Summary
この出版物は、成熟したアディポサイトからの核の単離、蛍光活性化分類による精製、および単一細胞レベルのトランスクリプトミクスのためのプロトコルを記述する。
Abstract
ブラウンとベージュの脂肪は、UCP1(アンカップリングプロテイン-1)依存性および独立経路による熱発生のためのエネルギーを放散する特殊な脂肪組織である。最近まで、熱原性アディポサイトは均質集団と考えられていた。しかし、最近の研究では、発生起源、基質使用、およびトランスクリプトームに異なる複数のサブタイプまたは亜集団が存在することを示しています。単細胞ゲノミクスの進歩にもかかわらず、脂質で満たされた脂肪細胞の脆弱な性質のために、脂肪組織を細胞サブタイプに公平に分解することは困難であった。提示されたプロトコルは、RNAシーケンシングを含む下流のアプリケーションのための脂肪組織からの単一の核の効果的な分離によってこれらの障害を回避するために開発されました。細胞の不均一性は、RNAシーケンシングおよびバイオインフォマティクス解析によって分析することができます。
Introduction
研究は、茶色の脂肪組織(BAT)がエネルギーを消散する顕著な能力を有することを示している。げっ歯類とヒトの両方に、ベージュの藍胞と古典的な褐色のアディポサイトの両方に、明確な発達特徴を持つ熱原性のアディポサイトの2種類が存在する。古典的な褐色脂肪細胞は主に肩間BATデポに位置するが、ベージュ脂肪細胞は、慢性低温暴露のような特定の生理学的手がかりに応答して白い脂肪組織(WAT)に散発的に出現する、「褐変」または「ベイジング」と呼ばれるプロセスである。高度なイメージングを使用することにより、成人の人間がUCP1+ BATの実質的な拠点を持つことは明らかになっています, 特に上陸領域1,,22,3,,4.成人ヒトBATの量は、脂肪性と逆に相関し、慢性低温暴露55、6または6β3アドレナリン受容体アゴニスト7などの外部手がかりによって増加させることができる。BAT媒介エネルギー支出は、肥満と闘うための実行可能なアプローチを提供するかもしれない。
最近まで、熱原性のアディポサイトは均質な集団と考えられてきました。しかし、研究は、発達起源、基質の使用法、およびトランスクリプトーム88、9、109において明確である複数のサブタイプまたは亜集団の存在を10明らかにした。例えば、熱発生のためにグルコースを優先的に使用するベージュアディポサイトの一種である、g-ベージュアディポサイトは、最近10記載された。褐色およびベージュ脂肪組織における細胞タイプの不完全な理解と特定のマーカーの欠如は、その生物学的機能を研究するための重要な障壁を構成する。
細胞の亜集団を単離するための伝統的な方法は、少数の既知のマーカー遺伝子の発現に基づいています。単細胞ゲノミクスの最近の進歩により、単一細胞の全球遺伝子発現データを使用して、組織中の亜集団数の公平な推定値を提供することが可能です。このプロトコルの最終的な目標は、単一細胞の分解能で様々な発熱刺激の下ですべての脂肪組織サブタイプを決定することです。他の組織や細胞の種類とは対照的に、脂肪組織の細胞サブタイプを決定することは、脂質で満たされた脂肪細胞の脆弱性のために困難です。本論文では、下流の適用からsnRNAシーケンシングに対して、脂肪組織から単一核を分離するための堅牢なプロトコルを紹介する。重要なことに、よく一致した単核RNAシーケンシング(snRNA-seq)と単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)データセットを比較する最近の文献は、snRNA-seqが細胞型検出におけるscRNA-seqに匹敵し、脳11のような複雑な組織の細胞カバレッジにおいて優れていることが明らかになった。このプロトコルは、Rosenららによって脂肪組織に最適化された密度勾配遠心分離法をMoFlo XDP高速ソーターと核「クリーンアップ」ステップと組み合わせたものです。代表的な結果に見られるように、マウスの肩間ブラウン脂肪組織から7,500個の単一核の分析は、一見均質な褐色脂肪細胞内の複数の細胞タイプを同定した。全体として、この単純で堅牢なプロトコルは、脂肪細胞および脂肪居住細胞の組織レベルの組織化、サブタイプ特異的マーカー遺伝子の同定、および脂肪選択的ノックアウト/トランスジェニックマウスの開発表現型を研究するために適用することができる。
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Protocol
アルバート・アインシュタイン医科大学の制度動物ケア・使用委員会が承認した手順に従って、動物のケアと実験が行われました。
1. 組織消化・分解バッファーの調製
- 組織消化バッファーを準備します。
- 脂肪組織のすべてのグラムのための消化バッファーの〜1 mLを調製します。
- 1.5 U/mLコラゲナーゼDと2.4 U /mLディスパーゼIIを計量し、リン酸緩衝生理食塩分(PBS)を加えます。
- 核調製バッファー (NPB) を準備します。
- 10 mM HEPES、1.5 mM塩化マグネシウム、10 mM塩化カリウム、250 mMスクロース、およびヌクレアーゼフリー水でNP-40を用意します。よく混ぜます。スクロースは、他の成分よりも溶解するのに多くの時間がかかる場合があります。
- 0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を調製します。
- EDTAを含むPBSで0.5%BSAを調製します。滅菌濾過細胞培養グレードPBSを使用することをお勧めします(資料表を参照)。
2. 脂肪組織の酵素消化
- Auneら13に従って脂肪組織を抽出するマウスを解剖する。PBSを含む皿の中で単離された組織を収集します。ティッシュをペーパータオルに移して乾かします。その後、きれいな皿にティッシュを置きます。
- 消化バッファーに塩化カルシウムを加え、最終濃度の 10 mM にします。少量の消化バッファーを皿に加え、脂肪組織を十分にミンチします。必要な消化バッファーの量は、分離された組織の量に基づいています。通常~1mL以下が用いられる。
- 調製した消化バッファーの量の約半分(例えば、5匹のマウスの場合は〜10 mL)を細かく組織に加える。血清ピペットを使用して、サンプルを50 mL円錐遠心分離管に移します。残りの量のバッファーを加えて皿を洗い、サンプルを含む50 mLチューブに移します。ピペットは数回上下します。その後、37°Cで200-210 rpmで12〜15分間振ってインキュベートします。
3. アディポサイトの分離
- インキュベーション後、0.5%のBSAをサンプルに対して1:1の比率で加えます。何度か上下にピペットを入れ、よく混ぜます。試料を室温(RT)で5分間300xgで遠心分離し、間質血管画分(SVF)をスピンダウンさせる。 g端数分数はサンプルの最上層に残ります。
- 50 mL円錐形遠心分離チューブの上に40 μmのセルフィルターを置き、サンプルをフィルターし、最上層を採取し、チューブの底部にあるSVFの後ろに残します。フィルターをチューブの上に逆さまに反転させ、0.5%BSAを使用してフィルターを逆洗浄し、チューブ内のサンプルを収集することによって、最上層(アディポサイト分数)を新しいチューブに移します。
- サンプルサイズに基づいて0.5%BSAの総量を10〜15mLにし、血清ピペットでピペットを上下に動かすか、サンプルを混ぜるために一時的に上下に振ります。RTで5分間300 x gでサンプルを再び遠心分離します。
4. 核分離
- 広ボアピペットチップを使用し、サンプルの最上層を氷上の新しいプレチルドチューブの上に置いた100 μmのセルフィルターに慎重に移し、残りのSVFを残します。
- 十分な量のNPBでフィルターを洗い流す/洗浄し、フィルターを捨てます。このステップから、できるだけ頻繁に氷上のサンプルを持ち、漏れや不健康な核を避けるために迅速に作業します。氷上の将来のステップで使用されるマイクロ遠心分離管をプレチルするのに役立ちます。
- サンプルを氷の上に2分以上置き、チューブを断続的に穏やかに反転して混ぜます。氷上のインキュベーション時間は、サンプルサイズとアディポサイトの種類に合わせて最適化する必要があります。遠心分離機 1,000 x gで 4 °C で 10 分間
- 上清を取り除き、NPBの1mLでペレットを再懸濁します。サンプルをきれいなマイクロ遠心チューブに移します。転写中は、破片や脂質を含むチューブの壁に触れないようにしてください。0.6 U/μL RNase阻害剤をサンプルに加え、混合します。遠心分離機は4°Cで1000xgで再び10分間遠心分離機を使用します。 g
注: 小さいサンプルの場合、このステップでは遠心分離速度と時間を減らしてください。 - 上清を取り除き、1 mLの核洗浄バッファー(2%BSA/PBS + 0.6 U/μL RNase阻害剤)で再懸濁します。
- 積み重ね可能な30 μmフィルターが付いているきれいな管に二重フィルター。核洗浄バッファーの少量(約300 μL)でフィルターを洗浄します。あるいは、小さいサンプルの場合は、マイクロ遠心チューブに収まる30 μmのフィルターを使用し、直接フィルターを入れます。
- 健康な核の正常な分離を確認します。
- サンプルの小さなアリコートをトリパンで染色し、自動細胞カウンターを使用して平均死んだサイズと死んだ細胞の割合を評価します。主に核を含むサンプルの平均デッドサイズは7〜10μmの範囲である必要があります。
- DAPIでサンプルの小さなアリコートを染色し、20倍以上の目的で顕微鏡下で検査します。核膜はそのままで、核は丸くする必要があります。
5. FACSのクリーンアップと核濃縮工程
- 核をクリーンアップし、余分な破片を除去するためにFACSステップに直ちに進みます。コレクション バッファには、核洗浄バッファーが含まれている必要があります。FACS の間にバッファは希薄化されます。ソート時の希釈を考慮して、より高濃度のBSAおよびRNase阻害剤を調製することは有用である。FACS コレクション ブロックは、冷却モードにする必要があります。
- 核を選別した後、遠心分離機を500xgで4°Cで5分間、試料を濃縮した。 g500-1,500核/μLの濃度を達成するために核洗浄緩衝液の適切な容積で再構成する。すべての上清を取り除こうとしないでください。そうすることで核が失われます。
- 最終的なカウントにヘモサイトメーターとDAPI染色アリコートを使用し、核を視覚化します。その後、メーカーのプロトコルに従ってsnRNA-seqをすぐに進めます。
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Representative Results
未分類のアディポサイト核には、下流の単一細胞RNAシーケンシングにおいてノイズと高いバックグラウンドを生み出す破片およびダブレットが含まれています。FACS ゲート戦略の代表的な例を図 1に示します。核は、まず順方向散乱(FSC)と側面散乱(SSC)(A)に基づいて選択し、次に、SSC(B)の幅と高さの組み合わせにB基づいてシングルを選択した。最後に、DAPI 陽性イベントのみが選択され、コレクション バッファ (C) に並べ替えられました。このワークフローは、核凝集体と細胞破片を最小化した高度に精製された単核を提供する(図2)。
選別された核の完全性を確認するために、試料の小さなアリコートを、DAPI染色後に顕微鏡で検査した。核膜はそのままで、核は丸くする必要があります(図2B)。精製の成功を確認するために、遠心分離後に上清(すなわち、収集バッファ)を収集し、マーカー遺伝子のリアルタイムqRT-PCRを実行することも推奨される。新生を増幅するように設計されたプライマーセット(表1中のプライマー配列)の使用は、イントロン含有核の上清が検出可能なレベルの新生Ucp1 mRNAを含んでいないことを確認した(図3)。このステップは、褐色、ベージュ、または白色のアディポサイトに豊富な他のマーカー遺伝子に対して行Cideaうことができます。 Pgc1-a Adipoq
このプロトコルを介して単離され、確認された核は、事実上任意の単細胞レベルの遺伝子発現プラットフォームに供することができる。クロムプラットフォーム14(10xゲノミクス)の使用は、8週齢の雄C57BL/6マウスから肩甲骨ブラウン脂肪組織から7,500核の転写体を決定した(図4)。t分布確率的隣接埋め込み(t-SNE)次元還元およびK-平均クラスタリングは、褐色のアディポサイト、内皮細胞、Pdgfrbによってマークされた壁画細胞、椎骨細胞前駆細胞、および免疫細胞を含む7つの細胞タイプを明らかにした。すべてのクラスターは、パン・アディポサイト遺伝子であるFabp4を様々な程度まで発現した(図4B)。クラスターのサブセットは高レベルのUcp1 mRNA を表し、他のクラスターは散発的にUcp1を発現した (図 4A,C)。これは、角質ブラウン脂肪組織が高い低いUcp1発現および発熱活性88,99を有する少なくとも2つの異なる集団を含んでいることを示す以前の研究と一致している。
図1:MoFlo XDP高速選別機による核の代表的なフローサイトメトリー解析(A) サイズと粒度。(B) 核集合体と多重体の検出(C) DAPI 陽性イベントのみを選択する最終ソートゲート。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:褐色のアディポサイトから単離された核の代表的な画像。(A) 前および (B) MoFLo XDP ソート後。Aの白い矢印は、無傷の膜のない核を示す。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:単離核および上清に対する代表的なqRT-PCR結果この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:8週齢の雄C57BL/6マウスからRTの下で単離された褐色のアディポサイトに対する代表的な10xクロムsnRNA-seqの結果。(A)t-SNE次元縮小とK-平均クラスタリング 7,500核k = 9.クラスター注釈に使用される正規マーカーは、かっこ内に表示されます。(B) A におけるアディポサイト選択的マーカーであるFabp4の mRNA発現。白 = 表現なし、赤 = 高い表現。(C) Ucp1の mRNA 発現、Aにおける発熱マーカー 。これらのデータは、単一の実験から取得されます。これらの数値に使用されるsnRNA-seqデータは、スーパーシリーズ加盟番号GSE144720の下で遺伝子発現オムニバス(GEO)に堆積した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 遺伝子 | 種 | フォワードプライマー | リバースプライマー |
| Ucp1 (イントロン含有) | マウス | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA タグ CAC CCA TTC C |
表1:リアルタイムqPCR分析用のプライマー配列
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Discussion
単一の核を単一の核を単離し、脂肪組織の不均一性を研究する簡単で、強い方法が提示される。このワークフローは、組織全体のRNAシーケンシングと比較して、細胞の不均一性および集団特異的マーカーの公平なビューを提供します。これは、アディポサイト生物学、分子代謝、肥満研究の進歩のために重要かつ革新的です。
このプロトコルは、snRNA-seqのダウンストリームアプリケーションに特に最適化されています。MoFlo XDP高速ソーターで健康な核の単離を達成するための「クリーンアップ」ステップは、核膜の完全性を維持しながら、粗懸濁液から破片および凝集物を完全に除去する。したがって、これは液滴形成における捕獲効率を高め、検出された遺伝子の数を失うことなく、わずか1回の実行から数千個の単核転写体を回収する。より多くの調査対象の単一核または細胞を提供する液滴ベースの単一細胞プラットフォームに加えて、ソーターベースのマイクロプレートおよびFluidigmC1プラットフォーム15も、トランスクリプトーム16のより大きな解像度およびカバレッジを得るために使用することができる。このワークフローは高品質の核を提供するので、シーケンシングを用いたトランスポザーゼアクセス可能クロマチンのアッセイ(すなわち、ATACシーケンシング)は、既存のscATAC-seqプロトコル17に対する最小限の変更で行うこともできる。
このプロトコルの1つの制限は、細胞質や細胞膜などの非核コンパートメントの除去による情報の損失である。例えば、細胞膜タンパク質発現とトランスクリプトームを同時に測定する新たなマルチモーダル単一細胞分析18,19は18、このプロトコルには適用できません。
今後の目標は、バーコード化された抗体20を用いて核多重化とこのプロトコルを組み合わせることです。異なる実験条件下で異なる脂肪組織から選別された核は、抗核孔複合体抗体およびsnRNA-seqを用いてバーコード化およびプールが行われる。これらのバーコードを核転写体と一緒にシーケンシングすることで、各核を元のサンプルに割り当てることができ、クロスサンプル多重を明確に識別することができ、液滴ベースのシステムは核あたりの大幅なコスト削減のために「スーパーロード」することができます。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
アルバート・アインシュタイン・ゲノミクスのコアのデビッド・レイノルズとフロー・サイトメトリー・コアのジンハン・ザンに、技術サポートを感謝します。我々は、国立衛生研究所(NIH)(DK110426)およびアインシュタインマウントシナイ糖尿病研究センター(DK020541)、ニューヨーク肥満研究センター(DK026687)(すべてK026687)からの支援を認める。.また、アルバート・アインシュタインがんセンター(CA013330)の中核的な支援に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
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