Summary
Denne publikasjonen beskriver en protokoll for isolering av kjerner fra modne adicytter, rensing av fluorescensaktivert sortering og encellede nivåtranskripsjon.
Abstract
Brunt og beige fett er spesialisert fettvev som sprer energi for termotilblivelsen ved UCP1 (Frakobling protein-1)-avhengige og uavhengige veier. Inntil nylig ble thermogenic adicytter ansett som en homogen populasjon. Nyere studier har imidlertid indikert at det er flere undertyper eller underpopulasjoner som er forskjellige i utviklingsopprinnelse, substratbruk og transkripsjon. Til tross for fremskritt i encellede genomikk har objektiv nedbrytning av fettvev i cellulære undertyper vært utfordrende på grunn av den skjøre naturen til lipidfylte adipocytes. Protokollen som ble presentert ble utviklet for å omgå disse hindringene ved effektiv isolering av enkeltkjerner fra fettvev for nedstrøms applikasjoner, inkludert RNA-sekvensering. Cellulær heterogenitet kan deretter analyseres ved RNA-sekvensering og bioinformatiske analyser.
Introduction
Studier har vist at brunt fettvev (BAT) har en bemerkelsesverdig evne til å spre energi. To typer thermogenic adicytter med forskjellige utviklingsegenskaper finnes hos både gnagere og mennesker: beige adicytter og klassiske brune adicytter. Mens klassiske brune adiipocytes ligger for det meste i interscapular BAT depoter, beige adiipocytes sporadisk dukke opp i hvitt fettvev (WAT) som svar på visse fysiologiske signaler, for eksempel kronisk kald eksponering, en prosess referert til som eller beiging. Gjennom bruk av avansert bildebehandling er det nå klart at voksne mennesker har betydelige depoter av UCP1+ BAT, spesielt i supraclavicular regionen1,2,3,4. Mengden av voksne menneskelige BAT inverst korrelerer med adiposity og kan økes med eksterne signaler, for eksempel kronisk kald eksponering5,,6 eller β3-adrenerge reseptoragonist7. BAT-mediert energiforbruk kan tilby en levedyktig tilnærming til bekjempelse av fedme.
Inntil nylig har thermogenic adicytter blitt ansett som en homogen populasjon. Studier har imidlertid avdekket eksistensen av flere undertyper eller underpopulasjoner som er forskjellige i utviklingsmessig opprinnelse, substratbruk og transkripsjon8,9,10. For eksempel ble en type beige adiipocyte som fortrinnsvis bruker glukose for termotilblivelsen, g-beige adicytt, nylig beskrevet10. Den ufullstendige forståelsen av celletyper i brunt og beige fettvev og mangelen på spesifikke markører utgjør en kritisk barriere for å studere deres biologiske funksjoner.
Tradisjonelle metoder for å isolere underpopulasjoner av celler er basert på uttrykk for bare noen få kjente markørgener. Nylige fremskritt innen encellede genomikk gjør det mulig å bruke globale genuttrykksdata for enkeltceller for å gi et objektivt estimat av antall underpopulasjoner i et vev. Det endelige målet med denne protokollen er å bestemme alle fettvevsundertyper under ulike thermogenic stimuli ved en enkeltcelleoppløsning. I motsetning til andre vev og celletyper, bestemme cellulære undertyper av fettvev er utfordrende på grunn av skjørhet av lipid-fylt adipocytter. Dette papiret introduserer en robust protokoll for å isolere enkeltkjerner fra fettvev for nedstrøms bruk til snRNA sekvensering. Viktigere, nyere litteratur sammenligne godt matchet single-nuclei RNA sekvensering (snRNA-seq) og encellet RNA sekvensering (scRNA-seq) datasett viste at snRNA-seq er sammenlignbar med scRNA-seq i celletype deteksjon, og overlegen i cellulær dekning for et komplekst vev som hjernen11. Denne protokollen kombinerer en tetthet gradering sentrifugation metode optimalisert for fett vev av Rosen et al.12 med en kjerne "opprydding" trinn med en MoFlo XDP High Speed Sorter. Som sett i de representative resultatene, identifiserte en analyse av 7500 enkeltkjerner fra mus interscapular brunt fettvev flere celletyper i tilsynelatende homogene brune adiipocytes. Samlet sett kan denne enkle og robuste protokollen brukes til å studere organareorganisering av adipocytter og fett-resident celler, identifisering av subtypespesifikke markørgener og utvikling fenotyping av fettselektive knockout / transgene mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrepleie og eksperimentering ble utført i henhold til prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Albert Einstein College of Medicine.
1. Utarbeidelse av vev fordøyelse og lysis buffere
- Forbered vev fordøyelsesbuffer.
- Forbered ~ 1 ml fordøyelsesbuffer for hvert gram fettvev.
- Vei ut 1,5 U/ml kollagenase D og 2,4 U/ml dispase II og tilsett fosfatbufret saltvann (PBS).
- Klargjør nukleos klargjøringsbuffer (NPB).
- Forbered 10 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumklorid, 10 mM kaliumklorid, 250 mM sukrose og 0,1% NP-40 i nukleasefritt vann. Bland godt. Sukrose kan ta lengre tid å oppløse enn de andre komponentene.
- Forbered 0,5% storfe serum albumin (BSA) løsning.
- Forbered 0,5 % BSA i PBS som inneholder EDTA. Det anbefales å bruke steril-filtrert cellekultur klasse PBS (se Tabell over materialer).
2. Enzymatisk fordøyelse av fettvev
- Dissekere mus for å trekke ut fettvev i henhold til Aune et al.13. Samle isolert vev i en tallerken som inneholder PBS. Overfør vevet til et papirhåndkle for å klappe tørt. Legg deretter vevet i en ren tallerken.
- Tilsett kalsiumklorid i fordøyelsesbufferen til en endelig konsentrasjon på 10 mM. Tilsett et lite volum fordøyelsesbuffer til parabolen og hakk fettvevet grundig. Volumet av fordøyelsesbuffer som kreves vil være basert på mengden vev isolert. Vanligvis brukes ~1 ml eller mindre.
- Tilsett omtrent halvparten av mengden forberedt fordøyelsesbuffer (f.eks. ~10 ml for fem mus) til hakket vev. Bruk en serologisk pipette til å overføre prøven til et konisk sentrifugerør på 50 ml. Tilsett eventuell gjenværende buffer for å vaske fatet og overfør til 50 ml-røret som inneholder prøven. Pipette opp og ned flere ganger. Deretter inkubere med risting ved 200-210 rpm ved 37 °C i 12-15 min.
3. Adicytt isolasjon
- Etter inkubasjon, legg til 0,5% BSA med et 1:1-forhold til prøven. Bland godt ved å pipe opp og ned flere ganger. Sentrifuger prøven ved 300 x g i 5 min ved romtemperatur (RT) for å spinne ned den stromale vaskulære fraksjonen (SVF). Adicyttfraksjonen vil forbli i det øverste laget av prøven.
- Plasser et 40 μm cellefilter på toppen av et 50 ml konisk sentrifugerør og filtrer prøven, samle det øverste laget og etterlate SVF nederst i røret. Overfør det øverste laget (adicyttfraksjon) til et nytt rør ved å vende filteret opp ned over røret og bruke 0,5% BSA til å reversere vaskfilteret og samle prøven i røret.
- Ta det totale volumet på 0,5% BSA til 10-15 ml basert på prøvestørrelse og pipette opp og ned med en serologisk pipette eller rist kort opp og ned for å blande prøven. Sentrifuger prøven igjen ved 300 x g i 5 min ved RT.
4. Nuklei isolasjon
- Bruk en bredrørstuppe og overfør forsiktig det øverste laget av prøven til et 100 μm cellefilter plassert på toppen av et nytt forhåndsskranker rør på is, og etterlater eventuelle gjenværende SVF.
- Skyll/vask filteret med tilstrekkelig mengde NPB og kast filteret. Fra dette trinnet fremover har prøven på is så ofte som mulig og arbeid raskt for å unngå lekk og / eller usunn kjerner. Det er nyttig å prechill mikrocentrifuge rør som skal brukes i fremtidige trinn på is.
- Plasser prøven på is i ikke mer enn 2 min med intermitterende skånsom invertering av røret for å blande. Inkubasjonstiden på is bør optimaliseres for prøvestørrelse og type adicytter. Sentrifuge ved 1000 x g ved 4 °C i 10 min.
- Fjern den supernatant og resuspend pellet i 1 ml NPB. Overfør prøven til et rent mikrocentrifugerør. Under overføring, unngå å berøre veggene i røret, som inneholder rusk og lipid. Tilsett 0,6 U/μL RNase-hemmer i prøven og bland. Sentrifuger igjen ved 1000 x g ved 4 °C i 10 min.
MERK: Sentrifugeringshastighet og tid bør reduseres på dette trinnet for mindre prøver. - Fjern supernatanten og resuspend i 1 ml nukleivaskbuffer (2 % BSA/PBS + 0,6 U/μL RNase-hemmer).
- Dobbeltfilter i et rent rør med stables 30 μm filtre. Vaskefilter med et lite volum (~ 300 μL) av Nuclei Wash Buffer. Alternativt, for mindre prøver, bruk et 30 μm filter som passer inn i et mikrocentrifugerør og filtrere direkte inn i det.
- Bekreft vellykket isolering av sunne kjerner.
- Flekk en liten aliquot av prøven med trypan og bruk en automatisert celle teller for å vurdere gjennomsnittlig død størrelse og prosent døde celler. Gjennomsnittlig død størrelse for en prøve som inneholder for det meste kjerner bør variere mellom 7-10 μm. Kjernestørrelse er vanligvis rundt 8 μm.
- Flekk et lite aliquot av prøven med DAPI og undersøk under et mikroskop med et 20x objektivt eller høyere. Atommembranen skal være intakt og kjernene skal være rund.
5. FACS opprydding og kjernekonsentrasjon trinn
- Fortsett umiddelbart til FACS-trinnet for å rydde opp i kjerner og fjerne overflødig rusk. Oppsamlingsbufferen skal inneholde Nuclei Wash Buffer. Under FACS fortynnes bufferen. Å forberede en høyere konsentrasjon av BSA- og RNase-hemmer for å ta høyde for fortynning under sortering er nyttig. FACS-oppsamlingsblokken skal være i kjølemodus.
- Etter sortering av kjernene, sentrifuger ved 500 x g i 5 min ved 4 °C for å konsentrere prøven. Rekonstituer i et passende volum av Nuclei Wash Buffer for å oppnå en konsentrasjon på 500-1500 kjerner/ μL. Ikke forsøk å fjerne alle supernatantene. Dette vil resultere i tap av kjerner.
- Bruk et hemocytometer og en DAPI farget aliquot for en endelig telling og for å visualisere kjernene. Fortsett deretter umiddelbart med snRNA-seq i henhold til produsentens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usorterte adipocytter inneholder rusk og doblere som skaper støy og høy bakgrunn i nedstrøms encellede RNA-sekvensering. Den representative FACS gate-strategien vises i figur 1. Kjernene ble først valgt basert på forover scatter (FSC) og side scatter (SSC) (A), da ble bare singleter valgt basert på kombinasjonen av bredde og høyder av SSC (B). Til slutt ble bare DAPI-positive hendelser valgt og sortert i oppsamlingsbuffer (C). Denne arbeidsflyten gir svært rensede enkeltkjerner med minimerte kjernefysiske aggregater og cellulært rusk (figur 2).
For å bekrefte integriteten til de sorterte kjernene, ble en liten aliquot av prøven inspisert av mikroskop etter DAPI-farging. Atommembranen skal være intakt og kjernene skal være runde (Figur 2B). For å bekrefte rensingens suksess anbefales det også å samle supernatant (dvs. oppsamlingsbuffer) etter sentrifugering og kjøre qRT-PCR i sanntid av et markørgen. Bruk av et primersett (primersekvenser i tabell 1) designet for å forsterke nascent, intron-inneholdende UCP1, bekreftet at supernatanten av sorterte kjerner ikke inneholdt et påviselig nivå av nascent Ucp1 mRNA (Figur 3). Dette trinnet kan gjøres for andre markør gener svært rikelig i brune, beige, eller hvite adipocytter, som Cidea, Pgc1-a, Adipoq, eller Fabp4.
Kjerner isolert og bekreftet gjennom denne protokollen kan bli utsatt for nesten alle encellede genuttrykksplattform. Bruk av kromplattformen14 (10x Genomics) fastslått et transkripsjonsrom på 7500 kjerner fra interscapular brunt fettvev fra 8 uker gamle mannlige C57BL/6 mus (Figur 4). t-distribuert stokastisk nabo embedding (t-SNE) dimensjonalitet reduksjon og K-betyr klynger avslørt syv celletyper, inkludert brune adicytter, endotelceller, veggmaleri celler merket av Pdgfrb, adipocyte stamfarmer, og immunceller. Alle klynger uttrykte Fabp4, et pan-adiipocyte genet, i varierende grad (Figur 4B). Et delsett av klynger uttrykte et høyt nivå av Ucp1 mRNA, mens andre klynger sporadisk uttrykte Ucp1 (Figur 4A, C). Dette er i samsvar med en tidligere studie som viser at interscapular brun fettvev inneholder minst to forskjellige populasjoner med høyt og lavt Ucp1 uttrykk og thermogenic aktivitet8,9.
Figur 1: Representativ flyt cytometrianalyse av kjerner av MoFlo XDP High Speed Sorter. (A)Størrelse og detaljnivå. (B)Påvisning av kjernefysiske aggregater og multipleter. (C)Endelig sorteringsgate velger bare DAPI-positive hendelser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representativt bilde av kjerner isolert fra brune adicytter. (A) Før og (B) etter MoFLo XDP sortering. Hvite piler i A indikerer kjerner uten en intakt membran. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representativt qRT-PCR-resultat for isolerte kjerner og supernatant. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representative 10x krom snRNA-seq resultater for brune adipocytter isolert fra 8 uker gamle mannlige C57BL/6 mus under RT. (A) t-SNE dimensjonalitet reduksjon og K-Means klynger for 7500 kjerner. k = 9. Kanoniske markører som brukes til klyngemermer vises i parentes. (B) mRNA uttrykk for Fabp4, en adipocytt-selektiv markør, i A. Hvit = ingen uttrykk, rød = høyt uttrykk. (C) mRNA uttrykk for Ucp1, thermogenic markør i A. Disse dataene er fra ett enkelt eksperiment. snRNA-seq-data som ble brukt for disse tallene ble deponert i Gene Expression Omnibus (GEO) under superseries tiltredelsesnummer GSE144720. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Genet | Arter | Forover primer | Omvendt primer |
| Ucp1 (Intron-inneholdende) | mus | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA TAG CAC CCA TTC C |
Tabell 1: Primersekvenser for qPCR-analyse i sanntid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enkel og robust metode for å isolere enkeltkjerner og studere fettvev heterogenitet presenteres. Sammenlignet med hele vev RNA sekvensering, denne arbeidsflyten tilbyr en objektiv visning av cellulær heterogenitet og populasjonsspesifikke markører. Dette er betydelig og nyskapende for fremme av adicyttbiologi, molekylær metabolisme, og fedme forskning.
Denne protokollen er spesielt optimalisert for nedstrøms bruk av snRNA-seq. "Opprydding" trinn for å oppnå isolasjon av sunne kjerner med MoFlo XDP High Speed Sorter fjerner fullstendig rusk og aggregater fra rå suspensjon samtidig som kjernefysisk membranintegritet opprettholdes. Derfor øker dette fangsteffektiviteten i dråpedannelsen og gjenoppretter tusenvis av enkeltkjerner transkripsjoner fra bare ett løp uten tap av antall oppdagede gener. I tillegg til dråpebaserte encellede plattformer, som gir et høyere antall undersøkte enkeltkjerner eller celler, kan sorterbasert mikroplate og Fluidigm C1-plattformer15 også brukes til å oppnå større oppløsning og dekning av transkripsjonsmetoden16. Fordi denne arbeidsflyten tilbyr høykvalitets kjerner, kan analyser for transposase-tilgjengelig kromatin ved hjelp av sekvensering (dvs. ATAC-sekvensering) også utføres med minimumsendringer i den eksisterende scATAC-seq-protokollen17.
En begrensning av denne protokollen er tap av informasjon fra fjerning av ikke-nukleære rom, for eksempel cytosol og cellulær membran. For eksempel, nye multimodale encellede analyser18,19 som samtidig måler cellemembran protein uttrykk og transkripsjonen kan ikke brukes på denne protokollen.
Det fremtidige målet er å kombinere denne protokollen med kjerner multipleksing ved hjelp av strekkodede antistoffer20. Sorterte kjerner fra forskjellige fettvev under forskjellige eksperimentelle forhold vil bli strekkodet og samlet ved hjelp av et antinukleært porekomplekst antistoff og snRNA-seq vil bli utført. Ved å sekvensere disse strekkodene sammen med kjernefysiske transkripsjoner, kan hver kjerne tilordnes til sin opprinnelige prøve, kryss-prøve multiplets kan tydelig identifiseres, og dråpebaserte systemer kan være "super-lastet" for betydelig kostnadsreduksjon per kjerner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke David Reynolds fra Albert Einstein Genomics-kjernen og Jinghang Zhang fra Flow Cytometry Core for teknisk støtte. Vi anerkjenner støtte fra National Institutes of Health (NIH) (DK110426) og Pilot and Feasibility Grants fra Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) og New York Obesity Research Center (DK026687) (alle til K.S.). Vi vil også takke Albert Einstein Cancer Center (CA013330) for kjernestøtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).
- Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).
- Yoneshiro, T., et al. Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans. The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).
- Cypess, A. M., et al. Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist. Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).
- Song, A., et al. Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).
- Cinti, S., et al. CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).
- Chen, Y., et al. Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state. Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PloS One. 13 (12), e0209648 (2018).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191 (2013).
- Zheng, G. X. Y., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs. Nature Communications. 9 (1), 619 (2018).
- Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).
- Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
- Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
