Summary
Esta publicación describe un protocolo para el aislamiento de núcleos de adipocitos maduros, purificación por clasificación activada por fluorescencia y transcriptómica a nivel de una sola célula.
Abstract
La grasa marrón y beige son tejidos adiposos especializados que disipan la energía para la termogénesis por UCP1 (Unacoupling Protein-1) y vías independientes. Hasta hace poco, los adipocitos termogénicos se consideraban una población homogénea. Sin embargo, estudios recientes han indicado que hay múltiples subtipos o subpoblaciones que son distintas en el origen del desarrollo, el uso del sustrato y el transcriptoma. A pesar de los avances en la genómica de una sola célula, la descomposición imparcial de los tejidos adiposos en subtipos celulares ha sido difícil debido a la naturaleza frágil de los adipocitos llenos de lípidos. El protocolo presentado fue desarrollado para eludir estos obstáculos mediante el aislamiento efectivo de núcleos únicos del tejido adiposo para aplicaciones posteriores, incluida la secuenciación de ARN. La heterogeneidad celular se puede analizar mediante secuenciación de ARN y análisis bioinformáticos.
Introduction
Los estudios han demostrado que el tejido adiposo marrón (BAT) tiene una capacidad notable para disipar la energía. Existen dos tipos de adipocitos termogénicos con características de desarrollo distintas tanto en roedores como en humanos: adipocitos beige y adipocitos marrones clásicos. Mientras que los adipocitos marrones clásicos se encuentran principalmente en depósitos de BAT interescapulares, los adipocitos beige emergen esporádicamente en el tejido adiposo blanco (WAT) en respuesta a ciertas señales fisiológicas, como la exposición crónica al frío, un proceso conocido como "marrón" o "beiging". Mediante el uso de imágenes avanzadas, ahora está claro que los seres humanos adultos tienen depósitos sustanciales de UCP1+ BAT, especialmente en la región supraclavicular1,2,3,4. La cantidad de BAT humano adulto se correlaciona inversamente con la adiposidad y puede aumentarse mediante señales externas, como la exposición crónica al frío5,6 o 3-adrenergic receptor agonista7. El gasto de energía mediado por los BAT puede ofrecer un enfoque viable para combatir la obesidad.
Hasta hace poco, los adipocitos termogénicos se han considerado una población homogénea. Sin embargo, los estudios han revelado la existencia de múltiples subtipos o subpoblaciones que son distintas en el origen del desarrollo, el uso del sustrato, y el transcriptoma8,,9,,10. Por ejemplo, recientemente se describió un tipo de adipocitos beige que utiliza preferentemente glucosa para la termogénesis, el adipocitos g-beige,10. La comprensión incompleta de los tipos de células en el tejido adiposo marrón y beige y la falta de marcadores específicos constituyen una barrera crítica para el estudio de sus funciones biológicas.
Los métodos tradicionales para aislar las subpoblaciones de las células se basan en la expresión de sólo unos pocos genes marcadores conocidos. Los avances recientes en la genómica de una sola célula permiten el uso de datos de expresión génica global de células individuales para proporcionar una estimación imparcial del número de subpoblaciones en un tejido. El objetivo final de este protocolo es determinar todos los subtipos de tejido adiposo bajo diversos estímulos termogénicos a una resolución de una sola célula. A diferencia de otros tejidos y tipos celulares, determinar los subtipos celulares del tejido adiposo es un desafío debido a la fragilidad de los adipocitos llenos de lípidos. Este documento introduce un protocolo robusto para aislar núcleos individuales del tejido adiposo para su aplicación posterior a la secuenciación de ARN. Es importante destacar que la literatura reciente que compara la secuenciación de ARN de un solo núcleo (snRNA-seq) y la secuenciación de ARN de una sola célula (scRNA-seq) reveló que el snRNA-seq es comparable al scRNA-seq en la detección de tipos de células, y superior en cobertura celular para un tejido complejo como el cerebro11. Este protocolo combina un método de centrifugación de gradiente de densidad optimizado para tejidos adiposos por Rosen et al.12 con un paso de "limpieza" de núcleos con un clasificador de alta velocidad MoFlo XDP. Como se ve en los resultados representativos, un análisis de 7.500 núcleos individuales del tejido adiposo marrón interescapular del ratón identificó múltiples tipos de células dentro de adipocitos marrones aparentemente homogéneos. En general, este protocolo simple y robusto se puede aplicar para estudiar la organización a nivel de tejido de adipocitos y células residentes en adiposos, la identificación de genes marcadores específicos de subtipos y el fenotipado de desarrollo de ratones noqueantes/transgénicos selectivos de adiposo.
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Protocol
El cuidado y la experimentación de animales se realizaron de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Colegio de Medicina Albert Einstein.
1. Preparación de la digestión tisular y tampones de la lesis
- Preparar el tampón de digestión tisular.
- Preparar 1 ml de tampón de digestión por cada gramo de tejido adiposo.
- Pesar 1,5 U/ml de colagenasa D y 2,4 U/ml disase II y añadir solución salina tamponada de fosfato (PBS).
- Preparar el tampón de preparación de núcleos (NPB).
- Preparar HEPES de 10 mM, cloruro de magnesio de 1,5 mM, cloruro de potasio de 10 mM, sacarosa de 250 mM y 0,1% de NP-40 en agua libre de nucleasas. Mezcla bien. La sacarosa puede tardar más tiempo en disolverse que los otros componentes.
- Preparar una solución de albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5%.
- Preparar 0.5% BSA en PBS que contenga EDTA. Se recomienda utilizar PBS de grado de cultivo celular filtrado estéril PBS (ver Tabla de materiales).
2. Digestión enzimática del tejido adiposo
- Diseccionar ratones para extraer tejido adiposo según Aune et al.13. Recoger tejido aislado en un plato que contenga PBS. Transfiera el pañuelo a una toalla de papel para secarlo con palmaditas. Luego coloque el tejido en un plato limpio.
- Añadir cloruro de calcio al tampón de digestión a una concentración final de 10 mM. Agregue un pequeño volumen de tampón de digestión al plato y sopla bien el tejido adiposo. El volumen de tampón de digestión requerido se basará en la cantidad de tejido aislado. Por lo general, se utiliza 1 ml o menos.
- Añadir aproximadamente la mitad de la cantidad de tampón de digestión preparado (p. ej., 10 ml para cinco ratones) al tejido picado. Con una pipeta serológica, transfiera la muestra a un tubo de centrífuga cónica de 50 ml. Agregue la cantidad restante de tampón para lavar el plato y transferirlo al tubo de 50 ml que contiene la muestra. Pipetear arriba y abajo varias veces. A continuación, incubar con agitación a 200-210 rpm a 37 oC durante 12-15 min.
3. Aislamiento de adipocitos
- Después de la incubación, agregue 0.5% BSA en una proporción de 1:1 a la muestra. Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT) para girar hacia abajo la fracción vascular estromal (SVF). La fracción de adipocitos permanecerá en la capa superior de la muestra.
- Coloque un filtro de celda de 40 m en la parte superior de un tubo de centrífuga cónica de 50 ml y filtre la muestra, recogiendo la capa superior y dejando atrás el SVF en la parte inferior del tubo. Transfiera la capa superior (fracción de adipocitos) a un nuevo tubo volteando el filtro boca abajo sobre el tubo y usando 0.5% BSA para revertir lavar el filtro y recoger la muestra en el tubo.
- Lleve el volumen total de 0.5% BSA a 10-15 mL basado en el tamaño de la muestra y la pipeta hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica o agitar brevemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar la muestra. Centrifugar la muestra de nuevo a 300 x g durante 5 minutos en RT.
4. Aislamiento de núcleos
- Utilice una punta de pipeta de diámetro ancho y transfiera cuidadosamente la capa superior de la muestra a un filtro de celda de 100 m colocado encima de un nuevo tubo prechilled sobre hielo, dejando atrás cualquier SVF residual.
- Enjuague/lave el filtro con una cantidad suficiente de NPB y deseche el filtro. Desde este paso adelante tener la muestra sobre hielo tan a menudo como sea posible y trabajar rápidamente para evitar núcleos con fugas y / o mal en salud. Es útil para prechill microcentrífuga tubos para ser utilizado en pasos futuros sobre hielo.
- Coloque la muestra sobre hielo durante no más de 2 minutos con la invertida suave intermitente del tubo para mezclar. El tiempo de incubación en hielo debe optimizarse para el tamaño de la muestra y el tipo de adipocitos. Centrifugar a 1.000 x g a 4oC durante 10 min.
- Retire el sobrenadante y resusppend el pellet en 1 ml de NPB. Transfiera la muestra a un tubo de microcentrífuga limpio. Durante la transferencia, evite tocar las paredes del tubo, que contienen desechos y lípidos. Añadir 0,6 U/L inhibidor de la RNase a la muestra y mezclar. Centrifugar de nuevo a 1.000 x g a 4 oC durante 10 min.
NOTA: La velocidad y el tiempo de centrifugación deben reducirse en este paso para muestras más pequeñas. - Retire el sobrenadante y el resuspend en 1 ml de Nuclei Wash Buffer (2% BSA/PBS + 0,6 U/L inhibidor de la RNase).
- Doble filtro en un tubo limpio con filtros apilables de 30 m. Lávese el filtro con un pequeño volumen (300 l) de Nuclei Wash Buffer. Alternativamente, para muestras más pequeñas, utilice un filtro de 30 m que se ajuste a un tubo de microcentrífuga y filtre directamente en él.
- Confirme el aislamiento exitoso de núcleos sanos.
- Manchar una pequeña alícuota de la muestra con tripano y utilizar un contador de células automatizado para evaluar el tamaño promedio de las células muertas y el porcentaje de células muertas. El tamaño medio de los núcleos para una muestra que contenga principalmente núcleos debe oscilar entre 7-10 m. El tamaño de los núcleos suele ser de alrededor de 8 m.
- Manchar una pequeña alícuota de la muestra con DAPI y examinar bajo un microscopio con un objetivo 20x o superior. La membrana nuclear debe estar intacta y los núcleos deben ser redondos.
5. Paso de limpieza y concentración de núcleos FACS
- Proceda inmediatamente al paso FACS para limpiar los núcleos y eliminar cualquier exceso de escombros. El búfer de colección debe contener Nuclei Wash Buffer. Durante el FACS se diluye el búfer. Preparar una mayor concentración de BSA e inhibidor de la RNase para tener en cuenta la dilución durante la clasificación es útil. El bloque de recogida FACS debe estar en modo de refrigeración.
- Después de clasificar los núcleos, centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 oC para concentrar la muestra. Reconstituir en un volumen adecuado de tampón de lavado de núcleos para lograr una concentración de 500-1.500 núcleos/L. No intente quitar todo el sobrenadante. Si lo hace, se perderán núcleos.
- Utilice un hemocicómetro y una alícuota teñida DAPI para un recuento final y para visualizar los núcleos. A continuación, proceda inmediatamente con snRNA-seq de acuerdo con el protocolo del fabricante.
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Representative Results
Los núcleos de adipocitos no clasificados contienen desechos y dobletes que crean ruido y un alto fondo en la secuenciación de ARN de una sola célula aguas abajo. La estrategia representativa de la puerta FACS se muestra en la Figura 1. Los núcleos se seleccionaron primero en función de la dispersión hacia delante (FSC) y la dispersión lateral (SSC) (A), y luego, sólo se seleccionaron singlets en función de la combinación de anchura y alturas de SSC (B). Por último, solo se seleccionaron eventos DAPI positivos y se ordenaron en búfer de recopilación (C). Este flujo de trabajo proporciona núcleos individuales altamente purificados con agregados nucleares minimizados y desechos celulares (Figura 2).
Para confirmar la integridad de los núcleos clasificados, una pequeña alícuota de la muestra fue inspeccionada por microscopio después de la tinción DAPI. La membrana nuclear debe estar intacta y los núcleos deben ser redondos(Figura 2B). Para confirmar el éxito de la purificación, también se recomienda recoger el sobrenadante (es decir, el tampón de recolección) después de la centrifugación y ejecutar qRT-PCR en tiempo real de un gen marcador. El uso de un conjunto de imprimación (secuencias de imprimación en la Tabla 1)diseñado para amplificar el UCP1 naciente, que contiene intrón, confirmó que el sobrenadante de núcleos clasificados no contenía un nivel detectable de ARNm Ucp1 naciente (Figura 3). Este paso se puede hacer para otros genes marcadores altamente abundantes en adipocitos marrones, beige o blancos, como Cidea, Pgc1-a, Adipoqo Fabp4.
Los núcleos aislados y confirmados a través de este protocolo pueden ser sometidos a prácticamente cualquier plataforma de expresión génica de nivel de célula única. El uso de la plataforma de cromo14 (10x Genómica) determinó un transcriptoma de 7.500 núcleos de tejido adiposo marrón intercapular de ratones C57BL/6 machos de 8 semanas de edad (Figura 4). La reducción de la dimensionalidad del vecino estocástico distribuido en T (t-SNE) y la agrupación en medios K revelaron siete tipos de células, incluyendo adipocitos marrones, células endoteliales, células murales marcadas por Pdgfrb,progenitores adipocitos y células inmunitarias. Todos los racimos expresaron Fabp4,un gen pan-adipocitos, en diferentes grados (Figura 4B). Un subconjunto de clústeres expresaba un alto nivel de ARNm Ucp1, mientras que otros grupos expresaba esporádicamente Ucp1 (Figura 4A,C). Esto es consistente con un estudio anterior que muestra que el tejido adiposo marrón interescapular contiene al menos dos poblaciones distintas con alta y baja expresión de Ucp1 y actividad termogénica8,,9.
Figura 1: Análisis representativo de citometría de flujo de núcleos por MoFlo XDP High Speed Sorter. (A) Tamaño y granularidad. (B) Detección de agregados y múltiplos nucleares. (C) Puerta de clasificación final seleccionando solo eventos DAPI positivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imagen representativa de núcleos aislados de adipocitos marrones. (A) Antes y (B) después de la clasificación de MoFLo XDP. Las flechas blancas en A indican núcleos sin una membrana intacta. Barra de escala a 50 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultado representativo de qRT-PCR para núcleos aislados y el sobrenadante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de 10x de cromo snRNA-seq para adipocitos marrones aislados de ratones C57BL/6 machos de 8 semanas de edad bajo RT. (A) Reducción de la dimensionalidad t-SNE y agrupación de medios K para 7.500 núcleos. k 9. Los marcadores canónicos utilizados para anotaciones de clúster se muestran entre paréntesis. (B) expresión de ARNm de Fabp4, un marcador selectivo de adipocitos, en A. Blanco, sin expresión, rojo, expresión alta. (C) expresión de ARNm de Ucp1, marcador termogénico en A. Estos datos proceden de un único experimento. Los datos snRNA-seq utilizados para estas cifras se depositaron en el Gene Expression Omnibus (GEO) bajo el número de adhesión de las superseries GSE144720. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gene | Especies | Adelante primer | Imprimación inversa |
| Ucp1 (que contiene Intron) | Ratón | GAT CTT CTC AGC CGG AGT TTC | CCT TCC TAA TAG CAC CCA TTC C |
Tabla 1: Secuencias de imprimación para el análisis qPCR en tiempo real.
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Discussion
Se presenta un método sencillo y robusto para aislar núcleos individuales y estudiar la heterogeneidad del tejido adiposo. En comparación con la secuenciación de ARN de tejido entero, este flujo de trabajo ofrece una visión imparcial de la heterogeneidad celular y marcadores específicos de la población. Esto es significativo e innovador para el avance de la biología adipocitos, el metabolismo molecular y la investigación de la obesidad.
Este protocolo está especialmente optimizado para la aplicación descendente de snRNA-seq. El paso de "limpieza" para lograr el aislamiento de núcleos saludables con el clasificador de alta velocidad MoFlo XDP elimina completamente los residuos y agregados de la suspensión bruta mientras se mantiene la integridad de la membrana nuclear. Por lo tanto, esto aumenta la eficiencia de captura en la formación de gotas y recupera miles de transcriptomas de un solo núcleo de una sola carrera sin pérdida del número de genes detectados. Además de las plataformas de una sola célula basadas en gotas, que proporcionan un mayor número de núcleos o células encuestados, las plataformas microplacas basadas en clasificador y Fluidigm C115 también se pueden utilizar para obtener una mayor resolución y cobertura del transcriptoma16. Debido a que este flujo de trabajo ofrece núcleos de alta calidad, los ensayos para la cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación (es decir, secuenciación ATAC) también se pueden realizar con modificaciones mínimas en el protocolo scATAC-seq existente17.
Una limitación de este protocolo es la pérdida de información por la eliminación de compartimentos nonucleares, como el citosol y la membrana celular. Por ejemplo, los análisis emergentes multimodales unicelulares18,19 que miden simultáneamente la expresión de proteína de membrana celular y el transcriptoma no se pueden aplicar a este protocolo.
El objetivo futuro es combinar este protocolo con la multiplexación de núcleos utilizando anticuerpos con códigos de barras20. Los núcleos ordenados de diferentes tejidos adiposos en diferentes condiciones experimentales se codificarán y agruparán utilizando un anticuerpo complejo de poro antinuclear y se realizará el arn ARN-seq. Al secuenciar estos códigos de barras junto con el transcriptoma nuclear, cada núcleo se puede asignar a su muestra original, se pueden identificar claramente los multipletos de muestra cruzada y los sistemas basados en gotas pueden ser "supercargados" para una reducción significativa del costo por núcleo.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a David Reynolds del núcleo de Genómica Albert Einstein y Jinghang Zhang del Núcleo de Citometría de Flujo por el soporte técnico. Reconocemos el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (DK110426) y las Subvenciones Piloto y de Viabilidad del Centro de Investigación de diabetes Einstein-Mount Sinai (DK020541) y del Centro de Investigación de La Obesidad de Nueva York (DK026687) (todos a K.S.). También nos gustaría agradecer a Albert Einstein Cancer Center (CA013330) por el apoyo básico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | PBS with EDTA; sterile-filtered |
| BSA | Sigma | A1595 | |
| CaCl2 | Sigma | 21115 | |
| Cell filter 100 μm | Corning | 431752 | |
| Cell filter 40μm | Corning | 431750 | |
| CellTrics (30 μm) | Sysmex | 04-004-2326 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Fisher | P217-3 | |
| MACS SmartStrainers (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | Stackable filters |
| MgCl2 | Sigma | M1028 | |
| MoFloXDP Cell Sorter | Beckman Coulter | ML99030 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Protector RNase Inhibitor | Roche | 3335402001 | |
| Sucrose | Fisher | S5-3 |
References
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