה ונמוך ופעילות תרמוגניים8,9.

Figure 1
איור 1: הנציג זרימה cy, לנסות הניתוח של גרעינים על ידי מסדר מהירות גבוהה של מופלו XDP. (A) גודל וצפיפות רשת. (ב) איתור אגרגטים גרעיניים ומרובים. (ג) שער מיון סופי בחירת אירועים dapi-חיוביים בלבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דמות מייצגת של גרעינים מבודדים adipocytes חום. (א) לפני ו (ב) לאחר מיון מופלו xdp. חיצים לבנים בתוך מציין גרעין ללא קרום שלם. סרגל בקנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: רביעיית הנציגים-PCR מהווה תוצאה של גרעינים מבודדים והסופרנטאנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הנציג 10x כרום snRNA-seq תוצאות עבור adipocytes חום מבודד 8-שבוע בן זכר C57BL/6 עכברים תחת RT. (א) הפחתת ממדי ממד t-sne ו-K-פירושו באשכולות עבור 7,500 גרעינים. k = 9. סמנים קנוניים המשמשים עבור ביאורי אשכול מוצגים בסוגריים. (ב) mrna ביטוי של Fabp4, סימון בררני-אדיפוציט, ב- A. לבן = ללא ביטוי, אדום = ביטוי גבוה. (ג) mrna ביטוי של Ucp1, סמן תרמוגניים ב. הנתונים האלה הם מניסוי אחד. snRNA-seq נתונים המשמשים עבור נתונים אלה הופקד ב-ביטוי גנים אומניבוס (GEO) תחת מספר ההצטרפות הצטרפות סופר GSE144720. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

ג'ין ינים פריימר קדימה פריימר הפוכה
Ucp1 (אינטרון המכיל) עכבר גת CTT CTC מג CTT CCT TCC TAA תג CCT אמנות עכשווית TTC C

שולחן 1: פריימר רצפים עבור ניתוח qPCR בזמן אמת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטה פשוטה ואיתנה כדי לבודד גרעינים בודדים ולחקור את הטרוגניות רקמות מוצג. בהשוואה לרצף שלמות RNA רקמה, זרימת עבודה זו מציעה תצוגה משוחדת של טרוגניות הסלולר סמנים ספציפיים לאוכלוסיה. זה משמעותי וחדשני לקידום ביולוגיה adipocyte, חילוף חומרים מולקולרי, ומחקר השמנת יתר.

פרוטוקול זה מותאם במיוחד עבור יישום במטה של snRNA-seq. "ניקוי" צעד כדי להשיג בידוד של גרעינים בריאים עם מונה מהירות גבוהה של MoFlo XDP לחלוטין מסיר פסולת ואגרגטים מן ההשעיה הגס תוך שמירה על שלמות הקרום הגרעיני. לכן, זה מגביר את יעילות לכידת ב-droplet היווצרות ומשחזרת אלפי גרעיני יחיד transcript מתוך לרוץ אחד בלבד ללא אובדן של מספר הגנים שזוהו. בנוסף ל-droplet מבוסס-תא בודד פלטפורמות, אשר מספקים מספר גבוה של סקר גרעיני או תאים בודדים, מיקרו-מערכות מבוססי מיון ו Fluidigm C1 פלטפורמות15 יכול לשמש גם כדי להשיג רזולוציה יותר וכיסוי של הטרנססקריפט16. מכיוון שזרימת עבודה זו מציעה גרעינים באיכות גבוהה, בחני מאמר עבור כרומטוטין נגיש באמצעות רצף (כלומר, ברצף atac-רצפי) ניתן לבצע גם עם שינויים מינימליים עלהפרוטוקולהקיים של מיזוג האוויר.

מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא אובדן של מידע מפני הסרת תאים גרעיניים, כמו ציטוסול וקרום הסלולר. לדוגמה, המתעוררים ניתוח תא בודד מרובה מודאלי18,19 שבהם זמנית למדוד ביטוי חלבון קרום הממברנה ואת transcript לא ניתן להחיל על פרוטוקול זה.

המטרה העתידית היא לשלב את הפרוטוקול הזה עם ריבוב גרעינים באמצעות נוגדנים מקודד20. גרעיני מיון מתוך רקמות שונות של אדיפוז בתנאים ניסיוניים שונים יהיה ברור במאגר באמצעות נוגדן מורכבים הנקבובית הנקבוביות snRNA-seq תתבצע. על-ידי סידור ברקודים אלה לצד הטרנססקריפט הגרעיני, ניתן להקצות לכל גרעין את המדגם המקורי שלה, מרובת המדגם החוצה ניתן לזהות בבירור, ו מערכות מבוססות droplet יכול להיות "סופר טעון" עבור הפחתת עלות משמעותית לכל גרעינים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgments

אנחנו רוצים להודות לדיויד ריינולדס מליבת אלברט איינשטיין גנומיקה ו Jinghang ג'אנג מן זרם Cy, ליבה לתמיכה טכנית. אנו מכירים את התמיכה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) (DK110426) ומענקי פיילוט והיתכנות מהמרכז לחקר הסוכרת של איינשטיין הר סיני (DK020541), ניו יורק מרכז מחקר השמנת יתר (DK026687) (כולם כדי K.S.). אנחנו גם רוצים להודות לאלברט איינשטיין סרטן המרכז (CA013330) לתמיכה בליבה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 PBS with EDTA; sterile-filtered
BSA Sigma A1595
CaCl2 Sigma 21115
Cell filter 100 μm Corning 431752
Cell filter 40μm Corning 431750
CellTrics (30 μm) Sysmex 04-004-2326
Collagenase D Roche 11088866001
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
DAPI Sigma D9542
Dispase II Roche 4942078001
HEPES Sigma H4034
KCl Fisher P217-3
MACS SmartStrainers (30 µm) Miltenyi Biotec 130-098-458 Stackable filters
MgCl2 Sigma M1028
MoFloXDP Cell Sorter Beckman Coulter ML99030
NP-40 Sigma 74385
Protector RNase Inhibitor Roche 3335402001
Sucrose Fisher S5-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
  2. van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
  3. Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
  4. Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
  5. Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
  6. Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
  7. Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
  8. Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
  9. Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
  10. Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
  11. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
  12. Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  13. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
  14. Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
  15. Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
  16. Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
  17. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
  18. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  19. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).

Tags

גנטיקה סוגיה 160 אדיפוציטוטה תרמוגנזה סוכרת גנומיקה ביוכימיה מטבוליזם
בידוד של שאדיפוז של גרעיני הרקמה עבור יישומים גנומית של תא יחיד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Benitez, G. J., Shinoda, K.… More

Benitez, G. J., Shinoda, K. Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications. J. Vis. Exp. (160), e61230, doi:10.3791/61230 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter