Summary
Esta publicação descreve um protocolo para o isolamento de núcleos de adipócitos maduros, purificação por classificação ativada por fluorescência e transcrição de nível unicelular.
Abstract
A gordura marrom e bege são tecidos adiposos especializados que dissipam energia para termogênese pela UCP1 (Uncoupling Protein-1) -dependent and independent pathways. Até recentemente, os adipócitos termogênicos eram considerados uma população homogênea. No entanto, estudos recentes indicaram que existem múltiplos subtipos ou subpopulações que são distintos na origem do desenvolvimento, uso de substrato e transcriptome. Apesar dos avanços na genômica unicelular, a decomposição imparcial dos tecidos adiposos em subtipos celulares tem sido desafiadora devido à natureza frágil dos adipócitos preenchidos com lipídios. O protocolo apresentado foi desenvolvido para contornar esses obstáculos pelo isolamento efetivo de núcleos únicos do tecido adiposo para aplicações a jusante, incluindo sequenciamento de RNA. A heterogeneidade celular pode então ser analisada por sequenciamento de RNA e análises bioinformáticas.
Introduction
Estudos mostraram que o tecido adiposo marrom (BAT) tem uma capacidade notável de dissipar energia. Dois tipos de adipócitos termogênicos com características distintas do desenvolvimento existem tanto em roedores quanto em humanos: adipócitos bege e adipócitos marrons clássicos. Enquanto os adipócitos marrons clássicos estão localizados principalmente em depósitos de BAT interscapulares, adipócitos beges emergem esporadicamente em tecido adiposo branco (WAT) em resposta a certos sinais fisiológicos, como exposição ao frio crônico, um processo chamado de "browning" ou "beiging". Através do uso de imagens avançadas, agora está claro que os seres humanos adultos possuem depósitos substanciais de UCP1+ BAT, especialmente na região supraclavicular1,,2,,3,4. A quantidade de BAT humano adulto se correlaciona inversamente com adiposidade e pode ser aumentada por pistas externas, como exposição ao frio crônico5,,6 ou β3-adrenergic receptor agonista7. O gasto energético mediado pelo BAT pode oferecer uma abordagem viável para combater a obesidade.
Até recentemente, os adipócitos termogênicos têm sido considerados uma população homogênea. No entanto, estudos revelaram a existência de múltiplos subtipos ou subpopulações distintas em origem desenvolvimento, uso de substrato e transcriptome8,,9,,10. Por exemplo, um tipo de adipócito bege que usa preferencialmente glicose para termogênese, o adipócito g-bege, foi recentemente descrito10. A compreensão incompleta dos tipos celulares no tecido adiposo marrom e bege e a falta de marcadores específicos constituem uma barreira crítica para estudar suas funções biológicas.
Os métodos tradicionais para isolar subpopulações de células são baseados na expressão de apenas alguns genes marcadores conhecidos. Os recentes avanços na genômica unicelular permite o uso de dados globais de expressão genética de células únicas para fornecer uma estimativa imparcial do número de subpopulações em um tecido. O objetivo final deste protocolo é determinar todos os subtipos de tecido adiposo sob vários estímulos termogênicos em uma resolução unicelular. Em contraste com outros tecidos e tipos celulares, determinar subtipos celulares de tecido adiposo é desafiador devido à fragilidade dos adipócitos preenchidos com lipídios. Este artigo introduz um protocolo robusto para isolar núcleos únicos do tecido adiposo para aplicação a jusante ao sequenciamento snRNA. É importante ressaltar que a literatura recente comparando o sequenciamento de RNA uninuclei bem combinado (snRNA-seq) e os conjuntos de dados de sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) revelaram que o snRNA-seq é comparável ao scRNA-seq na detecção do tipo celular e superior na cobertura celular para um tecido complexo como o cérebro11. Este protocolo combina um método de centrifugação de gradiente de densidade otimizado para tecidos adiposos por Rosen et al.12 com um passo de "limpeza" de núcleos com um Sorter de Alta Velocidade MoFlo XDP. Como visto nos resultados representativos, uma análise de 7.500 núcleos únicos do tecido adiposo marrom interscapular do rato identificou vários tipos de células dentro de adipócitos marrons aparentemente homogêneos. No geral, este protocolo simples e robusto pode ser aplicado para estudar a organização de nível tecidual de adipócitos e células residentes de adiposos, identificação de genes marcadores específicos do subtipo e fenotipagem de desenvolvimento de camundongos eliminatórios/transgênicos adiposos.
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Protocol
O cuidado e a experimentação em animais foram realizados de acordo com os procedimentos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina Albert Einstein.
1. Preparação de tampões de digestão tecidual e lise
- Prepare o tampão de digestão do tecido.
- Prepare ~1 mL de tampão de digestão para cada grama de tecido adiposo.
- Pesar 1,5 U/mL colagenase D e 2,4 U/mL dispase II e adicionar soro fisiológico tamponado fosfato (PBS).
- Prepare o tampão de preparação dos núcleos (NPB).
- Prepare 10 mM HEPES, 1,5 mM cloreto de magnésio, cloreto de potássio de 10 mM, 250 mM de sacarose e 0,1% NP-40 em água sem nuclease. Misture bem. A sacarose pode levar mais tempo para se dissolver do que os outros componentes.
- Prepare 0,5% solução de gérico bovino (BSA).
- Prepare 0,5% BSA em PBS contendo EDTA. Recomenda-se o uso de PBS de cultura celular filtrada estéril (ver Tabela de Materiais).
2. Digestão enzimática do tecido adiposo
- Dissecar camundongos para extrair tecido adiposo de acordo com Aune et al.13. Coletar tecido isolado em um prato contendo PBS. Transfira o tecido para uma toalha de papel para secar. Em seguida, coloque o tecido em um prato limpo.
- Adicione cloreto de cálcio ao tampão de digestão a uma concentração final de 10 mM. Adicione um pequeno volume de tampão de digestão ao prato e pique completamente o tecido adiposo. O volume do tampão de digestão necessário será baseado na quantidade de tecido isolado. Normalmente ~ 1 mL ou menos é usado.
- Adicione cerca de metade da quantidade de tampão de digestão preparado (por exemplo, ~10 mL para cinco camundongos) ao tecido picado. Usando uma pipeta sorológica, transfira a amostra para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Adicione qualquer quantidade restante de tampão para lavar o prato e transfira para o tubo de 50 mL contendo a amostra. Pipeta para cima e para baixo várias vezes. Em seguida, incubar com agitação a 200-210 rpm a 37 °C para 12-15 min.
3. Isolamento adipócito
- Após a incubação, adicione 0,5% de BSA a uma proporção de 1:1 para a amostra. Misture bem por pipetting para cima e para baixo várias vezes. Centrifugar a amostra a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT) para girar a fração vascular estromada (SVF). A fração de adipócito permanecerá na camada superior da amostra.
- Coloque um filtro de célula de 40 μm em cima de um tubo de centrífuga cônica de 50 mL e filtre a amostra, coletando a camada superior e deixando para trás o SVF na parte inferior do tubo. Transfira a camada superior (fração de adipócito) para um novo tubo, virando o filtro de cabeça para baixo sobre o tubo e usando 0,5% de BSA para lavar o filtro e coletar a amostra no tubo.
- Leve o volume total de 0,5% BSA a 10-15 mL com base no tamanho da amostra e pipeta para cima e para baixo com uma pipeta sorológica ou agite brevemente para cima e para baixo para misturar a amostra. Centrifugar a amostra novamente a 300 x g por 5 min no RT.
4. Isolamento dos núcleos
- Use uma ponta de pipeta de furo largo e transfira cuidadosamente a camada superior da amostra para um filtro de célula de 100 μm colocado em cima de um novo tubo pré-filhinho no gelo, deixando para trás qualquer SVF residual.
- Enxágüe/lave o filtro com uma quantidade suficiente de NPB e descarte o filtro. A partir deste passo em frente tem a amostra no gelo o mais frequentemente possível e trabalhar rapidamente para evitar núcleos vazando e/ou insalubres. É útil para pré-gelo microcentrifugar tubos para serem usados em passos futuros no gelo.
- Coloque a amostra no gelo por não mais do que 2 minutos com a inversão suave intermitente do tubo para misturar. O tempo de incubação no gelo deve ser otimizado para o tamanho da amostra e o tipo de adipócitos. Centrifugar a 1.000 x g a 4 °C por 10 min.
- Remova o supernatante e resuspense a pelota em 1 mL de NPB. Transfira a amostra para um tubo de microcentrifuuagem limpo. Durante a transferência, evite tocar nas paredes do tubo, que contêm detritos e lipídios. Adicione 0,6 U/μL Inibidor de RNase à amostra e misture. Centrifugar novamente a 1.000 x g a 4 °C por 10 min.
NOTA: A velocidade e o tempo de centrifugação devem ser diminuídos nesta etapa para amostras menores. - Remova o supernasciente e resuspend em 1 mL de Tampão de Lavagem Nuclei (2% BSA/PBS + 0,6 U/μL RNase inibidor).
- Filtro duplo em um tubo limpo com filtros empilháveis de 30 μm. Lave o filtro com um pequeno volume (~300 μL) de Nuclei Wash Buffer. Alternativamente, para amostras menores, use um filtro de 30 μm que se encaixe em um tubo de microcentrifuuagem e filtre diretamente nele.
- Confirme o isolamento bem sucedido de núcleos saudáveis.
- Manche uma pequena alíquota da amostra com tripano e use um contador de células automatizado para avaliar o tamanho médio dos mortos e por cento das células mortas. O tamanho médio morto para uma amostra contendo principalmente núcleos deve variar entre 7-10 μm. O tamanho dos núcleos é geralmente em torno de 8 μm.
- Colorique uma pequena alíquota da amostra com DAPI e examine sob um microscópio com um objetivo de 20x ou superior. A membrana nuclear deve estar intacta e os núcleos devem estar redondos.
5. ETAPA DE limpeza e concentração de núcleos FACS
- Proceda imediatamente ao passo FACS para limpar núcleos e remover quaisquer detritos em excesso. O buffer de coleta deve conter o tampão de lavagem dos núcleos. Durante o FACS, o buffer é diluído. Preparar uma maior concentração de inibidor de BSA e RNase para explicar a diluição durante a triagem é útil. O bloco de coleta FACS deve estar no modo de resfriamento.
- Após a triagem dos núcleos, centrífuga a 500 x g por 5 min a 4 °C para concentrar a amostra. Reconstituir em um volume apropriado de Buffer de Lavagem de Núcleos para alcançar uma concentração de 500-1.500 núcleos/μL. Não tente remover todo o supernatante. Isso resultará na perda de núcleos.
- Use um hemócito e uma alíquota manchada de DAPI para uma contagem final e para visualizar os núcleos. Em seguida, proceda imediatamente com snRNA-seq de acordo com o protocolo do fabricante.
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Representative Results
Núcleos adipócitos não variados contêm detritos e doublets que criam ruído e fundo alto no sequenciamento de RNA de célula única a jusante. A estratégia representativa do portão FACS é mostrada na Figura 1. Os núcleos foram selecionados primeiro com base na dispersão dianteira (FSC) e dispersão lateral (SSC) (A),depois, apenas singlets foram selecionados com base na combinação de largura e alturas de SSC (B). Finalmente, apenas eventos DAPI positivos foram selecionados e classificados em buffer de coleta(C). Este fluxo de trabalho fornece núcleos únicos altamente purificados com agregados nucleares minimizados e detritos celulares(Figura 2).
Para confirmar a integridade dos núcleos classificados, uma pequena alíquota da amostra foi inspecionada por microscópio após a coloração da DAPI. A membrana nuclear deve estar intacta e os núcleos devem ser redondos(Figura 2B). Para confirmar o sucesso da purificação, também é recomendado coletar supernasce (ou seja, tampão de coleta) após centrifugação e executar qRT-PCR em tempo real de um gene marcador. O uso de um conjunto de primer (sequências de primer na Tabela 1) projetado para amplificar UCP1 nascente, contendo intron, confirmou que o supernatante de núcleos ordenados não continha um nível detectável de ucp1 mRNA nascente(Figura 3). Este passo pode ser feito para outros genes marcadores altamente abundantes em adipócitos marrons, beges ou brancos, como Cidea, Pgc1-a, Adipoqou Fabp4.
Núcleos isolados e confirmados através deste protocolo podem ser submetidos a praticamente qualquer plataforma de expressão genética de nível de célula única. O uso da plataforma Chromium14 (10x Genomics) determinou um transcriptome de 7.500 núcleos de tecido adiposo marrom interscapular de camundongos C57BL/6 masculinos de 8 semanas de idade(Figura 4). T-distributed stochastic neighbor incorporando (t-SNE) redução de dimensionalidade e agrupamento k-meio revelou sete tipos de células, incluindo adipócitos marrons, células endoteliais, células mural marcadas por Pdgfrb,progenitores adipócitos e células imunes. Todos os clusters expressaram Fabp4, um gene pan-adipocyte, em graus variados(Figura 4B). Um subconjunto de clusters expressou um alto nível de Ucp1 mRNA, enquanto outros clusters expressaram esporadicamente Ucp1 (Figura 4A,C). Isso é consistente com um estudo anterior mostrando que o tecido adiposo marrom interscapular contém pelo menos duas populações distintas com alta e baixa expressão ucp1 e atividade termogênica8,9.
Figura 1: Análise representativa da citometria de fluxo dos núcleos por MoFlo XDP High Speed Sorter. (A) Tamanho e granularidade. (B) Detecção de agregados nucleares e multiplets. (C) Portão de classificação final selecionando apenas eventos POSITIVOS DAPI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem representativa de núcleos isolados de adipócitos marrons. (A) Antes e (B) após a classificação moflo XDP. Setas brancas em A indicam núcleos sem uma membrana intacta. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultado representativo qRT-PCR para núcleos isolados e supernascidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Representante 10x chromium snRNA-seq resultados para adipócitos marrons isolados de camundongos C57BL/6 masculinos de 8 semanas de idade sob RT. (A) redução de dimensionalidade t-SNE e agrupamento K-Means para 7.500 núcleos. k = 9. Marcadores canônicos usados para anotações de cluster são mostrados entre parênteses. (B) expressão mRNA de Fabp4, um marcador adipócito-seletivo, em A. Branco = sem expressão, vermelho = alta expressão. (C) expressão mRNA de Ucp1, marcador termogênico em A. Esses dados são de um único experimento. os dados snRNA-seq utilizados para esses números foram depositados no Gene Expression Omnibus (GEO) sob o número de adesão de superséries GSE144720. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Gene | Espécie | Primer para a frente | Primer reverso |
| Ucp1 (intron-contendo) | Mouse | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA TAG CAC CCA TTC C |
Tabela 1: Sequências de primer para análise qPCR em tempo real.
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Discussion
Um método simples e robusto para isolar núcleos únicos e estudar a heterogeneidade do tecido adiposo é apresentado. Comparado ao sequenciamento de RNA de tecido inteiro, este fluxo de trabalho oferece uma visão imparcial da heterogeneidade celular e marcadores específicos da população. Isso é significativo e inovador para o avanço da biologia adipócito, metabolismo molecular e pesquisa sobre obesidade.
Este protocolo é particularmente otimizado para a aplicação a jusante de snRNA-seq. O passo de "limpeza" para alcançar o isolamento de núcleos saudáveis com o Sorter de Alta Velocidade MoFlo XDP remove completamente os detritos e agregados da suspensão bruta, mantendo a integridade da membrana nuclear. Portanto, isso aumenta a eficiência de captura na formação de gotículas e recupera milhares de transcritos de núcleos únicos de apenas uma corrida sem perda do número de genes detectados. Além das plataformas unicelulares baseadas em gotículas, que fornecem um maior número de núcleos ou células únicas pesquisadas, as plataformas15 baseadas em classificados e Fluidigm C1 também podem ser usadas para obter maior resolução e cobertura do transcriptome16. Como este fluxo de trabalho oferece núcleos de alta qualidade, ensaios para cromatina acessível à transposição usando sequenciamento (ou seja, sequenciamento ATAC) também podem ser realizados com modificações mínimas no protocolo scATAC-seq existente17.
Uma limitação deste protocolo é a perda de informações da remoção de compartimentos não nucleares, como o citosol e a membrana celular. Por exemplo, análises multimodais emergentes de células únicas18,19 que medem simultaneamente a expressão da proteína da membrana celular e o transcriptome não podem ser aplicados a este protocolo.
O objetivo futuro é combinar este protocolo com multiplexamento de núcleos usando anticorpos com código de barras20. Núcleos classificados de diferentes tecidos adiposos em diferentes condições experimentais serão codificados em código de barras e agrupados usando um anticorpo complexo de poroso antinuclear e snRNA-seq será realizado. Ao sequenciar esses códigos de barras ao lado do transcriptome nuclear, cada núcleo pode ser atribuído à sua amostra original, múltiplos de amostras cruzadas podem ser claramente identificados e sistemas baseados em gotículas podem ser "super-carregados" para redução significativa de custos por núcleos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a David Reynolds do núcleo de Genômica Albert Einstein e Jinghang Zhang do Núcleo de Citometria de Fluxo pelo apoio técnico. Reconhecemos o apoio dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) (DK110426) e do Pilot and Feasibility Grants do Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center (DK020541) e do New York Obesity Research Center (DK026687) (todos para K.S.). Também gostaríamos de agradecer ao Albert Einstein Cancer Center (CA013330) pelo apoio do núcleo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
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