Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Methyleret RNA Immunoprecipitation Assay at studere m5C Modifikation i Arabidopsis

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/61231
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua, 3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Den methylerede RNA-immunoprecipitationsanalyse er en antistofbaseret metode, der bruges til at berige methylerede RNA-fragmenter. Kombineret med dyb sekventering fører det til identifikation af udskrifter, der bærer m5C-modifikationen.

Abstract

Sekundære basisændringer på RNA, såsom m5C, påvirker strukturen og funktionen af de modificerede RNA-molekyler. Methyleret RNA Immunoprecipitation og sekventering (MeRIP-seq) er en metode, der har til formål at berige for methyleret RNA og i sidste ende identificere modificerede udskrifter. Kort, sonikeret RNA er inkuberet med et antistof for 5-methylerede cytosiner og udfældet ved hjælp af protein G perler. De berigede fragmenter sekvenseres derefter, og de potentielle methyleringssteder kortlægges baseret på fordelingen af aflæsningerne og topdetektering. MeRIP kan anvendes på enhver organisme, da det ikke kræver nogen forudgående sekvens eller ændring af enzymviden. Derudover udsættes RNA ud over fragmentering ikke for nogen anden kemisk eller temperaturbehandling. MeRIP-seq giver dog ikke en enkelt-nukleotidforudsigelse af methyleringsstedet som andre metoder gør, selvom det methylerede område kan indsnævres til et par nukleotider. Brugen af forskellige modifikationsspecifikke antistoffer gør det muligt at justere MeRIP for de forskellige basisændringer, der findes på RNA, og udvider de mulige anvendelser af denne metode.

Introduction

I alle tre riger af livet gennemgår RNA-arter posttransskriptionelle modifikationer, og forskning i disse funktionelt relevante biokemiske modifikationer kaldes "epitranscriptomics". Epitranscriptomics er et voksende felt, og der udvikles forskellige metoder til at studere og kortlægge modifikationerne på RNA-molekyler (gennemgået i1,2). Der er fundet mere end hundrede RNA-ændringer, som er fundet i rRNA'er, tRNA'er, andre NCRNA'er samtmRNA'er 3,4. Selv om tilstedeværelsen og funktionen af kemisk forskelligartede post-transskriptionelle ændringer i tRNA'er og rRNA'er er grundigt undersøgt5,6,7,8, først for nylig er mRNA-modifikationer blevet karakteriseret. I planter er mange mRNA-modifikationer blevet identificeret til dato, herunder m7G ved hættestrukturen9, m1A10,hm 5C11,12og uridylation13. Men kun m6A10,14,15, m5C11,16,17, og pseudouridin18 er blevet kortlagt transcriptome-dækkende i Arabidopsis. Post-transcriptional mRNA base ændringer er involveret i flere udviklingsprocesser19,20.

En af de mest anvendte metoder i epitranscriptomics er den methylerede RNA immunoprecipitation kombineret med dyb sekventering (MeRIP-seq). MeRIP-seq blev udviklet i 2012 for at studere m6A i pattedyrceller21,22. Det kræver brug af et antistof til den ønskede ændring og har til formål at berige for RNA-fragmenter, der bærer det eller de modificerede nukleotid(er). Det efterfølges normalt af dyb sekventering for at identificere og kortlægge de berigede fragmenter eller kvantitative PCR for at verificere specifikke RNA-mål. Nøjagtigheden af MeRIP er baseret på antistoffets specificitet for at genkende det modificerede nukleotid over lignende modifikationer (f.eks. m5C oghm 5C11,23). Ud over m6A er MeRIP-seq også blevet anvendt til undersøgelse m1A og m5C RNA-methylering i flere organismer11,17,23,24,25.

Methylering af cytosin ved femte kulstofposition (m5C) er den mest udbredte DNA-modifikation26,27 og en af de mest almindelige RNA-modifikationer for3,4. Mens m5C blev opdaget i eukaryote mRNA'er i 197528, først for nylig har undersøgelser fokuseret på kortlægning af ændringen transcriptome-dækkende, i kodning og ikke-kodning RNA11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.

Alternative metoder, der anvendes i m5C RNA-forskning, omfatter kemisk omdannelse af ikke-methylerede cytosiner til uracils (bisulfitsekvensering) og immunoprecipitationsanalyser baseret på en irreversibel binding af en kendt RNA cytosinmethyletransferase til sine RNA-mål (miCLIP, aza-IP). Kort sagt udnytter bisulfitsekvensering funktionen af 5-methyleret cytosin til at være resistent over for natriumbisulfitbehandling, der deaminerer umodificerede cytosiner til uracil. Metoden blev først udviklet til DNA , men også tilpasset til RNA , og mange undersøgelser har valgt denne fremgangsmåde til påvisning af m5C-steder i RNA16,23,29,32,34,35. Både miCLIP og aza-IP kræver forudgående kendskab til RNA cytosinmethylentransferase og brug af det respektive antistof. I tilfælde af miCLIP (methylering individuelle-nukleotid-opløsning crosslinking og immunoprecipitation), methyltransferase bærer en enkelt aminosyre mutation, så det binder sig til RNA substrat, men kan ikke frigives30. I aza-IP (5-azacytidin-medieret RNA immunoprecipitation) dannes den irreversible binding mellem 5-azaC-nukleosiden og RNA cytosinmethylentransferase, når den eksogent leveres 5-azaC indarbejdes af RNA-polymeraser i et mål RNA-molekyle31.

Den største fordel ved disse tre metoder er, at de tillader enkelt nukleotidopløsningskortlægning af m5C. Derudover giver miCLIP og aza-IP oplysninger om de specifikke mål for en udvalgt RNA-cytosinmethyletransferase, hvilket dechifrerer mekanismen og rollen for RNA-ændringer efter transskription. MeRIP-seq-tilgangen kan imidlertid identificere transskriptions-dækkende m5C-regioner uden forudgående viden, der kræves, og undgår barske kemiske og temperaturforhold, såsom bisulfitbehandling eller inkubation med 5-azaC. Både MeRIP og bisulfitsekvensering kan hæmmes af sekundære RNA-strukturer36. Det fragmenteringstrin, der indgår i MeRIP-analysen forud for immunoprecipitation, har til formål at lette antistofbinding og øge opløsningen af m5C-identifikation.

En anden metode, der er værd at nævne, er massespektrometri (MS) af RNA-nukleotider. MS kan detektere og skelne mellem enhver form for modifikation både på DNA og på RNA. Kort, RNA udvindes og DNase fordøjet, derefter afsalteret og fordøjet til enkelt nukleosides. RNA-nukleosides analyseres af et massespektrometer. Denne metode kan bruges til at kvantificere niveauerne for hver ændring, og den er ikke afhængig af et antistof eller en kemisk omdannelse. En stor ulempe er imidlertid, at det giver masseinformation om tilstedeværelsen af RNA-modifikationer. For at kortlægge ændringerne skal MS kombineres med RNase fordøjelse og sekventeringsoplysninger om specifikke RNA-molekyler, som det er tilfældet med human tRNALeu(CAA)37.

Her beskriver og diskuterer vi MeRIP-analysen som brugt til at studere m5C RNA-methylering i Arabidopsis17.

Protocol

1. Forberedelse af RNA

  1. Grind 200 mg plantevæv til pulver i flydende nitrogen, og sørg for, at vævet forbliver frosset under hele proceduren.
  2. Ekstrakt RNA fra det ønskede plantevæv efter en syre guanidinium thiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion protokol. For at mindske muligheden for at forurene RNA med DNA under faseadskillelse skal du bruge 1-bromo-3-chloropropan i stedet for kloroform.
    1. Der tilsættes 1 ml RNA-ekstraktionsreagens indeholdende guanidin thiocyanat og syrephoenol til det malede plantevæv (500 μL pr. 100 mg væv). Bland godt ved at vende og sørg for, at alt væv er vådt. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur for at adskille ribonukleoproteinkomplekserne.
    2. Centrifuge i 10 minutter ved 12.000 x g ved 4 °C og overføre supernatanten til et nyt 1,5 mL rør.
    3. Der tilsættes 200 μL 1-bromo-3-chlorpropan (100 μL pr. 500 μL RNA-ekstraktionsreagens) og hvirvel kraftigt.
    4. Centrifuge i 15 minutter ved 12.000 x g ved 4 °C og overfører den øverste vandige fase (ca. 500 μL) til et nyt 1,5 mL rør.
    5. Der tilsættes 1 volumen isopropanol (500 μL) og 0,1 volumen på 3 M natriumacetat pH 5,5 (50 μL), blandes godt ved invertering og bundfald 10 min ved -20 °C.
      BEMÆRK: Det anbefales at anvende natriumacetat (NaOAc) for at øge RNA-nedbøren. Protokollen kan sættes på pause på dette tidspunkt ved at forlænge nedbøren af RNA i et par timer eller endda natten over.
    6. Centrifuge i 30 minutter ved 12.000 x g ved 4 °C og kassér supernatanten.
    7. Pelleten vaskes to gange med 500 μL på 80% EtOH, centrifuge i 5 min ved 12.000 x g ved 4 °C og kassér.
    8. Pelleten vaskes én gang med 500 μL 99% EtOH, centrifuge i 5 min ved 12.000 x g ved 4 °C og kassér.
    9. Pelletlen tørres i 5-10 minutter og opløses i 30 μL RNase-fri H2O.
      BEMÆRK: Brug i stedet en hvilken som helst RNA-udtrækningsprotokol efter eget valg (f.eks. et kolonnebaseret system). Hvis en DNase-fordøjelse er inkluderet i protokollen, skal du springe den over i følgende trin (trin 1.3).
  3. RNA-koncentrationen måles (f.eks. ved brug af et spektrofotometer) og 20 μg RNA fordøjes med DNase.
    BEMÆRK: DNA er rig på m5C, og antistoffet skelner ikke mellem DNA og RNA.
    1. I en typisk DNase-reaktion behandles 10 μg RNA med en 50 μL reaktion. Følgende komponenter blandes, og reaktionen/reaktionerne inkuberes ved 37 °C i 30 min.:
      10 μg RNA x μL
      10x DNase buffer 5 μL
      DNase 1 μL (2 enheder)
      RNase-fri H2O op til 50 μL
    2. Fjern enzymet enten ved at tilsætte et passende volumen DNase inaktiveringsreagens (hvis det er inkluderet i DNase-sættet og i henhold til producentens anvisninger) eller ved at udføre et oprydningstrin (f.eks. kolonnerensning eller phenol/chloroformekstraktion).
  4. Kontroller kvaliteten og renheden af det isolerede RNA ved kapillær elektroforese, og fortsæt, hvis RNA-integritetsnummeret (RIN) er højere end 7, for at sikre, at prøverne er af god kvalitet.
  5. VALGFRIT: Fjern det ribosomale RNA for at berige prøverne i mRNA-indhold ved hjælp af et rRNA-fjernelsessæt og i henhold til producentens protokol.
    1. Brug det eller de DNase-behandlede RNA fra det foregående trin til rRNA-udtømningsreaktionen eller -reaktionerne. Udfør flere reaktioner, hvis mængden af det samlede RNA er større end det maksimale beløb, der foreslås for reaktionen.
    2. Bemærk, at kun 5-10% af inputbeløbet vil blive inddrevet efter rRNA-udtømning. Fortsæt med rRNA udtømt RNA (lige stor mængde for alle prøver) og ignorer de beløb, der er nævnt i de følgende trin, da de henviser til det samlede RNA.
      BEMÆRK: For en sammenligning og beskrivelse af tilgængelige rRNA-udtømningsmetoder henvises til reference 38,39,40. rRNA er den største del af det samlede RNA og er m5C methyleret i mange organismer.
  6. Forbered dig på forhånd in vitro udskrifter (IVT), der skal bruges som kontrol RNA sekvenser og tilføje dem i prøverne.
    1. Producere to forskellige LED'er ved hjælp af en in vitro transskription kit, en med ikke-methylerede nukleotider og en, hvor rCTP erstattes af 5-methyl-rCTP, til at tjene som negative og positive kontrol i MeRIP, hhv. De udskrifter, der blev udarbejdet, var dem fra EGFP og Renilla luciferase.
      BEMÆRK: De erhvervsrettede data bør ikke eksistere i transskriptionen af den organisme, du analyserer. Hvis led'erne er fra den samme skabelon (f.eks. begge EGFP), skal du tilføje den positive og negative kontrol i to forskellige stikprøver. Hvis deres rækkefølge er anderledes (f.eks. EGFP og Renilla), kan de føjes til den samme prøve.
    2. Spike i hver prøve 0,1 ng IVT pr. 3 μg RNA som kontrol.
  7. Sonicate RNA til ca 100 nt fragmenter.
    BEMÆRK: Betingelserne for RNA-klipning skal justeres på forhånd, og de er forskellige for hver sonikator. For den model, der anvendes her, er sonikering udføres med følgende betingelser: Peak power 174, Duty faktor 10, Cykler / burst 200, 17 min.
    1. Den samme mængde RNA for alle prøver, mindst 12 μg RNA pr. prøve i 80 μL af det samlede volumen (min. 60 μL, maks. 100 μL), fyldt op med RNase-fri H2O.
  8. Bekræft effektiviteten af sonikering og koncentrationen af RNA-prøverne ved kapillær elektroforese. Den gennemsnitlige størrelse af fragmenteret RNA bør være omkring 100 nt.

2. Methyleret RNA-immunoprecipitation (MeRIP)

  1. I lavbindende rør tilsættes 9 μg sonikeret RNA og RNase-fri H2O op til 60 μL (eller mere, afhængigt af koncentrationen).
  2. Dissociere de sekundære strukturer ved at opvarme RNA ved 70 °C i et vandbad i 10 minutter og køle ned i yderligere 10 minutter i en isvandsblanding.
  3. Prøven opdeles i tre dele: En tredjedel (20 μL, hvis der er udtaget 60 μL i trin 2.1) i et separat rør ved -80 °C som inputprøve. Fyld de resterende 40 μL med RNase-fri H2O op til 860 μL og derefter opdelt i to lav-binding rør: en for IP og en for Mock kontrol (430 μL hver).
  4. Tilføj til begge rør:
    50 μL 10x MeRIP-buffer
    10 μL RNase-hæmmer
    10 μL α-m5C antistof (10 μg) i IP-prøven pr. 10 μL H2O i mockprøven
    BEMÆRK: Den tidligere anvendte antistofklon er ikke længere kommercielt tilgængelig. Ethvert anti-5-methylcytosin monoklonalt antistof bør dog virke på samme måde. Antistoffer skal testes for specificitet, før de anvendes til MeRIP11,23.
  5. Rørene forsegles med parafilm og inkuberes i 12-14 timer ved 4 °C med overheadrotation.
  6. Den næste dag, forberede protein G magnetiske perler til binding.
    1. For hvert rør (enten IP- eller Mock-kontrol) skal der anvendes 40 μL perler. Tilsæt den samlede mængde perler (# rør x 40 μL, f.eks. er der behov for 160 μL perler for 2 IP- og 2 Mock-prøver) i et 15 mL rør og vask tre gange med 800 μL 1x MeRIP-buffer pr. prøve (antal rør x 800 μL buffer, f.eks. 3,2 mL for 2 IP- og 2 Mock-prøver).
    2. Udfør vaske ved stuetemperatur i 5 minutter med overhead rotation, saml perlerne ved hjælp af et magnetisk rack og kassér vaskebufferen. Efter den tredje vask opsuspendes perlerne i samme volumen som 1x MeRIP-buffer som det oprindelige volumen af trufne perler (# rør x 40 μL, f.eks. 160 μL 1x MeRIP-buffer for 2 IP- og 2 Mock-prøver).
      BEMÆRK: Mængden af anvendte protein G-perler bestemmes af perlernes bindeevne for den specifikke antistoftype og mængden af anvendte antistoffer. I dette tilfælde har perlerne en bindende kapacitet på ca. 8 μg mus IgG pr. mg perler og 30 mg/mL koncentration. Derfor er 40 μL nok til at binde ca. 9,6 μg antistof.
  7. Der tilsættes 40 μL genbrugte perler til hver IP- og mockprøve, og der inkuberes i yderligere 2 timer ved 4 °C med overheadrotation.
  8. Placer rørene på et magnetisk stativ i 1 minut, og kassér supernatanten, eller gem den som en kontrol (ikke-bundet RNA-prøve).
  9. Perlerne vaskes 5 gange ved genbrug i 700 μL af 1x MeRIP-buffer, der leveres med 0,01% Tween 20 og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur med overheadrotation.
  10. De vaskede perler opbruges i 200 μL Proteinase K fordøjelsesbuffer, og der tilsættes 3,5 μL Proteinase K. Inkuberes i 3 timer ved 50 °C, ryster ved 800 omdrejninger ved 800 omdrejninger i minuttet. Af og til svirpes bunden af røret manuelt, hvis der dannes et sediment af perler under inkubationen.
  11. EKSTRAKT RNA ved tilsætning af 800 μL RNA-ekstraktion reagens og efter en syre guanidinium thiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion protokol, og fortsæt som i trin 1.2. For at øge synligheden af RNA pellet, en farvet co-precipitant kan tilsættes i isopropanol på nedbør trin. Pelletpen blev genbrugt i 20 μL RNase-fri H2O (eller lig med inputvolumen, der opbevares i trin 2.3).

3. Downstream-analyse

  1. Indsend input- og IP-prøverne for enkelt endesekvensering med 50 basers læselængde (SE50).
  2. Trim 3' endeadaptere ved hjælp af cutadapt41 og kassér aflæsninger, der er kortere end 48 nt.
  3. Kort trimmet læser til Arabidopsis genom (TAIR10 anmærkning) ved hjælp af STAR42 med en cutoff på 6% for uoverensstemmelser og maksimal intron størrelse på 10 kb. Hold entydigt kortlagt læser for yderligere analyse.
  4. Identificer berigede RNA-fragmenter i IP-prøver sammenlignet med Input ved hjælp af to forskellige metoder, og overvej dem, der findes betydeligt beriget af begge.
    1. Først skal du registrere MeRIP-seq toppe ved hjælp af MACS2 peak caller43 på puljede IPs versus input.
    2. For det andet skal du følge analysen for MeRIP-seq peak calling som beskrevet i Meyer et al.22 og Yang et al.17.
      1. Brug brugerdefinerede R-scripts til at opdele genomet i forskellige 25 nt-vinduer, og tæl antallet af entydigt tilknyttede læsninger for hvert vindue baseret på placeringen af det sidst tilknyttede nukleotid (da læsningerne stammer fra 100 nt RNA-fragmenter).
      2. Beregn væsentligt berigede vinduer i IP-prøver sammenlignet med Input med Fisher Exact Test. Brug Benjamini-Hochberg-proceduren til at korrigere for flere test.
      3. Hold de væsentligt berigede toppe, der spænder over mindst to på hinanden følgende vinduer, og kassér toppe, der kun dækker et vindue.
  5. Identificer kommenterede områder af genomet (udskrifter) med betydeligt berigede toppe fundet ved begge metoder.
  6. Alternativt eller supplerende testes specifikke RNA-mål for deres berigelse i IP-prøverne.
    1. Omvendt transskribere RNA (samme volumen af input, IP og Mock prøver) med tilfældige hexamers.
    2. Udfør kvantitativ pcr i realtid på de valgte mål, og komparer input, IP og mock via ΔΔCt-metoden.
      BEMÆRK: Det genererede produkt bør ikke være længere end 100 bp, da dette er den gennemsnitlige fragmenteringsstørrelse.

Representative Results

Der findes et skema over metoden i figur 1. De første kritiske trin i protokollen er at opnå RNA af god kvalitet (RIN ≥ 7) og sonikere det til ca. 100 nt fragmenter. Effektiviteten af begge trin undersøges af en spånbaseret kapillærelektroforesemaskine. I figur 2Avises en repræsentativ kørsel af en god RNA-prøve. Prøven fortyndes 1:10 før pålæsning på chippen for at få en koncentration, der ligger inden for det anvendte sæts påvisningsområde (5-500 ng/μL). Den samme prøve køres også efter sonikering og er vist i figur 2B. Bemærk tilstedeværelsen af en ensartet top flyttet til venstre for diagrammet, i en størrelse på omkring 100 nukleotider. Den lavere koncentration skyldes både tab af RNA under fragmentering, men også på grund af prøvernes øgede volumen (60-100 μL, trin 1.7.1).

Kvaliteten af IP- og Mock-prøverne kan evalueres af qRT-PCR. Med henblik herpå tjener de indskrænkede led som positive og negative kontroller: den methylerede IVT, hvor der i alle cytosinstillinger er m5C, forventes at blive stærkt beriget i IP-prøven; Tværtimod bør den ikke-methylerede ivt ikke have en forskel mellem IP og Mock. De primere , der anvendes i qRT-PCR-analysen for de to kontrol-LED'er(EGFP og Renilla luciferase), er anført i tabel 1. Som det fremgår af figur 3, blev ca. 80 % af den methylerede ivt genvundet i IP-prøven og kun ca. 2 % i mock. For den ikke-methylerede kontrol var gendannelsen under 1% i både IP- og Mock-prøver. Dette kontrollerer merip's effektivitet, at methylerede RNA-fragmenter blev udfældet og beriget, og er en god indikator for, at prøverne kan anvendes til downstream-analyse. Desuden kan foldberigelsen af den ikke-methylerede IVT (IP til Mock ratio) anvendes som en tærskel for at vurdere betydningen af tilsætning i qRT-PCR-assays.

Efter justering af aflæsningerne til genomet (Figur 4) anvendes de maksimale kaldealgoritmer, der er beskrevet i trin 3.4.1 og 3.4.2, til at identificere de statistisk signifikante vinduer, beriget i IP-prøverne sammenlignet med inputtet. De sekvenser, der svarer til disse vinduer, kan bruges yderligere, for eksempel til at søge efter bevarede methyleringsrelaterede motiver11,17.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation af MeRIP-seq-protokollen.
RNA-prøver inkuberes med et antistof til 5-methylerede cytosiner, og komplekserne trækkes ned med protein G magnetiske perler, der fanger antistofferne sammen med det bundne RNA. De velfortviste RNA-prøver analyseres ved dyb sekventering og qRT-PCR. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative resultater af kvalitetsanalyse af RNA-prøver.
(A) Repræsentativ profil af en kvalificeret samlet RNA-anlægsprøve. (B) Repræsentativ profil af en RNA-prøve efter sonikering til 100 nt fragmenter. Output filer fra kapillær elektroforese software. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: qRT-PCR-analyse af kontrol-IVT'er.
Methylerede og ikke-methylerede in vitro-udskrifter blev anvendt som henholdsvis positiv og negativ kontrol af MeRIP-analysen. Efter immunoprecipitation er den methylerede IVT stærkt beriget i IP-prøven (grøn), men ikke i mockprøven (uden anti-m5C antistof; lilla). Den ikke-methylerede ivt viste ingen berigelse og ingen forskel mellem IP og Mock. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Læs justering før og efter MeRIP omkring en repræsentativ udskrift.
Læser justeret efter en bestemt udskrift i inputeksemplet (øverste række) og i to IP-replikeringer (midterste og nederste række). Den sorte boks viser et identificeret beriget 50 nt langt vindue baseret på MACS243 og MeRIP-seq22 peak-calling analyser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Mål Primer par Produktsekvens Produktlængde
Egfp For: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3' GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG
GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG
GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC		 72 bp
Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'
Renilla luciferase For: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3' GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC
ATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAA
AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC		 75 bp
Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'

Tabel 1: Oplysninger om primere og genererede produkter til qRT-PCR-analysen.

Buffer opskrifter. Klik her for at hente denne fil.

Discussion

RNA bærer mere end hundrede forskellige base ændringer4, der danner epitranscriptome44. Disse ændringer tilføjer et ekstra lag af regulering af oversættelse og signalering (gennemgået i5,6,8,20,45,46). Tidlige undersøgelser var i stand til at opdage tilstedeværelsen af post-transskriptionelle ændringer på RNA28,47, men de specifikke modificerede RNA'er skal identificeres for at forstå epitranscriptomics rolle. MeRIP blev designet som en metode til at kortlægge RNA-methyleringssteder transcriptome-dækkende21,22. Det kan tilpasses enhver ændring, hvis et specifikt antistof er tilgængeligt.

Hovedstyrken i denne protokol er, at den er relativt enkel, sikker for RNA og brugeren (f.eks. er 5-azaC meget giftig for planter og mennesker) og kræver ikke sekvens- eller ændring af enzymoplysninger. Desuden øger tilsætningen af methylerede RNA'er i undersøgelsesperioden chancerne for, at der opdages lave rigelige mRNA'er, i modsætning til bisulfitsekvensering, der ikke indeholder et berigelsestrin. Når der udføres to serielle runder af MeRIP, øges berigelsen i RNA-fragmenter, der indeholder methyleringssteder, yderligere22. En af begrænsningerne ved MeRIP, især når det anvendes til mRNA-methyleringsundersøgelser, er den høje mængde RNA, der kræves som input til analysen. Ribodepletionen – eller poly(A) berigelse – trinnet vil reducere baggrunden forårsaget af det stærkt modificerede ribosomale RNA, men det fjerner mere end 90% af det samlede RNA. DNA skal også fjernes fuldstændigt, da det er rigt på 5-methylerede cytosiner. En anden ulempe er den lavere opløsning af den nøjagtige position af methylering. Sonikering af RNA før inkubation med antistoffet hjælper i denne retning ved at indsnævre den region, der indeholder modifikationen til 100-200 nukleotider. Når MeRIP er kombineret med dyb sekventering, opløsningen af m5C site forudsigelse stiger som sekventering læser danne en gaussisk fordeling omkring den potentielle methylering site. Derudover skal antistoffets specificitet bekræftes inden analysen (f.eks. med RNA dot blot assays, udført med oligoer syntetiseret med modificerede nukleotider), men i hvilket omfang et antistof faktisk kan skelne mellem nært beslægtede ændringer (f.eks. m6A og m6am) er et argument på felt48,49. Desuden kan meget strukturerede RNA'er forstyrre antistof-antigeninteraktionen, en anden begrænsning, der for det meste behandles med fragmentering og denaturering af RNA før IP. Tværtimod, bisulfit sekventering, der også er påvirket af sekundære strukturer, omfatter ikke en fragmentering skridt, og dette kan være en af grundene til, at forårsager uoverensstemmelse mellem m5C steder og mRNA forudsagt af bisulfit sekventering16 og MeRIP-sekt11,17. Andre cytosinændringer (f.eks. hm5C) er også resistente over for bisulfitmedieret deamination35.

Ændringer af MeRIP-seq omfatter et krydslinking-trin, enten med indførelsen af en fotoaktiverbar ribonucleoside (foto-crosslinking-assisteret m6A-seq, PA-m6A-seq 50) eller ved hjælp af UV-lys til at skabe antistof-RNA crosslinks efter IP (miCLIP49, anden metode end miCLIP beskrevet iindledningen 30, men også med individuel nukleotidopløsning). I fremtiden, og efterhånden som der akkumuleres viden om RNA-methylering, kan mere målrettede tilgange være at foretrække, baseret på de modificerende enzymer og/eller konsensussekvenserne, hvor methylering forekommer. Identifikation af læserproteiner er afgørende for forståelsen af den molekylære og signalfunktion af posttransskriptionelle modifikationer. Nanopore sekventeringsteknologi gør det allerede muligt direkte at identificere modificerede nukleotider uden forudgående behandling af RNA17, men der er stadig plads til forbedringer på dette område med hensyn til sekvensdybde og bioinformatatisk analyse. Samlet set er MeRIP-seq i øjeblikket en etableret, pålidelig og upartisk tilgang til at identificere methylerede RNA-udskrifter.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af et IMPRS PhD-stipendium til E.S, et EMBO Long-Term Fellowship to V.P., og MPI-MPP interne midler til F.K. En del af dette arbejde blev også finansieret gennem PLAMORF, et projekt, der har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram (Tilskudsaftale nr. 810131). Forfatterne vil gerne takke Federico Apelt for den bioinformatiske analyse og kommentarer til manuskriptet, og Mathieu Bahin og Amira Kramdi for den bioinformatiske analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microcentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trixl, L., Lusser, A. The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).
  2. Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. Detection and analysis of RNA methylation. F1000Research. 8, 559 (2019).
  3. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, SUPPL 1 195-201 (2011).
  4. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).
  5. Agris, P. F. Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications. EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).
  6. Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).
  7. Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability. RNA. 20 (10), New York, N.Y. 1632-1644 (2014).
  8. Motorin, Y., Helm, M. tRNA Stabilization by Modified Nucleotides. Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).
  9. Shatkin, A. Capping of eucaryotic mRNAs. Cell. 9 (4), 645-653 (1976).
  10. Shen, L., et al. N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).
  11. Cui, X., et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana. Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).
  12. Huber, S. M., et al. Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).
  13. Zuber, H., et al. Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis. Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).
  14. Luo, G. Z., et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nature Communications. 5 (1), 5630 (2014).
  15. Wan, Y., et al. Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana. Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).
  16. David, R., et al. Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs. The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).
  17. Yang, L., et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants. Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).
  18. Sun, L., et al. Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089 (2019).
  19. Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. In search of the mRNA modification landscape in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 421 (2019).
  20. Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants. Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).
  21. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  22. Meyer, K. D., et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and near Stop Codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  23. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS genetics. 9 (6), 1003602 (2013).
  24. Dominissini, D., et al. The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  25. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  26. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).
  27. Wyatt, G. R. Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids. Nature. 166, 237-238 (1950).
  28. Dubin, D. T., Taylor, R. H. The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells. Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).
  29. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).
  30. Hussain, S., et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs. Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).
  31. Khoddami, V., Cairns, B. R. Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases. Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).
  32. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  33. Yang, X., et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).
  34. Burgess, A., David, R., Searle, I. R. Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae. BMC Plant Biology. 15 (1), 199 (2015).
  35. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).
  36. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).
  37. Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific. RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).
  38. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  39. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7 (1), 41114 (2017).
  40. Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics. Nucleic Acids Research. 48 (4), 20 (2020).
  41. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  42. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  43. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  44. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  45. Schwartz, S. Cracking the epitranscriptome. RNA. 22 (2), 169-174 (2016).
  46. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).
  47. Keith, G. Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography. Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).
  48. Feederle, R., Schepers, A. Antibodies specific for nucleic acid modifications. RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).
  49. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  50. Chen, K., et al. High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).

Tags

Genetik Problem 159 RNA-methylering 5-methylcytosin (m5C) immunoprecipitation (IP) Arabidopsis epitranscriptomics mRNA RNA-sekventering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis
Posted by JoVE Editors on 05/19/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. The author list was updated.

The author list was updated from:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua

to:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Methyleret RNA Immunoprecipitation Assay at studere m<sup>5</sup>C Modifikation i Arabidopsis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot,… More

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter