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Genetics

एकल सेल जीनोमिक अनुप्रयोगों के लिए Adipose ऊतक नाभिक का अलगाव

Published: June 12, 2020 doi: 10.3791/61230
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Departments of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Departments of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 3Fleischer Institute of Diabetes and Metabolism

Summary

यह प्रकाशन परिपक्व एडिपोसाइट्स से नाभिक के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, फ्लोरेसेंस-सक्रिय छंटाई द्वारा शुद्धि, और एकल-कोशिका स्तर ट्रांसक्रिप्टोमिक्स।

Abstract

ब्राउन और बेज वसा विशेष एडीपोज ऊतक हैं जो UCP1 (अनकोपलिंग प्रोटीन-1) द्वारा थर्मोजेनेसिस के लिए ऊर्जा को नष्ट करते हैं- निर्भर और स्वतंत्र रास्ते। हाल ही में जब तक, थर्मोजेनिक एडिपोसाइट्स को एक सजातीय आबादी माना जाता था। हालांकि, हाल के अध्ययनों से संकेत मिला है कि कई उपप्रकार या उप-आबादी हैं जो विकासात्मक मूल, सब्सट्रेट उपयोग और ट्रांसक्रिप्टोम में अलग हैं। एकल कोशिका जीनोमिक्स में प्रगति के बावजूद, लिपिड से भरे आदिपोसाइट्स की नाजुक प्रकृति के कारण सेलुलर उपप्रकारों में आदिपोज ऊतकों का निष्पक्ष अपघटन चुनौतीपूर्ण रहा है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल आरएनए अनुक्रमण सहित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए एडिपोस ऊतक से एकल नाभिक के प्रभावी अलगाव द्वारा इन बाधाओं को दरकिनार करने के लिए विकसित किया गया था । सेलुलर विषमता तो आरएनए अनुक्रमण और जैव सूचना विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।

Introduction

अध्ययनों से पता चला है कि भूरे रंग के एडीपोज ऊतक (बैट) में ऊर्जा को नष्ट करने की उल्लेखनीय क्षमता है। कृंतक और मनुष्यों दोनों में अलग-अलग विकासात्मक विशेषताओं के साथ थर्मोजेनिक एडिपोसाइट्स के दो प्रकार मौजूद हैं: बेज एडिपोसाइट्स और शास्त्रीय भूरे रंग के एडिपोसाइट्स। जबकि शास्त्रीय भूरे रंग के एडिपोसाइट्स ज्यादातर इंटरस्केपुलर बैट डिपो में स्थित होते हैं, बेज एडिपोसाइट्स कुछ शारीरिक संकेतों के जवाब में सफेद एडीपोज ऊतक (वाट) में कई मायनों में उभरते हैं, जैसे कि क्रोनिक कोल्ड एक्सपोजर, एक प्रक्रिया जिसे "ब्राउनिंग" या "बेजिंग" के रूप में जाना जाता है। उन्नत इमेजिंग के उपयोग के माध्यम से, अब यह स्पष्ट है कि वयस्क मनुष्यों में UCP1+ BAT के पर्याप्त डिपो हैं, विशेष रूप से सुपरक्लेविकुलर क्षेत्र1,,2,,3,,4में। वयस्क मानव चमगादड़ की मात्रा विपरीत रूप से आदिपोसिटी से संबंधित है और बाहरी संकेतों से बढ़ सकती है, जैसे क्रोनिक कोल्ड एक्सपोजर5,,6 या ए3-एड्रेनेरिक रिसेप्टर एगोनिस्ट7। बैट-मध्यस्थता ऊर्जा व्यय मोटापे से निपटने के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है ।

हाल ही में जब तक थर्मोजेनिक एडिपोसाइट्स को सजातीय आबादी माना जाता रहा है। हालांकि, अध्ययनों से कई उपप्रकारों या उपजनसंख्याओं के अस्तित्व का पता चला है जो विकासात्मक मूल, सब्सट्रेट उपयोग और,ट्रांसक्रिप्टोम8,,9,10में अलग हैं। उदाहरण के लिए, बेज एडिपोसिट का एक प्रकार जो अधिमानत थर्मोजेनेसिस के लिए ग्लूकोज का उपयोग करता है, जी-बेज एडिपोसिट, हाल ही में10वर्णित किया गया था। भूरे और बेज एडीपोज ऊतक में सेल प्रकारों की अधूरी समझ और विशिष्ट मार्कर की कमी उनके जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा का गठन करती है।

कोशिकाओं की उपआबादी को अलग करने के लिए पारंपरिक तरीके केवल कुछ ज्ञात मार्कर जीन की अभिव्यक्ति पर आधारित हैं। एकल सेल जीनोमिक्स में हाल ही में प्रगति एक ऊतक में उपजनसंख्या की संख्या का एक निष्पक्ष अनुमान प्रदान करने के लिए एकल कोशिकाओं के वैश्विक जीन अभिव्यक्ति डेटा के उपयोग में सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल का अंतिम लक्ष्य एक एकल कोशिका संकल्प पर विभिन्न थर्मोजेनिक उत्तेजनाओं के तहत सभी एडीपोज ऊतक उपप्रकारों का निर्धारण करना है। अन्य ऊतकों और कोशिका प्रकारों के विपरीत, लिपिड से भरे एडिपोसाइट्स की कमजोरी के कारण एडिपोस ऊतक के सेलुलर उपप्रकार का निर्धारण चुनौतीपूर्ण है। यह पेपर एक मजबूत प्रोटोकॉल का परिचय देता है ताकि एक नाभिक को डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन से snRNA अनुक्रमण के लिए एडीपोज ऊतक से अलग किया जा सके। महत्वपूर्ण बात, हाल ही में अच्छी तरह से मिलान एकल नाभिक आरएनए अनुक्रमण (snRNA-seq) और एकल सेल आरएनए अनुक्रमण (scRNA-seq) डेटासेट की तुलना में पता चला है कि snRNA-seq सेल प्रकार का पता लगाने में scRNA-seq के बराबर है, और मस्तिष्क11की तरह एक जटिल ऊतक के लिए सेलुलर कवरेज में बेहतर है । यह प्रोटोकॉल रोसेन एट अल द्वारा एडीपोज ऊतकों के लिए अनुकूलित घनत्व ढाल अपकेंद्रित्र विधि को जोड़ती है।12 में मोफ्लो एक्सडीपी हाई स्पीड सॉर्टर के साथ नाभिक "क्लीनअप" कदम था। जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों में देखा गया है, माउस इंटरस्केपुलर ब्राउन एडिपोस ऊतक से 7,500 एकल नाभिक का विश्लेषण प्रतीत होता है सजातीय भूरे रंग के एडिपोसाइट्स के भीतर कई सेल प्रकारों की पहचान की गई। कुल मिलाकर, इस सरल और मजबूत प्रोटोकॉल को एडिपोसाइट्स और एडिपोस-निवासी कोशिकाओं के ऊतक-स्तरीय संगठन, उपप्रकार-विशिष्ट मार्कर जीन की पहचान, और आदिपोस-चयनात्मक नॉकआउट/ट्रांसजेनिक चूहों के विकास फेनोटाइपिंग का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

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Protocol

पशु देखभाल और प्रयोग अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार किया गया ।

1. ऊतक पाचन और लाइसिस बफ़र्स की तैयारी

  1. ऊतक पाचन बफर तैयार करें।
    1. एडीपोज टिश्यू के हर ग्राम के लिए पाचन बफर के ~ 1 एमएल तैयार करें।
    2. १.५ यू/एमएल कोलेजनस डी और २.४ यू/एमएल डिस्पास II का वजन करें और फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) जोड़ें ।
  2. नाभिक तैयारी बफर (एनपीबी) तैयार करें।
    1. नाभिक मुक्त पानी में 10 एमएम एचईपीई, 1.5 मीटर मैग्नीशियम क्लोराइड, 10 एमएम पोटेशियम क्लोराइड, 250 एमएम सुक्रोज और 0.1% एनपी-40 तैयार करें। अच्छी तरह मिलाएं। सुक्रोज को अन्य घटकों की तुलना में भंग होने में अधिक समय लग सकता है।
  3. 0.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) समाधान तैयार करें।
    1. ईडीटीए युक्त पीबीएस में 0.5% बीएसए तैयार करें। बाँझ-फ़िल्टर सेल कल्चर ग्रेड पीबीएस (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

2. एडिपोस ऊतक का एंजाइमेटिक पाचन

  1. औने एट अल13के अनुसार एडिपोस ऊतक निकालने के लिए चूहों को विच्छेदन करें। पीबीएस युक्त पकवान में अलग-थलग ऊतक ले लीजिए। ऊतक को एक कागज तौलिया में स्थानांतरित करने के लिए सूखी पैट । इसके बाद टिश्यू को साफ डिश में रखें।
  2. 10 mm की अंतिम एकाग्रता के लिए पाचन बफर में कैल्शियम क्लोराइड जोड़ें। पकवान में पाचन बफर की एक छोटी मात्रा जोड़ें और अच्छी तरह से आदिपोज ऊतक कीमा । पाचन बफर की मात्रा अलग ऊतक की मात्रा पर आधारित होगी। आमतौर पर ~1 एमएल या उससे कम का उपयोग किया जाता है।
  3. कीमा बनाया हुआ ऊतक करने के लिए तैयार पाचन बफर (उदाहरण के लिए, पांच चूहों के लिए ~ 10 एमएल) की मात्रा का लगभग आधा जोड़ें। एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, नमूने को 50 एमएल शंकुकीय सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। पकवान धोने और नमूना युक्त 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए बफर की किसी भी शेष राशि जोड़ें। कई बार ऊपर और नीचे पिपेट। फिर 200-210 आरपीएम पर 12-15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए के साथ इनक्यूबेट।

3. एडिपोसिट आइसोलेशन

  1. इनक्यूबेशन के बाद, नमूने में 1:1 अनुपात पर 0.5% बीएसए जोड़ें। कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। स्ट्रोमल वैस्कुलर अंश (एसवीएफ) को स्पिन करने के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर नमूना अपकेंद्रित्र करें। एडिपोसाइट अंश नमूने की शीर्ष परत में रहेगा।
  2. एक 50 एमएल शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब के शीर्ष पर एक 40 माइक्रोन सेल फिल्टर रखें और नमूना फ़िल्टर करें, शीर्ष परत को इकट्ठा करें और ट्यूब के नीचे एसवीएफ को पीछे छोड़ दें। ट्यूब पर फिल्टर को उल्टा फ्लिप करके और फिल्टर को रिवर्स करने और ट्यूब में नमूना एकत्र करने के लिए 0.5% बीएसए का उपयोग करके शीर्ष परत (एडीपोसाइट अंश) को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. नमूना आकार और पिपेट के आधार पर 0.5% बीएसए की कुल मात्रा को 10-15 एमएल तक लाएं और नमूना मिश्रण करने के लिए संक्षेप में ऊपर और नीचे हिलाएं। अपकेंद्रित्र आरटी में 5 मिनट के लिए ३०० एक्स जी पर फिर से नमूना ।

4. नाभिक अलगाव

  1. एक चौड़े बोर पिपेट टिप का उपयोग करें और किसी भी अवशिष्ट एसवीएफ को पीछे छोड़ते हुए, बर्फ पर एक नई प्रीचिल्ड ट्यूब के शीर्ष पर रखे गए 100 माइक्रोन सेल फिल्टर में नमूने की शीर्ष परत को सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें।
  2. फिल्टर को पर्याप्त मात्रा में एनपीबी से कुल्ला/धोएं और फिल्टर को त्यागें। इस कदम से आगे बर्फ पर नमूना के रूप में अक्सर संभव के रूप में है और जल्दी से काम करने के लिए टपका हुआ और/ यह बर्फ पर भविष्य के चरणों में उपयोग की जाने वाली माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों को प्रीकहिल करने में सहायक है।
  3. मिश्रण करने के लिए ट्यूब के आंतरायिक कोमल उलटा के साथ कोई अधिक से अधिक 2 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना रखें । बर्फ पर इनक्यूबेशन समय नमूना आकार और आदिपोसाइट्स के प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  4. सुपरनेट निकालें और एनपीबी के 1 एमसीएल में पैलेट को रीसस्ट करें। नमूना को एक साफ माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। स्थानांतरित करते समय, ट्यूब की दीवारों को छूने से बचें, जिसमें मलबा और लिपिड होते हैं। नमूना और मिश्रण करने के लिए 0.6 यू/μL RNase अवरोधक जोड़ें। 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000 x ग्राम पर फिर से सेंट्रलाइज करें।
    नोट: छोटे नमूनों के लिए इस कदम पर अपकेंद्रित्र गति और समय को कम किया जाना चाहिए ।
  5. नाभिक वॉश बफर (2% बीएसए/पीबीएस + 0.6 यू/μL RNase अवरोधक) के 1 एमसीएल में सुपरनेट और रिसिपेंड निकालें।
  6. स्टैकेबल 30 माइक्रोन फिल्टर के साथ एक साफ ट्यूब में डबल फिल्टर। न्यूक्लियी वॉश बफर की एक छोटी मात्रा (~ 300 माइक्रोल) के साथ फिल्टर धोएं। वैकल्पिक रूप से, छोटे नमूनों के लिए, एक 30 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करें जो माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में फिट बैठता है और सीधे इसमें फ़िल्टर करता है।
  7. स्वस्थ नाभिक के सफल अलगाव की पुष्टि करें।
    1. ट्राइपैन के साथ नमूने के एक छोटे से aliquot दाग और औसत मृत आकार और प्रतिशत मृत कोशिकाओं का आकलन करने के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें। ज्यादातर नाभिक वाले नमूने के लिए औसत मृत आकार 7-10 माइक्रोन के बीच होना चाहिए। नाभिक का आकार आमतौर पर 8 माइक्रोन के आसपास होता है।
    2. DAPI के साथ नमूने के एक छोटे से aliquot दाग और एक 20x उद्देश्य या अधिक के साथ एक माइक्रोस्कोप के तहत जांच। परमाणु झिल्ली बरकरार होनी चाहिए और नाभिक गोल होना चाहिए।

5. FACS सफाई और नाभिक एकाग्रता कदम

  1. नाभिक को साफ करने और किसी भी अतिरिक्त मलबे को हटाने के लिए FACS कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ें। संग्रह बफर में न्यूक्लियी वॉश बफर होना चाहिए। FACS के दौरान बफर पतला है। छंटाई के दौरान कमजोर पड़ने के लिए खाते में बीएसए और RNase अवरोधक की एक उच्च एकाग्रता तैयार करना सहायक है। एफएसएस कलेक्शन ब्लॉक कूलिंग मोड पर होना चाहिए।
  2. नाभिक छंटाई के बाद, नमूने को केंद्रित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। 500-1500 नाभिक/μL की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए नाभिक वॉश बफर की एक उपयुक्त मात्रा में पुनर्गठन। सभी सुपरनेट को दूर करने का प्रयास न करें। ऐसा करने से नाभिक का नुकसान होगा।
  3. अंतिम गणना के लिए एक हीमोसाइटोमीटर और एक DAPI दाग aliquot का उपयोग करें और नाभिक की कल्पना करने के लिए। फिर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार snRNA-seq के साथ तुरंत आगे बढ़ें।

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Representative Results

अनसोर्टेड एडिपोसाइट नाभिक में मलबे और डबल्स होते हैं जो डाउनस्ट्रीम सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण में शोर और उच्च पृष्ठभूमि बनाते हैं। प्रतिनिधि FACS गेट रणनीति चित्रा 1में दिखाया गया है । नाभिक का चयन पहले फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) और साइड स्कैटर (एसएससी)(ए)के आधार पर किया गया था, फिर एसएससी(बी)की चौड़ाई और ऊंचाइयों के संयोजन के आधार पर केवल सिंगल्स का चयन किया गया था । अंत में, केवल DAPI-सकारात्मक घटनाओं का चयन किया गया और संग्रह बफर(सी)में क्रमबद्ध किया गया। यह कार्यप्रवाह अत्यधिक शुद्ध एकल नाभिक को कम से कम परमाणु समुच्चय और सेलुलर मलबे(चित्रा 2) केसाथ प्रदान करता है।

हल नाभिक की अखंडता की पुष्टि करने के लिए, दापी धुंधला होने के बाद माइक्रोस्कोप द्वारा नमूने के एक छोटे से एलिकोट का निरीक्षण किया गया था। परमाणु झिल्ली बरकरार होनी चाहिए और नाभिक गोल(चित्रा 2बी)होना चाहिए। शुद्धिकरण की सफलता की पुष्टि करने के लिए, अपकेंद्री के बाद सुपरनैंट (यानी, संग्रह बफर) एकत्र करने और एक मार्कर जीन के वास्तविक समय क्यूआरटी-पीसीआर चलाने की भी सिफारिश की जाती है। एक प्राइमर सेट (टेबल 1में प्राइमर सीक्वेंस) के उपयोग ने नवजात, इंट्रोन युक्त UCP1 को बढ़ाना डिजाइन किया, इस बात की पुष्टि की कि सॉर्ट किए गए नाभिक के सुपरनैंट में नवजात यूसीपी 1 एमआरएनए(चित्र 3)का पता लगाने योग्य स्तर नहीं था। यह कदम अन्य मार्कर जीन के लिए किया जा सकता है, जो भूरे, बेज, या सफेद आदिपोसाइट्स, जैसे सिडिया, पीजीसी 1-ए, आदिपोकया फैब 4में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में होते हैं।

इस प्रोटोकॉल के माध्यम से नाभिक अलग और पुष्टि की लगभग किसी भी एकल सेल स्तर जीन अभिव्यक्ति मंच के अधीन किया जा सकता है । क्रोमियम प्लेटफॉर्म14 (10x जीनोमिक्स) के उपयोग ने 8 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 चूहों(चित्रा 4)से इंटरस्केकुलर ब्राउन एडिपोस ऊतक से 7,500 नाभिक का एक ट्रांसक्रिप्टोम निर्धारित किया। टी-वितरित स्टोचस्टिक पड़ोसी एम्बेडिंग (टी-स्ने) आयामी कमी और कश्मीर-मतलब क्लस्टरिंग ने सात सेल प्रकारों का खुलासा किया, जिनमें ब्राउन एडिपोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाएं, पीडीजीएफआरबीद्वारा चिह्नित भित्ति कोशिकाएं, एडिपोसाइट जनक और प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं। सभी समूहों ने Fabp4,एक पैन-एडिपोसिट जीन, अलग-अलग डिग्री(चित्रा 4बी)के लिए व्यक्त किया। समूहों के एक सबसेट ने यूसीपी 1 एमआरएनए का एक उच्च स्तर व्यक्त किया, जबकि अन्य समूहों ने कई मायनों में Ucp1 (चित्र 4ए, सी)व्यक्त किया। यह पिछले अध्ययन के अनुरूप है जिसमें यह दर्शाया गया है कि मध्यापिक भूरे रंग के वसासू ऊतकों में कम से कम दो अलग - अलग आबादी होती है जिसमें उच्च और निम्न यूसीपी 1 अभिव्यक्ति और थर्मोजेनिक गतिविधि8,9होती है ।

Figure 1
चित्रा 1: मोफ्लो एक्सडीपी हाई स्पीड सॉर्टर द्वारा नाभिक का प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। (A)आकार और दानेदारता। (ख)परमाणु समुच्चय और मल्टीप्लेक्स का पता लगाना। (ग)अंतिम छंटाई गेट केवल DAPI-सकारात्मक घटनाओं का चयन । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: भूरे रंग के एडिपोसाइट्स से अलग नाभिक की प्रतिनिधि छवि। (A)MoFLo XDP छंटाई के बाद पहले और(ख)। एक में सफेद तीर एक अक्षुण्ण झिल्ली के बिना नाभिक का संकेत मिलता है। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: अलग नाभिक और सुपरनेट के लिए प्रतिनिधि क्यूआरटी-पीसीआर परिणाम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि 10x क्रोमियम snRNA-सेक्यू परिणाम भूरे रंग के adipocytes के लिए 8 सप्ताह पुराने पुरुष C57BL/6 चूहों से अलग आरटी के तहत । (A)टी-स्नेक डिस्ट्रिबिलिटी रिडक्शन और के-मीन क्लस्टरिंग फॉर 7,500 न्यूक्लियी। कश्मीर = 9. क्लस्टर एनोटेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले कैनोनिकल मार्कर कोष्ठक में दिखाए जाते हैं। (ख) फैब4की एमआरएनए अभिव्यक्ति, ए मेंएक एडिपोसिट-चयनात्मक मार्कर । सफेद = कोई अभिव्यक्ति नहीं, लाल = उच्च अभिव्यक्ति। (ग) यूसीपी1की एमआरएनए अभिव्यक्ति , एमें थर्मोजेनिक मार्कर । ये डेटा एक ही प्रयोग से हैं। इन आंकड़ों के लिए इस्तेमाल किए गए snRNA-seq डेटा सुपरसीरीज परिग्रहण संख्या GSE144720 के तहत जीन एक्सप्रेशन सर्वग्राही (जियो) में जमा किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जीन प्रजातियां फॉरवर्ड प्राइमर रिवर्स प्राइमर
Ucp1 (Intron युक्त) माउस गैटीटी सीटीटी सीटीसी एजीसी सीजीजी एजीटी टीटीसी सीसीटी टीसीसी टीएए टैग सीएसी सीसीए टीटीसी सी

तालिका 1: वास्तविक समय qPCR विश्लेषण के लिए प्राइमर दृश्यों।

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Discussion

एकल नाभिक को अलग करने और अध्ययन करने के लिए एक सरल और मजबूत विधि प्रस्तुत की गई है। पूरे ऊतक आरएनए अनुक्रमण की तुलना में, यह कार्यप्रवाह सेलुलर विषमता और जनसंख्या-विशिष्ट मार्कर का एक निष्पक्ष दृश्य प्रदान करता है। यह आदिपोसाइट जीव विज्ञान, आणविक चयापचय, और मोटापे के अनुसंधान की उन्नति के लिए महत्वपूर्ण और अभिनव है।

यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से snRNA-seq के डाउनस्ट्रीम आवेदन के लिए अनुकूलित है। MoFlo XDP हाई स्पीड सॉर्टर के साथ स्वस्थ नाभिक के अलगाव को प्राप्त करने के लिए "सफाई" कदम परमाणु झिल्ली अखंडता को बनाए रखते हुए कच्चे तेल के निलंबन से मलबे और समुच्चय को पूरी तरह से हटा देता है। इसलिए, यह बूंद गठन में कैप्चर दक्षता को बढ़ाता है और पता लगाए गए जीन की संख्या के नुकसान के बिना केवल एक रन से हजारों एकल-नाभिक ट्रांसक्रिप्टोम को ठीक करता है। बूंद आधारित एकल कोशिका प्लेटफार्मों के अलावा, जो सर्वेक्षण किए गए एकल नाभिक या कोशिकाओं की अधिक संख्या प्रदान करते हैं, सॉर्टर-आधारित माइक्रोप्लेट और फ्लूइडिग सी 1 प्लेटफॉर्म15 का उपयोग ट्रांसक्रिप्टोम16के अधिक संकल्प और कवरेज प्राप्त करने के लिए भी किया जा सकता है। क्योंकि यह कार्यप्रवाह उच्च गुणवत्ता वाले नाभिक प्रदान करता है, अनुक्रमण (यानी, ATAC-अनुक्रमण) का उपयोग करके ट्रांसपोसेज-सुलभ क्रोमेटिन के लिए परख भी मौजूदा स्काैक-एसईक्यू प्रोटोकॉल17में न्यूनतम संशोधनों के साथ किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा नॉन न्यूक्लियर डिब्बों को हटाने से जानकारी का नुकसान है, जैसे साइटोसोल और सेलुलर झिल्ली। उदाहरण के लिए, उभरते मल्टीमॉडल सिंगल-सेल18, 19,19 का विश्लेषण करता है जो एक साथ सेल झिल्ली प्रोटीन अभिव्यक्ति को मापता है और ट्रांसक्रिप्टोम को इस प्रोटोकॉल पर लागू नहीं किया जा सकता है।

भविष्य का लक्ष्य इस प्रोटोकॉल को बारकोडेड एंटीबॉडी20का उपयोग करके नाभिक मल्टीप्लेक्सिंग के साथ जोड़ना है । विभिन्न प्रायोगिक परिस्थितियों में विभिन्न एडिपोस ऊतकों से हल किए गए नाभिक को बारकोड किया जाएगा और एंटीन्यूक्लियर पोर कॉम्प्लेक्स एंटीबॉडी का उपयोग करके पूल किया जाएगा और snRNA-seq किया जाएगा। परमाणु ट्रांसक्रिप्टोम के साथ इन बारकोड को अनुक्रमित करके, प्रत्येक नाभिक को इसके मूल नमूने को सौंपा जा सकता है, क्रॉस-सैंपल मल्टीप्लेक्स की स्पष्ट रूप से पहचान की जा सकती है, और प्रति नाभिक महत्वपूर्ण लागत में कमी के लिए बूंद-आधारित प्रणालियां "सुपर-लोडेड" हो सकती हैं।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम अल्बर्ट आइंस्टीन जीनोमिक्स कोर से डेविड रेनॉल्ड्स और तकनीकी सहायता के लिए फ्लो साइटोमेट्री कोर से जिंगहांग झांग का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (NIH) (DK110426) और आइंस्टीन-माउंट सिनाई मधुमेह अनुसंधान केंद्र (DK020541) से पायलट और व्यवहार्यता अनुदान से समर्थन स्वीकार करते हैं, और ंयूयॉर्क मोटापा अनुसंधान केंद्र (DK026687) (सभी केएस के लिए) । हम भी कोर समर्थन के लिए अल्बर्ट आइंस्टीन कैंसर केंद्र (CA013330) का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoMACS Rinsing Solution Miltenyi Biotec 130-091-222 PBS with EDTA; sterile-filtered
BSA Sigma A1595
CaCl2 Sigma 21115
Cell filter 100 μm Corning 431752
Cell filter 40μm Corning 431750
CellTrics (30 μm) Sysmex 04-004-2326
Collagenase D Roche 11088866001
Countess II FL Automated Cell Counter Invitrogen AMQAF1000
DAPI Sigma D9542
Dispase II Roche 4942078001
HEPES Sigma H4034
KCl Fisher P217-3
MACS SmartStrainers (30 µm) Miltenyi Biotec 130-098-458 Stackable filters
MgCl2 Sigma M1028
MoFloXDP Cell Sorter Beckman Coulter ML99030
NP-40 Sigma 74385
Protector RNase Inhibitor Roche 3335402001
Sucrose Fisher S5-3

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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जेनेटिक्स अंक 160 एडिपोसिट थर्मोजेनेसिस मधुमेह जीनोमिक्स बायोकेमिस्ट्री मेटाबोलिज्म
एकल सेल जीनोमिक अनुप्रयोगों के लिए Adipose ऊतक नाभिक का अलगाव
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Benitez, G. J., Shinoda, K.… More

Benitez, G. J., Shinoda, K. Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications. J. Vis. Exp. (160), e61230, doi:10.3791/61230 (2020).

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