Summary
Questa pubblicazione descrive un protocollo per l'isolamento dei nuclei dagli adipociti maturi, la purificazione mediante lo smistamento attivato dalla fluorescenza e la trascrittomica a livello di cellula.
Abstract
I grassi marroni e beige sono tessuti adipose specializzati che dissipano l'energia per la termogenesi da vie indipendenti e dipendenti da UCP1 (Uncoupling Protein-1). Fino a poco tempo fa, gli adipociti termogenici erano considerati una popolazione omogenea. Tuttavia, studi recenti hanno indicato che ci sono più sottotipi o sottopopolazioni che sono distinti nell'origine dello sviluppo, nell'uso di substrati e nel trascrittoma. Nonostante i progressi nella genomica a singola cellula, la decomposizione imparziale dei tessuti adiposi in sottotipi cellulari è stata difficile a causa della natura fragile degli adipociti pieni di lipidi. Il protocollo presentato è stato sviluppato per aggirare questi ostacoli isolando efficacemente i singoli nuclei dal tessuto adiposo per applicazioni a valle, incluso il sequenziamento dell'RNA. L'eterogeneità cellulare può quindi essere analizzata mediante sequenziamento dell'RNA e analisi bioinformatiche.
Introduction
Gli studi hanno dimostrato che il tessuto adiposo marrone (BAT) ha una notevole capacità di dissipare energia. Esistono due tipi di adipociti termogenici con caratteristiche dello sviluppo distinte che esistono sia nei roditori che negli esseri umani: adipociti beige e adipociti bruni classici. Mentre gli adipociti bruni classici si trovano per lo più in depositi BAT interscapitolare, gli adipociti beige emergono sporadicamente nel tessuto adiposo bianco (WAT) in risposta ad alcuni segnali fisiologici, come l'esposizione cronica al freddo, un processo chiamato "marrone" o "sbiancamento". Attraverso l'uso di immagini avanzate, è ormai chiaro che gli esseri umani adulti hanno depositi sostanziali di UCP1- BAT, soprattutto nella regione supraclavicolare1,2,3.4 La quantità di BAT umano adulto è inversamente correlata all'adiposità e può essere aumentata da segnali esterni, come l'esposizione cronica al freddo5,6 o z3-adrenergic recettore agonista7. Il dispendio energetico mediato da BAT può offrire un approccio praticabile per combattere l'obesità.
Fino a poco tempo fa, gli adipociti termogenici sono stati considerati una popolazione omogenea. Tuttavia, studi hanno rivelato l'esistenza di più sottotipi o sottopopolazioni distinti nell'origine dello sviluppo, nell'uso del substrato e nel trascrittoma8,9,10. Per esempio, un tipo di adipocito beige che utilizza preferibilmente glucosio per la termogenesi, l'adipocito g-beige, è stato recentemente descritto10. La comprensione incompleta dei tipi di cellule nel tessuto adiposo marrone e beige e la mancanza di marcatori specifici costituiscono una barriera critica allo studio delle loro funzioni biologiche.
I metodi tradizionali per isolare le sottopopolazioni di cellule si basano sull'espressione di pochi geni marcatori noti. I recenti progressi nella genomica a singola cellula consentono l'uso di dati di espressione genica globale di singole cellule per fornire una stima imparziale del numero di sottopopolazioni in un tessuto. L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di determinare tutti i sottotipi di tessuto adiposo sotto vari stimoli termogenici ad una risoluzione a cella singola. A differenza di altri tessuti e tipi di cellule, determinare i sottotipi cellulari del tessuto adiposo è difficile a causa della fragilità degli adipociti pieni di lipidi. Questo documento introduce un protocollo robusto per isolare singoli nuclei dal tessuto adiposo per l'applicazione a valle al sequenziamento dello snRNA. È importante sottolineare che la letteratura recente che confronta i set di dati di sequenziamento dell'RNA a nuclei singoli (snRNA-seq) e di sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha rivelato che il snRNA-seq è paragonabile allo scRNA-seq nel rilevamento del tipo di cellula e superiore nella copertura cellulare per un tessuto complesso come il cervello11. Questo protocollo combina un metodo di centrifugazione a gradiente di densità ottimizzato per i tessuti adiposi di Rosen et al.12 con un passo di "pulizia" nuclei con un MoFlo XDP High Speed Sorter. Come si è visto nei risultati rappresentativi, un'analisi di 7.500 nuclei singoli del tessuto adiposo bruno intersbattiare del topo ha identificato più tipi di cellule all'interno di adipociti bruni apparentemente omogenei. Nel complesso, questo protocollo semplice e robusto può essere applicato per studiare l'organizzazione a livello tissutale di adipociti e cellule residenti adiposi, l'identificazione di geni marcatori specifici del sottotipo e la fenotipizzazione dello sviluppo di topi adipose-selettivi/transgenici.
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Protocol
La cura e la sperimentazione degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dal Comitato istituzionale per la cura degli animali e l'uso presso l'Albert Einstein College of Medicine.
1. Preparazione di digestione tissutale e buffer di lisi
- Preparare il buffer di digestione dei tessuti.
- Preparare 1 mL di tampone di digestione per ogni grammo di tessuto adiposo.
- Pesare 1.5 U/mL collagenae D e 2.4 U/mL dispase II e aggiungere fosfato buffersa salina (PBS).
- Preparare il buffer di preparazione dei nuclei (NPB).
- Preparare 10 m HEPES, 1,5 mm di cloruro di magnesio, 10 mM di cloruro di potassio, 250 mM di saccarosio e 0,1% NP-40 in acqua priva di nuclea. Mescolare bene. Il saccarosio può richiedere più tempo per sciogliersi rispetto agli altri componenti.
- Preparare la soluzione 9A (Bovine Serum albumin) dello 0,5%.
- Preparare 0,5% DI BSA in PBS contenente EDTA. Si consiglia di utilizzare PBS di grado di coltura cellulare filtrato sterile (vedere Tabella dei materiali).
2. Digestione enzimatica del tessuto adiposo
- I topi dissetati per estrarre il tessuto adiposo secondo Aune et al.13. Raccogliere il tessuto isolato in un piatto contenente PBS. Trasferire il tessuto in un tovagliolo di carta per asciugare. Quindi mettere il tessuto in un piatto pulito.
- Aggiungere il cloruro di calcio al tampone di digestione ad una concentrazione finale di 10 mM. Aggiungere un piccolo volume di tampone di digestione al piatto e tritare accuratamente il tessuto adiposo. Il volume del buffer di digestione richiesto sarà basato sulla quantità di tessuto isolato. Di solito viene utilizzato 1 mL o meno.
- Aggiungere circa la metà della quantità di buffer di digestione preparato (ad es. 10 mL per cinque topi) al tessuto macinato. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire il campione in un tubo di centrifuga conica da 50 mL. Aggiungere la quantità residua di tampone per lavare il piatto e trasferirlo al tubo da 50 mL contenente il campione. Pipette su e giù più volte. Poi incubare con agitazione a 200-210 rpm a 37 gradi centigradi per 12-15 min.
3. Isolamento degli Adipociti
- Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5% BSA a un rapporto 1:1 al campione. Mescolare bene pipetting su e giù più volte. Centrifugare il campione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT) per ruotare verso il basso la frazione vascolare stroposta (SVF). La frazione adipocite rimarrà nello strato superiore del campione.
- Posizionare un filtro cellulare di 40 m sopra un tubo di centrifuga conica da 50 mL e filtrare il campione, raccogliendo lo strato superiore e lasciando dietro di sé l'SVF nella parte inferiore del tubo. Trasferire lo strato superiore (frazione adipocite) in un nuovo tubo capovolgendo il filtro sopra il tubo e utilizzando 0,5% BSA per invertire il filtro e raccogliere il campione nel tubo.
- Portare il volume totale dello 0,5% di BSA a 10-15 mL in base alle dimensioni del campione e alla pipetta su e giù con una pipetta sierologica o scuotere brevemente su e giù per mescolare il campione. Centrifugare nuovamente il campione a 300 x g per 5 min a RT.
4. Isolamento dei nuclei
- Utilizzare una punta di pipetta a foro largo e trasferire con attenzione lo strato superiore del campione su un filtro cellulare di 100 m posto sopra un nuovo tubo prechilled sul ghiaccio, lasciando dietro di sé qualsiasi SVF residua.
- Risciacquare/lavare il filtro con una quantità sufficiente di NPB e scartare il filtro. Da questo passo in avanti hanno il campione sul ghiaccio il più spesso possibile e lavorare rapidamente per evitare perdite e/o nuclei malsani. È utile prechill microcentrifuga tubi da utilizzare in passi futuri sul ghiaccio.
- Mettere il campione sul ghiaccio per non più di 2 min con l'inversione delicata intermittente del tubo da mescolare. Il tempo di incubazione sul ghiaccio deve essere ottimizzato per le dimensioni del campione e il tipo di adipociti. Centrifuga a 1.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di NPB. Trasferire il campione in un tubo di microcentrismo pulito. Durante il trasferimento, evitare di toccare le pareti del tubo, che contengono detriti e lipidi. Aggiungete al campione l'inibitore di 0,6 U/L RNase e mescolate. Centrifuga di nuovo a 1.000 x g a 4 gradi centigradi per 10 min.
NOTA: la velocità e il tempo di centrifugazione devono essere ridotti in questa fase per i campioni più piccoli. - Rimuovere il supernatante e risospendere in 1 mL di Nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS - 0,6 U/ Sl RNase inibitore).
- Filtrare due volte in un tubo pulito con filtri impilabili da 30 m. Lavare il filtro con un piccolo volume di Nuclei Wash Buffer. In alternativa, per i campioni più piccoli, utilizzare un filtro di 30 m che si inserisce in un tubo di microcentrifuga e filtrare direttamente in esso.
- Confermare il successo dell'isolamento dei nuclei sani.
- Macchia redigere una piccola aliquota del campione con trypan e usa un contatore cellulare automatizzato per valutare la dimensione media dei morti e la percentuale di cellule morte. La dimensione media dei morti per un campione che contiene per lo più nuclei deve variare tra 7-10 m. La dimensione dei nuclei è di solito di circa 8 m.
- Macchiare una piccola aliquota del campione con DAPI ed esaminare al microscopio con un obiettivo 20x o superiore. La membrana nucleare deve essere intatta e i nuclei devono essere rotondi.
5. Pulizia FACS e fase di concentrazione dei nuclei
- Procedere immediatamente al passo FACS per pulire i nuclei e rimuovere eventuali detriti in eccesso. Il buffer di raccolta deve contenere Nuclei Wash Buffer. Durante FACS il buffer viene diluito. Preparazione di una maggiore concentrazione di BSA e RNase inibitore per tenere conto della diluizione durante lo smistamento è utile. Il blocco di raccolta FACS deve essere in modalità di raffreddamento.
- Dopo lo smistamento dei nuclei, centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 gradi centigradi per concentrare il campione. Ricostituire in un volume appropriato di Nuclei Wash Buffer per ottenere una concentrazione di 500-1.500 nuclei/ . Non tentare di rimuovere tutti i supernatali. In questo modo si tradurrà in perdita di nuclei.
- Utilizzare un emocitometro e un'aliquota macchiata DAPI per un conteggio finale e per visualizzare i nuclei. Quindi procedere immediatamente con snRNA-seq secondo il protocollo del produttore.
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Representative Results
I nuclei di adipociti non ordinati contengono detriti e doppietti che creano rumore e un elevato background nel sequenziamento a valle dell'RNA a cellule singole. La strategia rappresentativa del gate FACS è illustrata nella Figura 1. I nuclei sono stati selezionati per la prima volta in base alla dispersione in avanti (FSC) e alla dispersione laterale (SSC)(A),quindi sono stati selezionati solo i singlet in base alla combinazione di larghezza e altezze di SSC (B). Infine, solo gli eventi positivi DAPI sono stati selezionati e ordinati in buffer di raccolta (C). Questo flusso di lavoro fornisce singoli nuclei altamente purificati con aggregati nucleari ridotti al minimo e detriti cellulari(Figura 2).
Per confermare l'integrità dei nuclei ordinati, una piccola aliquota del campione è stata ispezionata al microscopio dopo la colorazione DAPI. La membrana nucleare deve essere intatta e i nuclei devono essere rotondi (Figura 2B). Per confermare il successo della purificazione, si raccomanda anche di raccogliere supernatali (cioè, tampone di raccolta) dopo la centrifugazione e di eseguire qRT-PCR in tempo reale di un gene marcatore. L'uso di un set di primer (primer sequences in Table 1) progettato per amplificare l'UCP1 nascente, contenente intron1, ha confermato che il supernatante dei nuclei ordinati non conteneva un livello rilevabile di mRNA Ucp1 nascente (Figura 3). Questo passaggio può essere fatto per altri geni marcatori altamente abbondanti in adipociti marroni, beige o bianchi, come Cidea, Pgc1-a, Adipoqo Fabp4.
I nuclei isolati e confermati attraverso questo protocollo possono essere sottoposti praticamente a qualsiasi piattaforma di espressione genica a livello di cellula singola. L'uso della piattaforma Di cromo14 (10x Genomica) ha determinato una trascrizione di 7.500 nuclei dal tessuto adiposo marrone interscapular da 8 settimane di età maschio C57BL/6 topi (Figura 4). La riduzione della dimensionalità dell'incorporazione di dimensioni (t-SNE) di vicini stocastici t-distribuito e il raggruppamento di K-mezzi ha rivelato sette tipi di cellule, tra cui adipociti bruni, cellule endoteliali, cellule murali contrassegnate da Pdgfrb, progenitori adipociti e cellule immunitarie. Tutti i cluster esprimevano Fabp4, un gene pan-adipocito, a vari livelli (Figura 4B). Un sottoinsieme di cluster esprimeva un alto livello di mRNA Ucp1, mentre altri cluster esprimevano sporadicamente Ucp1 (Figura 4A,C). Questo è coerente con uno studio precedente che mostra che il tessuto adiposo bruno interscapular contiene almeno due popolazioni distinte con espressione Ucp1 alta e bassa e attività termogenica8,9.
Figura 1: Analisi della citometria di flusso rappresentativa dei nuclei di MoFlo XDP High Speed Sorter. (A) Dimensioni e granularità. (B) Rilevamento di aggregati e multiplet nucleari. (C) Cancello di ordinamento finale selezionando solo eventi DAPI-positivi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagine rappresentativa dei nuclei isolati dagli adipociti bruni. (A) Prima e(B) dopo l'ordinamento di MoFLo XDP. Le frecce bianche in A indicano nuclei senza una membrana intatta. Barra di scala : 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultato qRT-PCR rappresentativo per nuclei isolati e supernatali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rappresentativi dei risultati di 10x chromium snRNA-seq per gli adipociti bruni isolati dai topi C57BL/6 maschi di 8 settimane sotto RT. (A) riduzione della dimensionalità t-SNE e raggruppamento K-Mezzi per 7.500 nuclei. k : 9 . I marcatori canonici utilizzati per le annotazioni del cluster vengono visualizzati tra parentesi. (B) espressione mRNA di Fabp4, un marcatore adipocite-selettivo, in A. Bianco - nessuna espressione, rosso - espressione alta. Espressione mRNA (C) di Ucp1, marcatore termogenico in A. Questi dati provengono da un singolo esperimento. I dati snRNA-seq utilizzati per queste cifre sono stati depositati nel Gene Expression Omnibus (GEO) con il numero di adesione della superserie GSE144720. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gene | Specie | Primer in avanti | Primer inverso |
| Ucp1 (contenente intron) | Mouse | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA TAG CAC CCA TTC C |
Tabella 1: sequenze primer per l'analisi qPCR in tempo reale.
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Discussion
Viene presentato un metodo semplice e robusto per isolare i singoli nuclei e studiare l'eterogeneità del tessuto adiposo. Rispetto al sequenziamento dell'RNA di tessuto intero, questo flusso di lavoro offre una visione imparziale dell'eterogeneità cellulare e dei marcatori specifici della popolazione. Questo è significativo e innovativo per il progresso della biologia adipocite, metabolismo molecolare, e la ricerca sull'obesità.
Questo protocollo è particolarmente ottimizzato per l'applicazione a valle di snRNA-seq. Il passaggio di "pulizia" per ottenere l'isolamento dei nuclei sani con il MoFlo XDP High Speed Sorter rimuove completamente detriti e aggregati dalla sospensione grezza, mantenendo l'integrità della membrana nucleare. Pertanto, questo aumenta l'efficienza di cattura nella formazione delle goccioline e recupera migliaia di trascrittomi mononuclei da una sola corsa senza perdita del numero di geni rilevati. Oltre alle piattaforme unicellulari a base di gocciolamenti, che forniscono un maggior numero di singoli nuclei o cellule intervistate, le piattaforme a microplacca basata su selezionagocce e Fluidigm C115 possono essere utilizzate anche per ottenere una maggiore risoluzione e copertura del trascrittoma16. Poiché questo flusso di lavoro offre nuclei di alta qualità, i saggi per la cromatina accessibile alla trasposase utilizzando il sequenziamento (ad esempio, il sequenziamento ATAC) possono essere eseguiti anche con modifiche minime al protocollo scATAC-seq17esistente.
Una limitazione di questo protocollo è la perdita di informazioni dalla rimozione di compartimenti non nucleari, come il citosol e la membrana cellulare. Ad esempio, le analisi a singola cellula multimodale emergenti18,19 che misurano contemporaneamente l'espressione della proteina della membrana cellulare e il trascrittoma non possono essere applicate a questo protocollo.
L'obiettivo futuro è quello di combinare questo protocollo con il multiplexing nuclei utilizzando anticorpi codificati a barre20. I nuclei ordinati provenienti da diversi tessuti adipose in diverse condizioni sperimentali saranno codificati a barre e raggruppati utilizzando un anticorpo complesso di pori antinucleari e snRNA-seq saranno eseguiti. Sequenziando questi codici a barre insieme al trascrittoma nucleare, ogni nuclei può essere assegnato al suo campione originale, i multiplet a campione incrociato possono essere chiaramente identificati e i sistemi a base di gocciole possono essere "super-caricati" per una significativa riduzione dei costi per nuclei.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo David Reynolds, del nucleo di Albert Einstein Genomics, e Jinghang shang dal Flow Cytometry Core per il supporto tecnico. Riconosciamo il sostegno dei National Institutes of Health (NIH) (DK110426) e dei Pilot and Feasibility Grants dell'Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) e del New York Obesity Research Center (DK026687) (tutti a K.S.). Vorremmo anche ringraziare Albert Einstein Cancer Center (CA013330) per il supporto di base.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
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