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Genetics

Methylierte RNA-Immunpräzipitierung Assay zur Studie m5C Modifikation bei Arabidopsis

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/61231
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua, 3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Der methylierte RNA-Immunpräzipitationstest ist eine Antikörper-basierte Methode zur Anreicherung für methylierte RNA-Fragmente. Gekoppelt mit einer tiefen Sequenzierung führt dies zur Identifizierung von Transkripten, die die m5C-Modifikation tragen.

Abstract

Sekundäre Basismodifikationen an der RNA, wie z.B. m5C, beeinflussen die Struktur und Funktion der modifizierten RNA-Moleküle. Methylierte RNA-Immunpräzipierung und -sequenzierung (MeRIP-seq) ist eine Methode, die darauf abzielt, methylierte RNA anzureichern und schließlich modifizierte Transkripte zu identifizieren. Kurz gesagt, wird beschallte RNA mit einem Antikörper für 5-methylierte Zytosine inkubiert und mit Hilfe von Protein-G-Perlen gefällt. Die angereicherten Fragmente werden dann sequenziert und die potenziellen Methylierungsstellen basierend auf der Verteilung der Lese- und Peak-Erkennung abgebildet. MeRIP kann auf jeden Organismus angewendet werden, da es keine vorherige Sequenz oder Modifizieren von Enzymkenntnissen erfordert. Darüber hinaus wird DIE RNA neben der Fragmentierung keiner anderen chemischen oder Temperaturbehandlung unterzogen. MeRIP-seq liefert jedoch keine Einzelnukleotidvorhersage der Methylierungsstelle wie andere Methoden, obwohl der methylierte Bereich auf wenige Nukleotide eingeengt werden kann. Die Verwendung verschiedener modifikationsspezifischer Antikörper ermöglicht es, MeRIP an die verschiedenen Basismodifikationen auf RNA anzupassen, wodurch die möglichen Anwendungen dieser Methode erweitert werden.

Introduction

In allen drei Lebensreichen werden RNA-Arten post-transkriptionellen Modifikationen unterzogen, und die Forschung an diesen funktional relevanten biochemischen Modifikationen wird als "Epitranskriptomik" bezeichnet. Epitranskriptomik ist ein wachsendes Feld und verschiedene Methoden werden entwickelt, um die Modifikationen an RNA-Molekülen zu untersuchen und zu kartieren (rezensiert in1,2). Es wurden mehr als hundert RNA-Modifikationen gefunden, die in rRNAs, tRNAs, anderen ncRNAs sowie mRNAs3,4nachgewiesen wurden. Obwohl das Vorhandensein und die Funktion chemisch unterschiedlicher posttranskriptionärer Modifikationen in tRNAs und rRNAs ausgiebig untersucht werden5,6,7,8, erst vor kurzem wurden mRNA-Modifikationen charakterisiert. In Pflanzen wurden bisher viele mRNA-Modifikationen identifiziert, darunter m7G an der Kappenstruktur9, m1A10, hm5C11,12und Uridylierung13. Allerdings wurden nur m6A10,14,15, m5C11,16,17und Pseudouridin18 transkriptomweit in Arabidopsis kartiert. Post-transkriptionsbasierte mRNA-Basismodifikationen sind an mehreren Entwicklungsprozessen beteiligt19,20.

Einer der am häufigsten verwendeten Ansätze in der Epitranskriptomik ist die methylierte RNA-Immunpräzipitation gekoppelt mit tiefer Sequenzierung (MeRIP-seq). MeRIP-seq wurde 2012 entwickelt, um m6A in Säugetierzellen21,22zu untersuchen. Es erfordert die Verwendung eines Antikörpers für die gewünschte Modifikation und zielt darauf ab, für RNA-Fragmente mit dem modifizierten Nukleotid(n) anzureichern. Es folgt in der Regel eine tiefe Sequenzierung, um die angereicherten Fragmente oder quantitative PCR zu identifizieren und zu zuordnen, um bestimmte RNA-Ziele zu überprüfen. Die Genauigkeit von MeRIP basiert auf der Spezifität des Antikörpers, um das modifizierte Nukleotid bei ähnlichen Modifikationen zu erkennen (z. B. m5C und hm5C11,23). Neben m6A wurde MeRIP-seq auch zur Untersuchung m1A und m5C RNA-Methylierung in mehreren Organismen11,17,23,24,25angewendet.

Die Methylierung des Cytosins an der fünften Kohlenstoffposition (m5C) ist die am weitesten verbreitete DNA-Modifikation26,27 und eine der häufigsten RNA-Modifikationen auch3,4. Während m5C in eukaryotischen mRNAs im Jahr 197528nachgewiesen wurde, haben erst vor kurzem Studien auf die Kartierung der Modifikation Transkriptome-weit konzentriert, in der Codierung und nicht-Codierung RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.

Alternative Methoden, die in der m5C-RNA-Forschung verwendet werden, umfassen die chemische Umwandlung von nicht-methylierten Zytosinen in Uracils (Bisulfitsequenzierung) und Immunpräzipitationstests, die auf einer irreversiblen Bindung einer bekannten RNA-Cytosin-Methyltransferase an ihre RNA-Targets basieren (miCLIP, aza-IP). Kurz gesagt, bisulfitsequenzierung nutzt das Merkmal von 5-methyliertem Cytosin, um gegen Natriumbisulfitbehandlung resistent zu sein, die unmodifizierte Cytosine zu Uracil deaminiert. Die Methode wurde zuerst für DNA entwickelt, aber auch für RNA angepasst und viele Studien haben diesen Ansatz gewählt, um m5C-Sites in RNA16,23,29,32,34,35zu detektieren. Sowohl miCLIP als auch aza-IP erfordern Vorkenntnisse der RNA-Cytosin-Methyltransferase und die Verwendung des jeweiligen Antikörpers. Bei miCLIP (Methylierung Individuell-Nukleotid-Auflösung Vernetzung und Immunpräzipitation) trägt die Methyltransferase eine einzige Aminosäuremutation, so dass sie an das RNA-Substrat bindet, aber nicht freigegeben werden kann30. Bei Aza-IP (5-Azacytidin-vermittelte RNA-Immunpräzipitation) wird die irreversible Bindung zwischen dem 5-AzaC-Nukleosid und der RNA-Cytosinmethyltransferase gebildet, wenn exogen bereitgestelltes 5-AzaC durch RNA-Polymerasen in ein Ziel-RNA-Molekül31eingearbeitet wird.

Der Hauptvorteil dieser drei Methoden besteht darin, dass sie eine einzige Nukleotidauflösungszuordnung von m5C ermöglichen. Darüber hinaus liefern miCLIP und aza-IP Informationen über die spezifischen Ziele einer ausgewählten RNA-Cytosin-Methyltransferase und entschlüsseln den Mechanismus und die Rolle posttranskriptionaler RNA-Modifikationen tiefer. Der MeRIP-seq-Ansatz kann jedoch Transkriptom-weite m5C-Regionen ohne vorherige Kenntnisse identifizieren und vermeidet raue chemische und Temperaturbedingungen wie Bisulfitbehandlung oder Inkubation mit 5-azaC. Sowohl die MeRIP- als auch die Bisulfitsequenzierung können durch sekundäre RNA-Strukturen gehemmt werden36. Der Fragmentierungsschritt, der im MeRIP-Test vor der Immunpräzipitation enthalten ist, zielt darauf ab, die Antikörperbindung zu erleichtern und die Auflösung der m5C-Identifikation zu erhöhen.

Eine weitere erwähnenswerte Methode ist die Massenspektrometrie (MS) von RNA-Nukleosiden. MS kann jede Art von Modifikation sowohl auf DNA als auch auf RNA erkennen und unterscheiden. Kurz gesagt, RNA wird extrahiert und DNase verdaut, dann entsalzt und zu einzelnen Nukleosiden verdaut. Die RNA-Nukleoside werden mit einem Massenspektrometer analysiert. Diese Methode kann verwendet werden, um die Ebenen jeder Modifikation zu quantifizieren und es ist nicht auf einen Antikörper oder eine chemische Umwandlung angewiesen. Jedoch, ein großer Nachteil ist, dass es Masseninformationen über das Vorhandensein von RNA-Modifikationen bietet. Um die Modifikationen abzubilden, muss MS mit RNase-Verdauungs- und Sequenzierungsinformationen über bestimmte RNA-Moleküle kombiniert werden, wie im Fall von humanen tRNALeu(CAA)37.

Hier beschreiben und diskutieren wir den MeRIP-Assay, der zur Untersuchung der m5C-RNA-Methylierung in Arabidopsis17verwendet wird.

Protocol

1. Vorbereitung der RNA

  1. Schleifen Sie 200 mg Pflanzengewebe zu Pulver in flüssigem Stickstoff, um sicherzustellen, dass das Gewebe während des gesamten Verfahrens eingefroren bleibt.
  2. Extrahieren Sie die RNA aus dem gewünschten Pflanzengewebe nach einem sauren Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsprotokoll. Um die Möglichkeit zu verringern, RNA während der Phasentrennung mit DNA zu kontaminieren, verwenden Sie 1-Brom-3-Chlorpropan anstelle von Chloroform.
    1. Fügen Sie dem gemahlenen Pflanzengewebe 1 ml RNA-Extraktionsreagenz, das Guanidinthiocyanat und Saursäurephenol enthält, hinzu (500 l pro 100 mg Gewebe). Mischen Sie gut, indem Sie umkehren und stellen Sie sicher, dass das gesamte Gewebe nass ist. 10 min bei Raumtemperatur inkubieren, um die Ribonukleoproteinkomplexe zu dissoziieren.
    2. Zentrifuge für 10 min bei 12.000 x g bei 4 °C und überträgt den Überstand auf ein neues 1,5 ml Rohr.
    3. Fügen Sie 200 l 1-Brom-3-Chlorpropan (100 l pro 500 l RNA-Extraktionsreagenz) und Wirbel kräftig hinzu.
    4. Zentrifuge für 15 min bei 12.000 x g bei 4 °C und überträgt die obere wässrige Phase (ca. 500 l) auf ein neues 1,5 ml-Rohr.
    5. 1 Volumen Isopropanol (500 l) und 0,1 Volumen von 3 M Natriumacetat pH 5,5 (50 l) hinzufügen, gut durch Invertieren mischen und 10 min bei -20 °C ausfallen.
      HINWEIS: Die Verwendung von Natriumacetat (NaOAc) wird empfohlen, um die RNA-Ausfällung zu verbessern. Das Protokoll kann an dieser Stelle angehalten werden, indem der Niederschlag der RNA um einige Stunden oder sogar über Nacht verlängert wird.
    6. Zentrifugieren Sie 30 min bei 12.000 x g bei 4 °C und entsorgen Sie den Überstand.
    7. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 500 l 80% EtOH, Zentrifuge für 5 min bei 12.000 x g bei 4 °C und entsorgen.
    8. Waschen Sie das Pellet einmal mit 500 l 99% EtOH, Zentrifuge für 5 min bei 12.000 x g bei 4 °C und entsorgen.
    9. Das Pellet 5-10 min trocknen und in 30 l RNase-freiH2O auflösen.
      HINWEIS: Verwenden Sie stattdessen ein beliebiges RNA-Extraktionsprotokoll (z. B. ein säulenbasiertes System). Wenn eine DNase-Verdauung im Protokoll enthalten ist, überspringen Sie sie im folgenden Schritt (Schritt 1.3).
  3. Messen Sie die RNA-Konzentration (z.B. mit Einem Spektralphotometer) und verdauen Sie 20 g RNA mit DNase.
    HINWEIS: DNA ist reich an m5C und der Antikörper unterscheidet nicht zwischen DNA und RNA.
    1. In einer typischen DNase-Reaktion behandeln Sie 10 g RNA in einer 50-L-Reaktion. Mischen Sie die folgenden Komponenten und inkubieren Sie die Reaktion(en) bei 37 °C für 30 min:
      10 g RNA x L
      10x DNase-Puffer 5 l
      DNase 1 l (2 Stück)
      RNase-frei H2O bis 50 l
    2. Entfernen Sie das Enzym entweder durch Zugabe eines geeigneten Volumens von DNase-Inaktivierungsreagenz (wenn es im DNase-Kit enthalten ist und gemäß den Anweisungen des Herstellers) oder durch durchführung einer Bereinigungsstufe (z. B. Spaltenreinigung oder Phenol-/Chlorformextraktion).
  4. Überprüfen Sie die Qualität und Reinheit der isolierten RNA durch kapillare Elektrophorese und fahren Sie fort, wenn die RNA-Integritätsnummer (RIN) höher als 7 ist, um sicherzustellen, dass die Proben von guter Qualität sind.
  5. OPTIONAL: Entfernen Sie die ribosomale RNA, um die Proben im mRNA-Gehalt mit einem rRNA-Entfernungskit und gemäß dem Herstellerprotokoll anzureichern.
    1. Verwenden Sie die von DNase behandelte RNA aus dem vorherigen Schritt für die rRNA-Erschöpfungsreaktion(n). Führen Sie mehrere Reaktionen durch, wenn die Menge der gesamten RNA mehr als die maximale Menge ist, die für die Reaktion vorgeschlagen wird.
    2. Beachten Sie, dass nur 5-10% des Eingangsbetrags nach rRNA-Erschöpfung wiederhergestellt werden. Fahren Sie mit der rRNA-entreicherten RNA (gleiche Menge für alle Proben) fort und ignorieren Sie die in den folgenden Schritten genannten Mengen, da sie sich auf die gesamte RNA beziehen.
      HINWEIS: Für einen Vergleich und eine Beschreibung der verfügbaren rRNA-Erschöpfungsmethoden siehe Referenzen 38,39,40. rRNA ist der Hauptteil der gesamten RNA und wird in vielen Organismen m5C methyliert.
  6. Bereiten Sie im Voraus In-vitro-Transkripte (IVT) zur Verwendung als Kontroll-RNA-Sequenzen vor und fügen Sie sie in die Proben ein.
    1. Produzieren Sie zwei verschiedene IVTs mit einem In-vitro-Transkriptionskit, eines mit nicht-methylierten Nukleosiden und eines, bei dem rCTP durch 5-Methyl-rCTP ersetzt wird, um als negative bzw. positive Kontrollen in MeRIP zu dienen. Die Transkripte wurden von EGFP und Renilla luciferase erstellt.
      HINWEIS: Die IVTs sollten nicht in dem Transkriptom des Organismus existieren, den Sie analysieren. Wenn die IVTs aus der gleichen Vorlage stammen (z. B. beide EGFP), fügen Sie die positive und die negative Kontrolle in zwei verschiedenen Stichproben hinzu. Wenn ihre Reihenfolge unterschiedlich ist (z. B. EGFP und Renilla), können sie derselben Probe hinzugefügt werden.
    2. Spike in jeder Probe 0,1 ng IVT pro 3 g RNA, als Kontrollen.
  7. Sonicate die RNA auf ca. 100 nt Fragmente.
    HINWEIS: Die Bedingungen für das RNA-Scheren müssen im Voraus angepasst werden und unterscheiden sich für jeden Beschallungser. Für das hier verwendete Modell wird die Beschallung unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Spitzenleistung 174, Duty-Faktor 10, Zyklen/Burst 200, 17 min.
    1. Beschallen Sie die gleiche RNA-Menge für alle Proben, mindestens 12 g RNA pro Probe in 80 l Gesamtvolumen (min 60 l, max. 100 l), gefüllt mit RNase-freier H2O.
  8. Bestätigen Sie die Effizienz der Beschallung und die Konzentration der RNA-Proben durch Kapillarelektrophorese. Die durchschnittliche Größe der fragmentierten RNA sollte etwa 100 nt betragen.

2. Methylierte RNA-Immunpräzipitation (MeRIP)

  1. In bindungsarmen Röhrchen fügen Sie je nach Konzentration 9 g beschallte RNA und RNase-freieH2O bis zu 60 l (oder mehr) hinzu.
  2. Dissoziieren Sie die Sekundärstrukturen, indem Sie die RNA bei 70 °C in einem Wasserbad für 10 min erwärmen und für weitere 10 min in einem Eis-Wasser-Mix abkühlen.
  3. Teilen Sie die Probe in drei Teile auf: Ein Drittel (20 l, wenn in Schritt 2.1 60 l genommen wurden) wird in einem separaten Rohr bei -80 °C als Eingangsprobe gespeichert. Füllen Sie die restlichen 40 l mit RNase-frei H2O bis zu 860 l und teilen Sie sie dann in zwei niedrigbindende Rohre: eine für IP und eine für die Mock-Steuerung (jeweils 430 l).
  4. Zu beiden Röhren hinzufügen:
    50 l mit 10x MeRIP-Puffer
    10 L RNase-Inhibitor
    10 l α-m-5-C-Antikörper (10 g) in der IP-Probe pro 10 lH2O in der Mock-Probe
    HINWEIS: Der zuvor verwendete Antikörperklon ist nicht mehr kommerziell erhältlich. Jedoch, Jeder Anti-5-Methylcytosin monoklonalen Antikörper sollte ähnlich arbeiten. Antikörper sollten vor der Verwendung für MeRIP11,23auf Spezifität getestet werden.
  5. Versiegeln Sie die Rohre mit Parafilm und inkubieren Sie 12-14 Stunden bei 4 °C, mit Oberleitungsrotation.
  6. Am nächsten Tag bereiten Sie das Protein G magnetische Perlen für die Bindung.
    1. Verwenden Sie für jedes Rohr (entweder IP- oder Mock-Steuerung) 40 L Perlen. Addieren Sie die Gesamtmenge der Perlen (z. B. 15 ml In einem 15 ml-Rohr) und waschen Sie sie dreimal mit 800 l 1x 1x MeRIP-Puffer pro Probe (z. B. Tuben x 800 L Puffer, z. B. 3,2 ml für 2 IP- und 2 Mock-Proben).
    2. Waschen bei Raumtemperatur für 5 min mit Overhead-Rotation durchführen, die Perlen mit Hilfe eines magnetischen Racks sammeln und den Waschpuffer entsorgen. Nach der dritten Wäsche die Perlen im gleichen Volumen des 1x MeRIP-Puffers wie das Anfangsvolumen der entnommenen Perlen (z. B. 160 l 1x MeRIP-Puffer für 2 IP- und 2 Mock-Proben) wieder aufsetzen.
      HINWEIS: Die Menge der verwendeten Protein-G-Perlen wird durch die Bindungskapazität der Perlen für den spezifischen Antikörpertyp und die Menge der verwendeten Antikörper bestimmt. In diesem Fall haben die Perlen eine Bindungskapazität von ca. 8 g Maus-IgG pro mg Perlen und 30 mg/ml Konzentration. Daher reichen 40 l aus, um ca. 9,6 g Antikörper zu binden.
  7. Fügen Sie jeder IP- und Mock-Probe 40 L resuspendierte Perlen hinzu und brüten sie für weitere 2 Stunden bei 4 °C mit Overhead-Rotation.
  8. Legen Sie die Rohre 1 min auf ein magnetisches Rack und entsorgen Sie den Überstand oder speichern Sie ihn als Kontrolle (nicht gebundene RNA-Probe).
  9. Waschen Sie die Perlen 5 Mal, indem Sie in 700 l 1x MeRIP-Puffer mit 0,01% Tween 20 und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur mit Overhead-Rotation wieder aufhängen.
  10. Die gewaschenen Perlen in 200 l Proteinase-K-Verdauungspuffer wieder aufhängen und 3,5 l Proteinase K hinzufügen. 3 Stunden bei 50 °C inkubieren und bei 800 Umdrehungen pro Minute schütteln. Gelegentlich streichen Sie manuell den Boden des Rohres, wenn sich während der Inkubation ein Sediment von Perlen bildet.
  11. Extrahieren Sie die RNA durch Zugabe von 800 L RNA-Extraktionsreagenz und nach einem sauren Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktionsprotokoll, und fahren Sie wie in Schritt 1.2 fort. Um die Sichtbarkeit des RNA-Pellets zu erhöhen, kann ein farbiges Co-Gefällt mir in Isopropanol beim Fällungsschritt zugesetzt werden. Setzen Sie das Pellet in 20 l RNase-freiH2 O(oder gleich dem Eingangsvolumen in Schritt 2.3) wieder auf.

3. Nachgelagerte Analyse

  1. Senden Sie die Eingabe- und IP-Beispiele für die Single-End-Sequenzierung mit 50 Basen Leselänge (SE50).
  2. Trim 3' Endadapter mit cutadapt41 und discard reads, die kürzer als 48 nt sind.
  3. Karte getrimmt liest das Arabidopsis Genom (TAIR10-Anmerkung) mit STAR42 mit einem Cutoff von 6% für Inkongruenzen und maximale Introngröße von 10 kb. Bewahren Sie die eindeutig zugeordneten Lesevorgänge für weitere Analysen auf.
  4. Identifizieren Sie angereicherte RNA-Fragmente in IP-Proben im Vergleich zu Input mit zwei unterschiedlichen Methoden und betrachten Sie diejenigen, die durch beide signifikant angereichert sind.
    1. Erkennen Sie zunächst MeRIP-Seq-Peaks mithilfe des MACS2-Spitzenrufers43 auf gepoolten IPs im Vergleich zu Input.
    2. Zweitens folgen Sie der Analyse für MeRIP-seq Peak Calling, wie in Meyer et al.22 und Yang et al.17beschrieben.
      1. Teilen Sie das Genom mithilfe benutzerdefinierter R-Skripte in unterschiedliche 25 nt-Fenster auf und zählen Sie die Anzahl der eindeutig zugeordneten Lesevorgänge für jedes Fenster basierend auf der Position des letzten zugeordneten Nukleotids (da die Lesevorgänge aus 100 nt RNA-Fragmenten stammen).
      2. Berechnen Sie deutlich angereicherte Fenster in IP-Samples im Vergleich zu Input mit dem Fisher Exact Test. Verwenden Sie das Benjamini-Hochberg-Verfahren, um mehrere Tests zu korrigieren.
      3. Halten Sie die deutlich angereicherten Spitzen, die sich über mindestens zwei aufeinander folgende Fenster erstrecken, und verwerfen Sie Spitzen, die nur ein Fenster abdecken.
  5. Identifizieren Sie annotierte Regionen des Genoms (Transkripte) mit signifikant angereicherten Spitzen, die durch beide Methoden gefunden werden.
  6. Alternativ oder komplementär testen Sie spezifische RNA-Targets für ihre Anreicherung in den IP-Proben.
    1. Transkribieren Sie die RNA (gleiches Volumen von Input-, IP- und Mock-Proben) mit zufälligen Hexamern um.
    2. Führen Sie quantitative Echtzeit-PCR auf den ausgewählten Zielen durch und vergleichen Sie Input, IP und Mock über die Methode "Ct".
      HINWEIS: Das generierte Produkt sollte nicht länger als 100 bp sein, da dies die durchschnittliche Fragmentierungsgröße ist.

Representative Results

Ein Schaltplan der Methode ist in Abbildung 1dargestellt. Die ersten kritischen Schritte des Protokolls sind die Gewinnung von RNA von guter Qualität (RIN ≥ 7) und die Beschallung auf ca. 100 nt Fragmente. Die Effizienz beider Schritte wird von einer spanbasierten Kapillarelektrophoresemaschine untersucht. In Abbildung 2Awird ein repräsentativer Lauf einer guten RNA-Probe gezeigt. Die Probe wird vor dem Laden auf dem Chip 1:10 verdünnt, um eine Konzentration zu erreichen, die im Erfassungsbereich des verwendeten Kits liegt (5-500 ng/l). Das gleiche Sample wird auch nach der Beschallung ausgeführt und ist in Abbildung 2Bdargestellt. Beachten Sie das Vorhandensein eines einheitlichen Peaks, der sich links vom Diagramm mit einer Größe von etwa 100 Nukleotiden bewegt. Die geringere Konzentration wird sowohl durch den Verlust der RNA während der Fragmentierung als auch durch das erhöhte Volumen der Proben (60-100 l, Schritt 1.7.1) verursacht.

Die Qualität der IP- und Mock-Samples kann mit qRT-PCR bewertet werden. Zu diesem Zweck dienen die eingespritzten IVTs als positive und negative Kontrollen: Die methylierte IVT, bei der in allen Cytosinpositionen m5C liegt, wird voraussichtlich in der IP-Probe stark angereichert; im Gegenteil, die nicht methylierte IVT sollte keinen Unterschied zwischen IP und Mock haben. Die im qRT-PCR-Assay für die beiden Steuer-IVTs(EGFP und Renilla luciferase) verwendeten Primer sind in Tabelle 1aufgeführt. Wie in Abbildung 3dargestellt, wurden etwa 80 % der methylierten IVT in der IP-Probe und nur etwa 2 % im Mock zurückgewonnen. Bei der nicht-methylierten Kontrolle lag die Wiederherstellung sowohl in IP- als auch in Mock-Proben unter 1%. Dies bestätigt die Effizienz von MeRIP, dass methylierte RNA-Fragmente gefällt und angereichert wurden, und ist ein guter Indikator dafür, dass die Proben für nachgelagerte Analysen verwendet werden können. Darüber hinaus kann die Faltenanreicherung des nicht-methylierten IVT (IP-zu-Mock-Verhältnis) als Schwellenwert für die Schätzung der Signifikanz der Anreicherung in den qRT-PCR-Assays angewendet werden.

Nach dem Ausrichten der Lesevorgänge am Genom (Abbildung 4) werden die in den Schritten 3.4.1 und 3.4.2 beschriebenen Spitzenaufrufalgorithmen angewendet, um die statistisch signifikanten Fenster zu identifizieren, die in den IP-Beispielen im Vergleich zur Eingabe angereichert sind. Die Sequenzen, die diesen Fenstern entsprechen, können weiter verwendet werden, um z.B. nach konservierten Methylierungsmotiven11,17zu suchen.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des MeRIP-seq-Protokolls.
RNA-Proben werden mit einem Antikörper für 5-methylierte Zytosine inkubiert und die Komplexe werden mit Protein-G-Magnetperlen nach unten gezogen, die die Antikörper zusammen mit der gebundenen RNA erfassen. Die eluierten RNA-Proben werden durch Tiefe Sequenzierung und qRT-PCR analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse aus der Qualitätsanalyse von RNA-Proben.
(A) Repräsentatives Profil einer qualifizierten RNA-Gesamtprobe. (B) Repräsentatives Profil einer RNA-Probe nach Beschallung auf 100 nt Fragmente. Ausgabedateien aus der Kapillarelektrophorese-Software. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: qRT-PCR-Analyse von Steuer-IVTs.
Methylierte bzw. nicht-methylierte In-vitro-Transkripte wurden als positive bzw. negative Kontrollen des MeRIP-Assays verwendet. Nach Derpräzipitierung ist das methylierte IVT in der IP-Probe hoch angereichert (grün), aber nicht in der Mock-Probe (ohne Anti-m5C-Antikörper; violett). Die nicht methylierte IVT zeigte keine Anreicherung und keinen Unterschied zwischen IP und Mock. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Lesen Sie die Ausrichtung vor und nach MeRIP um ein repräsentatives Transkript.
Liest, die an einem bestimmten Transkript im Eingabebeispiel (obere Zeile) und in zwei IP-Replikationen (mittlere und untere Zeile) ausgerichtet sind. Die Blackbox zeigt ein identifiziertes angereichertes 50 nt langes Fenster basierend auf MACS243 und MeRIP-seq22 Peak-Calling-Analysen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ziel Primer-Paar Produktsequenz Produktlänge
EGFP Für: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCC -3' GGCAACTACACAACCCGCGCCGAG
GTGAAGGAGGAGGGCGACACCCTG
GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC		 72 bp
Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'
Renilla luciferase Für: 5'- GGAGAATAACTTCTCGTGGAAAC -3' GGAGAATAACTTCGTGTGGAAACC
ATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAA
AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC		 75 bp
Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'

Tabelle 1: Informationen zu den Primern und generierten Produkten für die qRT-PCR-Analyse.

Puffer-Rezepte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

RNA enthält mehr als hundert verschiedene Basismodifikationen4, die das Epitranskriptom44bilden. Diese Änderungen fügen eine zusätzliche Schicht der Regulierung der Übersetzung und Signalisierung (überprüft in5,6,8,20,45,46). Frühe Studien konnten das Vorhandensein von post-transkriptionellen Modifikationen an RNA28,47 feststellen, aber die spezifischen modifizierten RNAs müssen identifiziert werden, um die Rolle der Epitranskriptomik zu verstehen. MeRIP wurde als Methode zur Kartierung von RNA-Methylierungsstellen Transkriptom-weit21,22entwickelt. Es kann an jede Modifikation angepasst werden, wenn ein spezifischer Antikörper verfügbar ist.

Die Hauptstärke dieses Protokolls ist, dass relativ einfach, sicher für die RNA und den Benutzer (z.B. 5-azaC ist hochgiftig für Pflanzen und Menschen) und erfordert keine Sequenz- oder Änderungsenzyminformationen. Darüber hinaus erhöht die Anreicherung methylierter RNAs durch das UZ die Wahrscheinlichkeit, dass niedrig reichlich eMRnAs nachgewiesen werden können, im Gegensatz zur Bisulfitsequenzierung, die keinen Anreicherungsschritt enthält. Wenn zwei serielle Runden von MeRIP durchgeführt werden, erhöht sich die Anreicherung in RNA-Fragmenten, die Methylierungsstellen enthalten, umweitere 22. Eine der Einschränkungen von MeRIP, insbesondere bei mRNA-Methylierungsstudien, ist die hohe RNA-Menge, die als Input für den Assay benötigt wird. Der Ribodepletion – oder Poly(A)-Anreicherung – reduziert den Hintergrund, der durch die stark modifizierte ribosomale RNA verursacht wird, entfernt aber mehr als 90% der gesamten RNA. Die DNA muss auch vollständig entfernt werden, da sie reich an 5-methylierten Zytosinen ist. Ein weiterer Nachteil ist die niedrigere Auflösung der genauen Position der Methylierung. Die Beschallung der RNA vor der Inkubation mit dem Antikörper hilft in diese Richtung, indem der Bereich, der die Modifikation enthält, auf 100-200 Nukleotide eingeengt wird. Wenn MeRIP mit einer tiefen Sequenzierung kombiniert wird, erhöht sich die Auflösung der m5C-Standortvorhersage, wenn die Sequenzierungslesungen eine Gaußsche Verteilung um die potenzielle Methylierungsstelle bilden. Zusätzlich muss die Spezifität des Antikörpers vor dem Test bestätigt werden (z.B. mit RNA-Dot-Blot-Assays, die mit Oligos durchgeführt werden, die mit modifizierten Nukleotiden synthetisiert werden), inwieweit ein Antikörper tatsächlich zwischen eng verwandten Modifikationen unterscheiden kann (z.B. m6A und m6Am), ein Argument punktierend im Feld48,49. Darüber hinaus könnten hochstrukturierte RNAs die Antikörper-Antigen-Interaktion beeinträchtigen, eine weitere Einschränkung, die meist mit Fragmentierung und Denaturierung von RNA vor dem GEISTIGEN Schutz der RNA angegangen wird. Im Gegenteil, die Bisulfitsequenzierung, die auch von sekundären Strukturen beeinflusst wird, enthält keinen Fragmentierungsschritt, und dies könnte ein Grund dafür sein, dass die m5C-Standorte und die mRNAs, die durch die Bisulfitsequenzierung16 und MeRIP-seq11,17vorhergesagt werden, diskrepanziert werden. Andere Zytosinmodifikationen (z.B. hm5C) sind ebenfalls resistent gegen Bisulfit-vermittelte Deamination35.

Zu den Modifikationen von MeRIP-seq gehören ein Vernetzungsschritt, entweder mit der Einführung eines photoaktivierbaren Ribonukleosids (foto-vernetzungsunterstützt m6A-seq, PA-m6A-seq 50) oder mit UV-Licht zur Herstellung von Antikörper-RNA-Kreuzlinks nach der IP (miCLIP49, andere Methode als die in Einführung30beschriebene miCLIP). In zukunftdessen und da sich das Wissen über die RNA-Methylierung ansammelt, könnten gezieltere Ansätze vorzuziehen sein, basierend auf den modifizierenden Enzymen und/oder den Konsenssequenzen, in denen Methylierung auftritt. Die Identifizierung von Leseproteinen ist für das Verständnis der molekularen und Signalfunktion posttranskriptieller Modifikationen unerlässlich. Die Nanoporen-Sequenzierungstechnologie ermöglicht bereits die direkte Identifizierung modifizierter Nukleotide ohne vorherige Behandlung der RNA17, aber es gibt noch Raum für Verbesserungen in diesem Bereich in Bezug auf Sequenztiefe und bioinformatische Analyse. Insgesamt ist MeRIP-seq derzeit ein etablierter, zuverlässiger und unvoreingenommener Ansatz zur Identifizierung methylierter RNA-Transkripte.

Disclosures

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch ein IMPRS PhD Stipendium an E.S, ein EMBO Long-Term Fellowship an V.P., und MPI-MPP interne Mittel an F.K. unterstützt. Ein Teil dieser Arbeit wurde auch durch PLAMORF finanziert, ein Projekt, das vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizont 2020 der Europäischen Union (Grant Agreement No. 810131) gefördert wurde. Die Autoren danken Federico Apelt für die bioinformatische Analyse und Kommentare zum Manuskript und Mathieu Bahin und Amira Kramdi für die bioinformatische Analyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microcentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath

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References

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Genetik Ausgabe 159 RNA-Methylierung 5-Methylcytosin (m5C) Immunpräzipitation (IP) Arabidopsis Epitranskriptomik mRNA RNA-Sequenzierung

Erratum

Formal Correction: Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis
Posted by JoVE Editors on 05/19/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. The author list was updated.

The author list was updated from:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua

to:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Methylierte RNA-Immunpräzipitierung Assay zur Studie m<sup>5</sup>C Modifikation bei Arabidopsis
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Saplaoura, E., Perrera, V., Colot,… More

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).

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