Summary
본 간행물은 성숙한 지방세포로부터 핵의 분리, 형광 활성화 선별에 의한 정제, 및 단세포 수준 전사학에 대한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
갈색과 베이지 색 지방은 UCP1 (분리 단백질-1)에 의해 열발생에 대한 에너지를 발산하는 특수 조직 조직입니다 의존적이고 독립적 인 경로. 최근까지 열발생 성 지방 세포는 균일 한 인구로 간주되었다. 그러나, 최근 연구는 발달 기원, 기판 사용 및 전사에서 구별되는 다중 특수형 또는 하위 집단이 있다는 것을 표시했습니다. 단세포 유전체학의 진보에도 불구하고, 지방 분조직의 비편향분해는 지질이 채워진 지방세포의 연약한 특성 때문에 도전적이다. 제시된 프로토콜은 RNA 시퀀싱을 포함하여 다운스트림 응용을 위한 지방 조직에서 단 하나 핵의 효과적인 격리에 의해 이 장애물을 우회하기 위하여 개발되었습니다. 세포 이질성은 RNA 시퀀싱 및 생물정보 분석에 의해 분석될 수 있다.
Introduction
연구 에 따르면 갈색 지방 조직 (BAT)은 에너지를 분산시키는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 설치류와 인간 모두에서 뚜렷한 발달 기능을 갖춘 두 가지 유형의 열성 선포세포가 존재합니다: 베이지 색 지방 세포와 고전적인 갈색 지방세포. 고전적인 갈색 지방세포는 주로 중간 형 BAT 창고에 위치하지만, 베이지 색 지방 세포는 만성 감기 노출과 같은 특정 생리적 단서에 대한 응답으로 흰색 지방 조직 (WAT)에서 산발적으로 나타난다, 과정은 "브라우닝" 또는 "베이깅"으로 지칭되는 과정. 고급 이미징의 사용을 통해, 성인 인간은 UCP1+ BAT의 상당한 창고를 가지고 있음을 지금 분명하다, 특히 supraclavicular 영역1,,2,,3,,4. 성인 인간의 BAT의 양은 반대로 사도와 상관 관계가 있으며 만성 감기 노출5,,6 또는 β3-adrenergic 수용체고뇌7과같은 외부 단서에 의해 증가 될 수 있습니다. BAT 중재 에너지 지출은 비만 퇴치를 위한 실행 가능한 접근법을 제공할 수 있습니다.
최근까지 열발생 성 지방 세포는 균일 한 인구로 간주되었습니다. 그러나, 연구 결과는 발달 기원,,기판 사용 및전사8,9,910에서구별되는 다중 특수형 또는 하위 집단의 존재를 밝혔습니다. 예를 들어, 열발생, g-베이지 색 지방세포에 포도당을 우선적으로 사용하는 베이지 색 지방세포의 유형은 최근10에설명되었다. 갈색과 베이지 색 지방 조직에 있는 세포 모형의 불완전한 이해 및 특정 마커의 부족은 그들의 생물학 기능을 공부에 중요한 장벽을 구성합니다.
세포의 하위 집단을 격리하기위한 전통적인 방법은 몇 가지 알려진 마커 유전자의 발현에 기초한다. 단세포 유전체학에 있는 최근 어드밴스는 조직에 있는 하위 집단의 수의 편견없는 추정을 제공하기 위하여 단 하나 세포의 글로벌 유전자 발현 데이터의 사용을 가능하게 합니다. 이 프로토콜의 궁극적인 목표는 단세포 해상도에서 다양한 열발생 자극하에서 모든 지방 조직 특수형을 결정하는 것입니다. 다른 조직 및 세포 유형과는 달리, 지방 조직의 세포 하위 유형을 결정하는 것은 지질 채워진 지방 세포의 취약성 때문에 도전적입니다. 이 논문은 다운스트림 적용을 위한 지방 조직에서 snRNA 시퀀싱에 단일 핵을 분리하는 강력한 프로토콜을 소개합니다. 중요한 것은, 잘 일치하는 단일 핵 RNA 염기서열분석(snRNA-seq) 및 단세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 데이터 세트를 비교하는 최근 문헌은 snRNA-seq가 세포 유형 검출에서 scRNA-seq와 유사하며, 뇌111과같은 복잡한 조직에 대한 세포 커버리지에서 우수하다는 것을 밝혔다. 이 프로토콜은 로젠 외12에 의해 포화 조직에 최적화된 밀도 그라데이션 원심분리 방법을 MoFlo XDP 고속 선별기와 함께 핵 "정리" 단계와 결합합니다. 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이, 마우스 산하 갈색 지방 조직에서 7,500개의 단일 핵을 분석한 결과, 겉보기에 균일한 갈색 지방 조직 내에서 여러 세포 유형을 확인했습니다. 전반적으로, 이 간단하고 강력한 프로토콜은 지방 세포및 지방 거주자 세포의 조직 수준 조직을 연구하기 위하여 적용될 수 있고, 아형 특이적 마커 유전자의 식별 및 adipose 선택적인 녹아웃/형질 전환 마우스의 발달 표현.
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Protocol
알버트 아인슈타인 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 절차에 따라 동물 관리 및 실험이 수행되었습니다.
1. 조직 소화 및 리시스 완충제 준비
- 조직 소화 버퍼를 준비합니다.
- 지방 조직의 모든 그램에 대해 ~ 1 mL의 소화 버퍼를 준비하십시오.
- 1.5 U/mL 콜라게나아제 D 와 2.4 U/mL 디스파제 II를 계량하고 인산염 완충식식염수(PBS)를 추가합니다.
- 핵 준비 버퍼(NPB)를 준비한다.
- 10m HEPES, 1.5 mM MM 염화 마그네슘, 염화 10m 칼륨, 250mM 자당, 뉴클레아제 없는 물에서 0.1% NP-40을 준비한다. 잘 섞으세요. 자당은 다른 성분보다 용해하는 데 더 많은 시간이 걸릴 수 있습니다.
- 0.5% 소 세럼 알부민(BSA) 용액을 준비한다.
- EDTA를 포함하는 PBS에서 0.5%의 BSA를 준비합니다. 멸균 여과 된 세포 배양 등급 PBS를 사용하는 것이 좋습니다 (재료표참조).
2. 지방 조직의 효소 소화
- Aune 외13에따라 지방 조직을 추출하기 위해 마우스를 해부한다. PBS를 포함하는 접시에 고립 된 조직을 수집합니다. 티슈를 종이 타월로 옮기고 말리십시오. 그런 다음 티슈를 깨끗한 접시에 놓습니다.
- 염화칼슘을 소화 완충제에 추가하여 최종 농도10mM에 넣습니다. 소량의 소화 버퍼를 접시에 넣고 지방 조직을 철저히 다진다. 필요한 소화 버퍼의 양은 격리된 조직의 양을 기준으로 합니다. 일반적으로 ~1mL 이하가 사용됩니다.
- 다진 조직에 준비된 소화 완충제의 약 절반(예를 들어, 5마리의 마우스의 경우 ~10mL)을 넣습니다. 서학적 파이펫을 사용하여 샘플을 50mL 원심분리기 튜브로 이송합니다. 남은 버퍼를 추가하여 접시를 씻고 시료를 포함하는 50mL 튜브로 옮겨넣습니다. 파이펫을 여러 번 위아래로. 그런 다음 12-15 분 동안 37 °C에서 200-210 rpm에서 흔들어서 배양하십시오.
3. 아디포세포 절연
- 인큐베이션 후 샘플에 대해 1:1 비율로 0.5%의 BSA를 추가합니다. 여러 번 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요. 원심분리기는 실온(RT)에서 5분 동안 300 x g의 샘플을 원심분리하여 기질 혈관 분획(SVF)을 회전시합니다. adipocyte 분획은 샘플의 맨 위 층에 남아 있습니다.
- 50mL 원심분리기 튜브 위에 40 μm 셀 필터를 놓고 샘플을 필터링하여 상단 층을 수집하고 튜브 하단에 SVF를 남깁니다. 상단 층(adipocyte 분획)을 튜브 위로 거꾸로 뒤집고 0.5% BSA를 사용하여 필터를 세척하고 튜브에서 샘플을 수집하여 새로운 튜브로 옮겨냅니다.
- 시료 크기와 파이펫을 위아래로 조정하여 0.5% BSA의 총 부피를 10-15mL로 가져오거나 시료를 섞기 위해 잠시 위아래로 흔들어 줍니다. RT에서 5 분 동안 300 x g에서 샘플을 다시 원심 분리합니다.
4. 핵 분리
- 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하고 시료의 상단 층을 얼음 위에 놓인 100 μm 셀 필터로 조심스럽게 전달하여 잔여 SVF를 남깁니다.
- 충분한 양의 NPB로 필터를 헹구고 세척하고 필터를 폐기하십시오. 이 단계에서 앞으로 얼음에 샘플을 가능한 한 자주 가지고 새는 및 / 또는 건강에 해로운 핵을 피하기 위해 신속하게 작동합니다. 얼음에 미래의 단계에서 사용할 미세 원심 분리튜브를 미리 칠하는 것이 도움이됩니다.
- 간헐적으로 부드럽게 섞어 2분 이상 얼음 위에 샘플을 놓습니다. 얼음의 잠복기는 샘플 크기와 형에 최적화되어야 합니다. 원심분리기는 10분 동안 4°C에서 1,000 x g에서 원심분리기.
- 상체를 제거하고 NPB의 1 mL에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 샘플을 깨끗한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 옮기는 동안, 파편과 지질이 들어 있는 튜브의 벽을 만지지 마십시오. 샘플에 0.6 U/μL RNase 억제제를 추가하고 혼합합니다. 원심분리기는 4°C에서 1,000 x g에서 10분 동안 다시 원심분리기.
참고: 작은 샘플에 대한 이 단계에서 원심 분리 속도와 시간을 줄여야 합니다. - 상체를 제거하고 핵 세척 버퍼 의 1 mL에서 재연 (2 % BSA / PBS + 0.6 U / μL RNase 억제제).
- 30 μm 필터가 있는 깨끗한 튜브에 이중 필터를 넣습니다. 핵 세척 버퍼의 소량(~300 μL)으로 필터를 세척합니다. 또는 더 작은 시료의 경우 마이크로센심심분리기 튜브에 맞는 30 μm 필터를 사용하여 직접 필터를 입력합니다.
- 건강한 핵의 성공적인 분리를 확인합니다.
- 트라이팬으로 샘플의 작은 알리쿼트염색을 하고 자동화된 세포 카운터를 사용하여 평균 죽은 크기와 죽은 세포를 평가합니다. 대부분 핵을 함유하는 시료의 평균 죽은 크기는 7-10 μm 사이여야 합니다.
- DAPI를 사용하여 샘플의 작은 알리쿼트에 염색하고 20배 이상의 목표 이상의 현미경으로 검사합니다. 핵막은 온전해야 하며 핵은 둥글게 되어야 합니다.
5. FACS 정화 및 핵 농도 단계
- 즉시 FACS 단계로 진행하여 핵을 정화하고 과도한 이물질을 제거합니다. 수집 버퍼에는 핵 세척 버퍼가 포함되어야 합니다. FACS 동안 버퍼가 희석됩니다. 분류 하는 동안 희석을 고려 하는 BSA 와 RNase 억제제의 높은 농도 준비 하는 것이 도움이 됩니다. FACS 수집 블록은 냉각 모드에 있어야 합니다.
- 핵을 정렬한 후, 원심분리기는 500 x g에서 5분 동안 4°C에서 5분 동안 샘플을 농축하였다. 500-1,500 핵/μL의 농도를 달성하기 위해 핵 세척 버퍼의 적절한 부피로 재구성한다. 모든 상체를 제거하려고 시도하지 마십시오. 이렇게 하면 핵손실이 발생할 수 있습니다.
- 혈세포계와 DAPI 염색 알리쿼트를 사용하여 최종 카운트에 대고 핵을 시각화한다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 snRNA-seq로 즉시 진행합니다.
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Representative Results
분류되지 않은 세포 핵에는 다운스트림 단세포 RNA 염기서열분석에서 소음과 높은 배경을 생성하는 이물질과 이중핵이 포함되어 있습니다. 대표적인 FACS 게이트 전략은 그림 1에표시됩니다. 핵은 먼저 전방 분산(FSC) 및 측면 산란(SSC)(A)에 기초하여 선택된 다음, SSC(B)의 폭과 높이의 조합에 기초하여 단일만 선택되었다.AB 마지막으로 DAPI 양수 이벤트만 선택되어 컬렉션버퍼(C)로정렬되었습니다. 이 워크플로우는 핵 응집체 및 세포 이물질을 최소화한 고도로 정제된 단일 핵을제공한다(그림 2).
선별된 핵의 무결성을 확인하기 위해 DAPI 염색 후 현미경으로 시료의 작은 알리쿼트검사를 하였다. 핵막은 그대로 있어야 하며 핵은 둥글어야한다(그림 2B). 정화의 성공을 확인하기 위해, 원심분리 후 상체(즉, 수집 버퍼)를 수집하고 마커 유전자의 실시간 qRT-PCR을 실행하는 것이 좋습니다. 프라이머 세트(표 1의프라이머 서열)를 사용하여 초기, 인트론 함유 UCP1을 증폭하도록 설계되었으며, 정렬된 핵의 상체가 초기 Ucp1 mRNA의 검출 가능한 수준을 포함하지 않았음을 확인하였다(도3). 이 단계는 Cidea, Pgc1-a, Adipoq,또는 Fabp4와같은 갈색, 베이지 또는 백색 반포세포에 매우 풍부한 다른 마커 유전자를 위해 행해질 수 있다.
이러한 프로토콜을 통해 분리되고 확인된 핵은 사실상 임의의 단일 세포 수준 유전자 발현 플랫폼을 실시할 수 있다. 크롬플랫폼(14)의 사용은 8주 된 남성 C57BL/6 마우스로부터 중간 갈색 지방 조직에서 7,500개의 핵의 전사체를 결정하였다(도4). t-분산 스토카즘 이웃 임베딩(t-SNE) 치수 감소 및 K-수단 클러스터링은 갈색 지방세포, 내피 세포, Pdgfrb,반도 세포 선조 및 면역 세포로 표시된 벽화 세포를 포함한 7가지 세포 유형을 밝혀냈습니다. 모든 클러스터는 Fabp4,범석 유전자를 다양한 정도(도4B)로발현하였다. 클러스터의 하위 집합은 Ucp1 mRNA의 높은 수준을 표현한 반면, 다른 클러스터는 산발적으로 Ucp1(그림 4A, C)을발현하였다. 이는 중간 갈색 지방 조직이 Ucp1 발현 및 열발생 활성8,,9를가진 적어도 2개의 뚜렷한 집단을 포함하고 있음을 보여주는 이전 연구와 일치합니다.
도 1: MoFlo XDP 고속 선별기에 의한 핵의 대표적인 유동 세포측정 분석. (A)크기와 세분성. (B)핵 응집체 및 멀티플렉스 의 검출. (C)DAPI 양성 이벤트만 을 선택하는 최종 정렬 게이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 갈색 지방세포로부터 분리된 핵의 대표적인 이미지. (A)MoFLo XDP 정렬 후 (B) 전과(B) A의 흰색 화살표는 그대로 막이없는 핵을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 분리된 핵 및 상부제에 대한 대표적인 qRT-PCR 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 대표적인 10x 크롬 snRNA-seq RT 하에서 8주 된 남성 C57BL/6 마우스로부터 분리된 갈색 분광구에 대한 대표적인 10x 크롬 snRNA-seq 결과. (A)t-SNE 치수 감소 및 7,500개의 핵을 위한 K-수단 클러스터링. k = 9. 클러스터 주석에 사용되는 표준 마커는 괄호안에 표시됩니다. (B)mRNA 발현의 Fabp4,adipocyte-선택적 마커, A에서. 흰색 = 표현식이 없음, 빨간색 = 높은 표현식. (C) Ucp1의mRNA 발현, A의열발생 마커. 이러한 데이터는 단일 실험에서 나온 것입니다. 이러한 수치에 사용되는 snRNA-seq 데이터는 슈퍼시리즈 가입 번호 GSE144720하에서 유전자 발현 옴니버스(GEO)에 증착되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | 종 | 포워드 프라이머 | 역프라이머 |
| Ucp1 (인트론 함유) | 마우스 | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA 태그 CAC CCA TTC C |
표 1: 실시간 qPCR 분석을 위한 프라이머 시퀀스.
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Discussion
단일 핵을 분리하고 지방 조직 이질성을 연구하는 간단하고 견고한 방법이 제시됩니다. 전체 조직 RNA 시퀀싱에 비해,이 워크플로우는 세포 이질성 및 인구 별 마커의 편견보기를 제공합니다. 이것은 지방 세포 생물학, 분자 대사 및 비만 연구의 발전을 위해 중요하고 혁신적입니다.
이 프로토콜은 특히 snRNA-seq의 다운스트림 응용 프로그램에 최적화되어 있습니다. MoFlo XDP 고속 선별기로 건강한 핵을 격리하는 "정리" 단계는 핵 멤브레인 무결성을 유지하면서 원유 서스펜션에서 이물질과 골재를 완전히 제거합니다. 따라서, 이것은 액적 형성에 있는 포획 효율을 증가하고 검출된 유전자의 수의 손실 없이 단 1개의 실행에서 단 하나 핵 전사의 수천을 복구합니다. 조사된 단일 핵 또는 세포의 더 높은 수를 제공하는 물방울 계 단일 세포 플랫폼 외에도, 선별기 계 마이크로플레이트 및 유동성 C1플랫폼(15)은 전사(16)의더 큰 해상도 및 커버리지를 얻기 위해 사용될 수 있다. 이 워크플로우는 고품질 핵을 제공하기 때문에, 시퀀싱(즉, ATAC-시퀀싱)을 사용하여 트랜스포지아제 접근 크롬틴에 대한 분석도 기존 scATAC-seq프로토콜(17)에대한 최소 수정으로 수행될 수 있다.
이 프로토콜의 한 가지 제한은 사이토솔 및 세포막과 같은 비핵구획의 제거로부터 정보를 상실하는 것이다. 예를 들어, 새로운 멀티모달 단세포 분석18,,19세포막 단백질 발현과 전사를 동시에 측정하는 것은 이 프로토콜에 적용될 수 없다.
미래의 목표는 바코드항체(20)를사용하여 이 프로토콜을 핵 멀티플렉스와 결합하는 것이다. 상이한 실험 조건하에서 상이한 지방 조직에서 정렬된 핵은 항핵 모공 복합 항체및 snRNA-seq를 이용하여 바코드화및 풀화될 것이다. 핵 전사와 함께 이러한 바코드를 시퀀싱함으로써, 각 핵은 원래 의 시료에 할당될 수 있고, 교차 시료 멀티플렉스는 명확하게 식별될 수 있으며, 방울계 기반 시스템은 핵당 상당한 비용 절감을 위해 "슈퍼로드"될 수 있다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 알버트 아인슈타인 유전체학 코어에서 데이비드 레이놀즈와 기술 지원을위한 흐름 사이토메트리 코어에서 징항 장 감사드립니다. 우리는 국립 보건원 (NIH) (DK110426) 및 아인슈타인 마운트 시나이 당뇨병 연구 센터 (DK020541) 및 뉴욕 비만 연구 센터 (DK026687)의 파일럿 및 타당성 보조금 (K.S.에 모두)의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 핵심 지원에 대한 알버트 아인슈타인 암 센터 (CA013330)에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
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