Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m5C שינוי ערבידופסיס

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/61231
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua, 3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

מבחני האימונו-פסיכוטיציה של ה-RNA המתילציה הם שיטה מבוססת נוגדנים המשמשת להעשרה עבור שברי RNA מתילציה. יחד עם רצף עמוק, זה מוביל לזיהוי של תעתיקים הנושאים את שינוי m5C.

Abstract

שינויים משניים בבסיס על RNA, כגון m5C, משפיעים על המבנה והתפקוד של מולקולות ה- RNA ששונו. מתילציה RNA אימונואוציאציה רצף (MeRIP-seq) היא שיטה שמטרתה להעשיר עבור RNA מתילציה ובסופו של דבר לזהות תעתיקים שונה. בקצרה, RNA sonicated הוא דגירה עם נוגדן עבור 5-מתילציה ציטוזינות, זירז בסיוע חרוזי חלבון G. לאחר מכן, הקטעים המועשרים רצפים ואתרי המתילציה הפוטנציאליים ממופים על סמך התפלגות הקריאות וזיהוי השיא. MeRIP יכול להיות מיושם על כל אורגניזם, כפי שהוא אינו דורש כל רצף קודם או שינוי ידע אנזים. בנוסף, מלבד פיצול, RNA אינו נתון לכל טיפול כימי או טמפרטורה אחר. עם זאת, MeRIP-seq אינו מספק חיזוי חד-נוקלאוטידים של אתר המתילציה כפי שעושות שיטות אחרות, אם כי ניתן לצמצם את האזור המתילציה לכמה נוקלאוטידים. השימוש בנוגדנים ספציפיים לשינויים שונים מאפשר ל- MeRIP להיות מותאם לשינויי הבסיס השונים הקיימים ב- RNA, ולהרחיב את היישומים האפשריים של שיטה זו.

Introduction

בכל שלוש ממלכות החיים, מיני RNA עוברים שינויים פוסט-שעתוק ומחקר על שינויים ביוכימיים רלוונטיים מבחינה תפקודית אלה נקרא "אפיטרנקריפטומיקה". אפיטראנודומיקה היא תחום גדל ושיטות שונות מפותחות כדי ללמוד ולמפות את השינויים על מולקולות RNA (נבדק ב1,2). יותר ממאה שינויים RNA נמצאו, זוהו rRNAs, tRNAs, ncRNAs אחרים, כמו גם mRNAs3,4. למרות הנוכחות והתפקוד של שינויים פוסט שעתוק מגוונים מבחינה כימית tRNAs ו rRNAs נחקרים בהרחבה5,6,7,8, רק לאחרונה יש שינויים mRNA התאפיינו. בצמחים זוהו עד כה שינויים רבים ב- mRNA, כולל m7G במבנה הכובע9, m1A10,hm 5C11,12, ו uridylation13. עם זאת, רק m6A10,14,15, m5C11,16,17, ו פסאודורידין18 מופו תעתיק רחב ערבידופסיס. שינויים בבסיס mRNA לאחר שעתוק מעורבים במספר תהליכים התפתחותיים19,20.

אחת הגישות הנפוצות ביותר באפיטראנודומיקה היא האימונופרציפיטציה המתילציה של RNA בשילוב עם רצף עמוק (MeRIP-seq). MeRIP-seq פותחה בשנת 2012 כדי לחקור m6A בתאי יונקים21,22. זה דורש שימוש בנוגדן לשינוי הרצוי ומטרתו להעשיר עבור שברי RNA הנושאים את הנוקלאוטידים ששונו. זה בדרך כלל ואחריו רצף עמוק כדי לזהות ולמפות את שברים מועשרים או PCR כמותי כדי לאמת מטרות RNA ספציפיות. הדיוק של MeRIP מבוסס על הספציפיות של הנוגדן לזהות את הנוקלאוטידים ששונו על פני שינויים דומים (למשל, מ'5C ו hm5C11,23). מלבד m6A, MeRIP-seq הוחל גם ללמוד m1A ו m5C RNA מתילציה בכמה אורגניזמים11,17,23,24,25.

מתילציה של ציטוצין בתנוחת הפחמן החמישית (m5C) היא שינוי הדנ"א השכיח ביותר26,27 ואחד השינויים הנפוצים ביותר RNA מדי3,4. בעוד m5C זוהה ב mRNAs eukaryotic בשנת 197528, רק לאחרונה יש מחקרים התמקדו במיפוי תעתיק השינוי רחב, קידוד ולא קידוד RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.

שיטות חלופיות המשמשות במחקר m5C RNA כוללות המרה כימית של ציטוסינים לא מתילציה לתוך uracils (רצף ביסולפיט) ו immunoprecipitation assays מבוסס על כריכה בלתי הפיכה של ציטוסין RNA ידוע מתילטרנספראז למטרות RNA שלה (miCLIP, aza-IP). בקצרה, רצף ביסולפיט מנצל את התכונה של ציטוצין 5-מתילציה להיות עמיד לטיפול דו-סולפיט נתרן כי deaminates ציטוסינים ללא שינוי כדי uracil. השיטה פותחה לראשונה עבור DNA אך הותאמה גם עבור RNA ומחקרים רבים בחרו בגישה זו כדי לזהות m5C אתרים RNA16,23,29,32,34,35. הן miCLIP והן aza-IP דורשים ידע קודם של RNA ציטוסין מתילטרנספראז ושימוש בנוגדן בהתאמה. במקרה של miCLIP (מתילציה אישית-נוקלאוטידים ברזולוציה הצלבה ו immunoprecipitation), מתיל טרנספראז נושאת מוטציה אחת חומצת אמינו, כך שהוא נקשר למצע RNA אבל לא ניתן לשחרר30. ב aza-IP (5-azacytidine-בתיווך RNA immunoprecipitation), הכריכה הבלתי הפיכה נוצרת בין נוקלאוזיד 5-azaC לבין RNA ציטוצין מתילטרנספראז כאשר מסופק אקסוגני 5-azaC משולב על ידי פולימראזים RNA לתוך מולקולת RNA היעד31.

היתרון העיקרי של שלוש שיטות אלה הוא שהם מאפשרים מיפוי רזולוציה נוקלאוטידים יחיד של m5C. בנוסף, miCLIP ו- aza-IP מספקים מידע על המטרות הספציפיות של RNA נבחר ציטוסין מתילטרנספראז, פענוח עמוק יותר את המנגנון והתפקיד של שינויים RNA שלאחר שעתוק. עם זאת, הגישה MeRIP-seq יכול לזהות תמלול רחב m5C אזורים ללא כל ידע קודם נדרש ומונע תנאים כימיים וטמפרטורה קשים, כגון טיפול ביסולפיט או דגירה עם 5-azaC. ניתן לעכב הן את מריפט והן את רצף הביסולפיט על ידי מבני RNA משניים36. שלב הפיצול הכלול במבחן MeRIP לפני immunoprecipitation נועד להקל על מחייב נוגדנים ולהגדיל את הרזולוציה של זיהוי m5C.

שיטה נוספת שראוי להזכיר היא ספקטרומטריית מסה (MS) של גרעיני RNA. טרשת נפוצה יכולה לזהות ולהבחין בכל סוג של שינוי הן בדנ"א והן ב- RNA. בקצרה, RNA מופק DNase מתעכל, אז התפלה מתעכל נוקלאוזידים בודדים. נוקלאוזידים RNA מנותחים על ידי ספקטרומטר מסה. שיטה זו יכולה לשמש לכימות הרמות של כל שינוי והיא אינה מסתמכת על נוגדן או המרה כימית. עם זאת, חיסרון גדול הוא שהוא מספק מידע בתפזורת על נוכחות של שינויים RNA. על מנת למפות את השינויים, טרשת נפוצה צריכה להיות משולבת עם עיכול RNase ומידע רצף על מולקולות RNA ספציפיות, כמו במקרה של tRNAלאואנושי(CAA)37.

כאן, אנו מתארים ומשוחחים על מבחני MeRIP כפי שרגילים ללמוד m5C RNA מתילציה ב Arabidopsis17.

Protocol

1. הכנת ה- RNA

  1. טוחנים 200 מ"ג של רקמת צמח לאבקה בחנקן נוזלי, ומוודאים שהרקמה נשארת קפואה לאורך כל ההליך.
  2. לחלץ את ה-RNA מרקמת הצמח הרצוי בעקבות חומצה guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם פרוטוקול החילוץ. כדי להקטין את האפשרות לזהם RNA עם DNA במהלך הפרדת הפאזה, השתמש 1-ברומו-3-כלורופרופן במקום כלורופורם.
    1. הוסף 1 מ"ל של ריאגנט מיצוי RNA המכיל guanidine thiocyanate וחומצה פנול לרקמת הצמח טחון (500 μL לכל 100 רקמת מ"ג). מערבבים היטב על ידי היפוך ולוודא את כל הרקמה רטובה. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לנתק את מתחמי ריבונוקלאופרוטאין.
    2. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 12,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהעביר את supernatant לצינור חדש 1.5 מ"ל.
    3. הוסף 200 μL של 1 ברומו-3-כלורופרופן (100 μL לכל 500 μL RNA מיצוי מגיב) ומערבולת במרץ.
    4. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 12,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולהעביר את השלב מימית העליונה (כ. 500 μL) לצינור חדש 1.5 מ"ל.
    5. הוסף 1 נפח של איזופרופנול (500 μL) ו 0.1 נפח של 3 M נתרן אצטט pH 5.5 (50 μL), לערבב היטב על ידי היפוך מזרז 10 דקות ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: מומלץ להשתמש בנתרן אצטט (NaOAc) על מנת לשפר את המשקעים של ה-RNA. הפרוטוקול יכול להיות מושהה בשלב זה על ידי הארכת המשקעים של RNA במשך כמה שעות או אפילו לילה.
    6. צנטריפוגה במשך 30 דקות ב 12,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס ולזרוק את supernatant.
    7. לשטוף את גלולה פעמיים עם 500 μL של 80% EtOH, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 12,000 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס להשליך.
    8. לשטוף את גלולה פעם אחת עם 500 μL 99% EtOH, צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 12,000 x g ב 4 מעלות צלזיוס להשליך.
    9. יבש את גלולה במשך 5-10 דקות להתמוסס ב 30 μL של RNase חינם H2O.
      הערה: במקום זאת, השתמש בכל פרוטוקול חילוץ RNA לבחירה (למשל, מערכת מבוססת עמודה). אם תקציר DNase כלול בפרוטוקול, דלג עליו בשלב הבא (שלב 1.3).
  3. למדוד את ריכוז RNA (למשל, עם השימוש בספקטרופוטומטר) ולעכל 20 מיקרוגרם של RNA עם DNase.
    הערה: הדנ"א עשירב-m 5C והנוגדן אינו מבחין בין דנ"א ל-RNA.
    1. בתגובת DNase טיפוסית, לטפל 10 מיקרוגרם של RNA בתגובה 50 μL. מערבבים את הרכיבים הבאים ומדגרים את התגובות ב-37°C למשך 30 דקות:
      10 מיקרוגרם של RNA x μL
      מאגר DNase 10x 5 μL
      DNase 1 μL (2 יחידות)
      H2O ללא RNase עד 50 μL
    2. הסר את האנזים או על ידי הוספת נפח מתאים של מגיב איון DNase (אם הוא כלול בערכת DNase ועל פי הוראות היצרן) או על ידי ביצוע צעד ניקוי (למשל, טיהור עמודה או מיצוי פנול / כלורופורם).
  4. בדוק את האיכות והטוהר של RNA מבודד על ידי אלקטרופורזה נימי ולהמשיך אם מספר שלמות RNA (RIN) גבוה מ 7, כדי להבטיח את הדגימות הן באיכות טובה.
  5. אופציונלי: הסר את RNA ריבוזומלי כדי להעשיר את הדגימות בתוכן mRNA באמצעות ערכת הסרת rRNA ועל פי פרוטוקול היצרן.
    1. השתמש ב- DNase שטופלו ב- RNA מהשלב הקודם לתגובת דלדול rRNA. בצע תגובות מרובות אם כמות ה- RNA הכוללת היא יותר מהכמות המרבית המוצעת לתגובה.
    2. שים לב כי רק 5-10% מסכום הקלט יתאושש לאחר דלדול rRNA. המשך עם RNA מדולדל rRNA (כמות שווה עבור כל הדגימות) ולהתעלם הסכומים שהוזכרו בשלבים הבאים, כפי שהם מתייחסים RNA הכולל.
      הערה: להשוואה ותיאור של שיטות דלדול rRNA זמין ראה הפניות 38,39,40. rRNA הוא החלק העיקרי של RNA הכולל והוא m5C מתילציה באורגניזמים רבים.
  6. הכן מראש תעתיקי במבחנה (IVT) שישמשו כרצפי RNA של בקרה והוסף אותם בדגימות.
    1. לייצר שני IVTs נפרדים באמצעות ערכת שעתוק במבחנה, אחד עם נוקלאוזידים שאינם מתילציה ואחד שבו rCTP מוחלף על ידי 5-מתיל-rCTP, כדי לשמש פקדים שליליים וחיוביים MeRIP, בהתאמה. התמלילים שהוכנו היו אלה של EGFP ורניה לוציפראז.
      הערה: IVTs לא צריך להתקיים בתעתיק של האורגניזם שאתה מנתח. אם ה- IVTs הם מאותה תבנית (למשל, שניהם EGFP), הוסף את הפקד החיובי והשלילי בשתי דגימות שונות. אם הרצף שלהם שונה (למשל, EGFP ו- Renilla), ניתן להוסיף אותם לאותה דגימה.
    2. ספייק בכל מדגם 0.1 ng IVT לכל 3 מיקרוגרם של RNA, כפקדים.
  7. ל סוניק את ה-RNA לכ-100 nt שברים.
    הערה: התנאים לגזירה RNA חייב להיות מותאם מראש והם שונים עבור כל sonicator. עבור המודל המשמש כאן, sonication מבוצעת עם התנאים הבאים: כוח שיא 174, גורם חובה 10, מחזורים / פרץ 200, 17 דקות.
    1. Sonicate אותה כמות של RNA עבור כל הדגימות, לפחות 12 מיקרוגרם RNA לכל מדגם ב 80 μL של נפח כולל (מינימום 60 μL, מקסימום 100 μL), מלא RNase חינם H2O.
  8. אשר את היעילות של sonication ואת הריכוז של דגימות RNA על ידי אלקטרופורזה נימי. הגודל הממוצע של RNA מקוטע צריך להיות סביב 100 nt.

2. מתילציה RNA אימונופרציפיטציה (MeRIP)

  1. בצינורות בעלי כריכה נמוכה, הוסיפו 9 מיקרוגרם של RNA sonicated ו- RNase ללא H2O עד 60 μL (או יותר, בהתאם לריכוז).
  2. לנתק את המבנים המשניים על ידי חימום RNA ב 70 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 10 דקות וקירור במשך 10 דקות נוספות בתערובת מי קרח.
  3. לפצל את המדגם בשלושה חלקים: שליש (20 μL, אם 60 μL נלקחו בשלב 2.1) נשמר בצינור נפרד ב -80 מעלות צלזיוס כמדגם הקלט. מלא את 40 μL הנותרים עם RNase חינם H2O עד 860 μL ולאחר מכן לפצל שני צינורות מחייב נמוך: אחד עבור IP ואחד עבור שליטה מדומה (430 μL כל אחד).
  4. הוסף לשני הצינורות:
    50 μL של מאגר MeRIP 10x
    10 μL של מעכב RNase
    10 μL של נוגדן α-m5C (10 מיקרוגרם) במדגם IP לכל 10 μL של H2O במדגם מדומה
    הערה: שיבוט הנוגדנים ששימש בעבר אינו זמין מסחרית יותר. עם זאת, כל נוגדן חד שבטי אנטי 5-מתילסיטוסין צריך לעבוד באופן דומה. נוגדנים יש לבדוק את הספציפיות לפני השימוש עבור MeRIP11,23.
  5. לאטום את הצינורות עם parafilm ודגרת במשך 12-14 שעות ב 4 מעלות צלזיוס, עם סיבוב תקורה.
  6. למחרת, להכין את החלבון G חרוזים מגנטיים עבור קשירה.
    1. עבור כל צינור (בקרת IP או Mock), השתמש 40 μL של חרוזים. הוסף את הכמות הכוללת של חרוזים (# של צינורות x 40 μL, לדוגמה, עבור 2 דגימות IP ו 2 דמה, 160 μL של חרוזים נדרשים) בצינור 15 מ"ל ולשטוף שלוש פעמים עם 800 μL של 1x מאגר MeRIP לכל מדגם (# של צינורות x 800 מאגר μL, למשל, 3.2 מ"ל עבור 2 IP ו 2 דגימות מדומה).
    2. בצע שטיפות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות עם סיבוב תקורה, לאסוף את החרוזים בעזרת מתלה מגנטי להשליך את מאגר הכביסה. לאחר הכביסה השלישית, resuspend את החרוזים באותו נפח של 1x מאגר MeRIP כמו נפח הראשוני של חרוזים נלקח (# של צינורות x 40 μL, למשל, 160 μL של 1x מאגר MeRIP עבור 2 IP ו 2 דגימות מדומה).
      הערה: כמות החלבון G חרוזים בשימוש נקבעת על ידי יכולת הכריכה של החרוזים עבור סוג הנוגדן הספציפי ואת כמות הנוגדן בשימוש. במקרה זה, החרוזים יש קיבולת מחייבת של כ. 8 מיקרוגרם של העכבר IgG לכל מ"ג של חרוזים ו 30 מ"ג / מ"ל ריכוז. לכן, 40 μL מספיקים כדי לאגד כ. 9.6 מיקרוגרם של נוגדן.
  7. הוסף 40 μL של חרוזים בשימוש חוזר לכל מדגם IP ו Mock ודגירה במשך 2 שעות נוספות ב 4 מעלות צלזיוס, עם סיבוב תקורה.
  8. מניחים את הצינורות על מתלה מגנטי במשך דקה ולזרוק את supernatant או לשמור אותו כפקד (מדגם RNA שאינו מאוגד).
  9. לשטוף את החרוזים 5 פעמים על ידי resuspending ב 700 μL של 1x מאגר MeRIP מסופק עם 0.01% Tween 20 ודגרת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם סיבוב תקורה.
  10. מוציאים מחדש את החרוזים שנשטפו ב-200 μL של מאגר עיכול Proteinase K ומוסיפים 3.5 μL של Proteinase K. דגירה למשך 3 שעות ב-50°C, רועדים במהירות של 800 סל"ד. מדי פעם, להעיף באופן ידני את החלק התחתון של הצינור אם משקע של חרוזים נוצר במהלך הדגירה.
  11. לחלץ את ה-RNA על ידי תוספת של 800 μL של מגיב מיצוי RNA בעקבות חומצה guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם פרוטוקול החילוץ, ולהמשיך כמו בשלב 1.2. כדי להגביר את הראות של גלולת RNA, משקעים צבעוניים ניתן להוסיף isopropanol בשלב המשקעים. Resuspend גלולה ב 20 μL של RNase חינם H2O (או שווה נפח קלט נשמר בשלב 2.3).

3. ניתוח במורד הזרם

  1. שלח את דוגמאות הקלט וה- IP עבור רצף קצה יחיד עם אורך קריאה של 50 בסיסים (SE50).
  2. חותכים מתאמי קצה 3' באמצעות cutadapt41 ולזרוק קריאות כי הם קצרים מ 48 nt.
  3. מפה קצוצה קוראת לגנום Arabidopsis (ביאור TAIR10) באמצעות STAR42 עם ניתוק של 6% עבור אי התאמות וגודל אינטרון מקסימלי של 10 kb. שמור קריאות הממופות באופן ייחודי לצורך ניתוח נוסף.
  4. זהה שברי RNA מועשרים בדגימות IP בהשוואה לקלט באמצעות שתי שיטות נפרדות ושקול את אלה שנמצאו מועשרים באופן משמעותי על ידי שניהם.
    1. תחילה, זהה פסגות MeRIP-seq באמצעות MACS2 שיא המתקשר43 על IPs במאגר לעומת קלט.
    2. שנית, בצע את הניתוח עבור שיחות שיא MeRIP-seq כמתואר מאייר ואח'22 ויאנג ואח'17.
      1. באמצעות סקריפטים R מותאמים אישית, לחלק את הגנום בחלונות nt 25 nt ייחודי לספור את מספר קריאות ממופה באופן ייחודי עבור כל חלון בהתבסס על המיקום של נוקלאוטידים ממופה האחרון (מאז הקריאות מקורם 100 nt שברי RNA).
      2. חשב חלונות מועשרים באופן משמעותי בדגימות IP בהשוואה לקלט עם הבדיקה המדויקת של פישר.
      3. שמור על הפסגות המועשרות באופן משמעותי המשתרעות על פני שני חלונות רצופים לפחות ומשליכות פסגות המכסות חלון אחד בלבד.
  5. זהה אזורים מבוארים של הגנום (תעתיקים) עם פסגות מועשרות באופן משמעותי שנמצאו על ידי שתי השיטות.
  6. לחלופין או באופן משלים, בדוק יעדי RNA ספציפיים להעשרתם בדגימות ה- IP.
    1. הפוך לתמלל את RNA (אותו נפח של דגימות קלט, IP ו Mock) עם hexamers אקראי.
    2. בצע PCR כמותי בזמן אמת על המטרות שנבחרו, השוואת קלט, IP ו Mock באמצעות שיטת ΔΔCt.
      הערה: המוצר שנוצר לא צריך להיות ארוך יותר מ 100 bp, כמו זה הוא גודל הפיצול הממוצע.

Representative Results

סכמטי של השיטה מסופק באיור 1. השלבים הקריטיים הראשונים של הפרוטוקול הם להשיג RNA באיכות טובה (RIN ≥ 7) ולהסתנן אותו כ 100 nt שברים. היעילות של שני השלבים נבחנת על ידי מכונת אלקטרופורזה נימי מבוסס שבב. באיור 2Aמוצגת הפעלה מייצגת של דגימת RNA טובה. המדגם מדולל 1:10 לפני טעינה על השבב על מנת לקבל ריכוז כי הוא בטווח של זיהוי של הערכה בשימוש (5-500 ng/μL). אותה דגימה מופעלת גם לאחר sonication ומוצגת באיור 2B. שים לב שנוכחותו של פסגה אחידה אחת עברה משמאל לדיאגרמה, בגודל של כ-100 נוקלאוטידים. הריכוז הנמוך נגרם הן על ידי אובדן RNA במהלך הפיצול, אלא גם בגלל נפח מוגבר של הדגימות (60-100 μL, שלב 1.7.1).

ניתן להעריך את איכות דגימות ה- IP וה- Mock על-ידי qRT-PCR. לשם כך, IVTs זינק לשמש פקדים חיוביים ושליליים: IVT מתילציה, שבו בכל תנוחות ציטוצין יש m5C, צפוי להיות מועשר מאוד במדגם ה-IP; להיפך, IVT שאינו מתילציה לא צריך להיות הבדל בין IP ו Mock. הפריימריז המשמשים ב- qRT-PCR לבדיקת שני ה- IVTs של הפקד(EGFP ורנילה לוציפראז) מפורטים בטבלה 1. ואכן, כפי שמוצג באיור 3, כ-80% מה-IVT המתילציה נמצאו במדגם ה-IP, ורק כ-2% ב-Mock. עבור פקד שאינו מתילציה, ההתאוששות הייתה מתחת 1% הן דגימות IP ו Mock. זה מאמת את היעילות של MeRIP כי שברי RNA מתילציה היו זירז מועשר, והוא אינדיקטור טוב כי הדגימות ניתן להשתמש לניתוח במורד הזרם. בנוסף, העשרת הקיפול של IVT שאינו מתילציה (יחס IP ל- Mock) ניתן להחיל כסף להערכת המשמעות של העשרה ב- qRT-PCR מבחנים.

לאחר יישור הקריאות לגנום (איור 4), אלגוריתמי הקריאה הגבוהים המתוארים בשלבים 3.4.1 ו- 3.4.2 מוחלים כדי לזהות את החלונות המשמעותיים סטטיסטית, המועשרים בדגימות ה- IP בהשוואה לקלט. ניתן להשתמש ברצפים התואמים לחלונות אלה עוד יותר, לדוגמה כדי לחפש מוטיבים שמורים הקשורים למתילציה11,17.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול MeRIP-seq.
דגימות RNA הם דגירה עם נוגדן עבור 5-מתילציה ציטוזינות ואת המתחמים נמשכים למטה עם חלבון G חרוזים מגנטיים הלוכדים את הנוגדנים יחד עם RNA קשור. דגימות RNA eluted מנותחים על ידי רצף עמוק qRT-PCR. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות מייצגות מניתוח איכות של דגימות RNA.
(A) פרופיל מייצג של מדגם מפעל RNA כולל מוסמך. (B) פרופיל מייצג של דגימת RNA לאחר sonication ל 100 nt שברים. קבצי פלט מתוכנת אלקטרופורזה נימי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח qRT-PCR של IVTs בקרה.
תעתיקים מתילציה ולא מתילציה במבחנה שימשו כפקדים חיוביים ושליליים של מבחני MeRIP, בהתאמה. לאחר immunoprecipitation, IVT מתילציה מועשר מאוד מדגם IP (ירוק) אבל לא במדגם מדומה (ללא נוגדן אנטי מ'5C; סגול). IVT שאינו מתילציה לא הראה שום העשרה ואין הבדל בין IP ו Mock. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: קרא יישור לפני ואחרי MeRIP סביב תעתיק מייצג.
קריאות מיושרות לתעתיק ספציפי בדוגמת הקלט (השורה העליונה) ובשני משכפלי IP (שורה אמצעית ותחתונה). הקופסה השחורה מציגה חלון ארוך מועשר מזוהה של 50 nt המבוסס על MACS243 וניתוחי שיחות שיא של MeRIP-seq22. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

היעד זוג פריימרים רצף מוצרים אורך מוצר
EGFP (EGFP) עבור: 5 '- GGCAACTACAAGACCCGCC -3' GGקאקטאקאקאגאגג'יג'יגה-ג'אג
GTGAAGTTCGGGCGACCCTG
GTGAACCGקטגקטגאגאגג'ק		 72 סיביות לשנייה
Rev: 5'- GCCCTTCTCCTCGATGCGGTT -3'
רנילה לוציפראז עבור: 5'- GGAGAATAACTTCCGTGGAAAC -3' GGאגאטקטקטקטג'יגטגאגא3
אטגטגקאקאקאאאאטקטגה
אגטגאקאקאגאגאטגג'ק		 75 סיביות לשנייה
Rev: 5'- GCTGCAACTCTTCTCTCTCTAA -3'

טבלה 1: מידע על פריימרים ומוצרים שנוצרו עבור ניתוח qRT-PCR.

חיץ מתכונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

RNA נושא יותר ממאה שינויים בסיסיים נפרדים4 היוצרים את האפיטראנפרנודום44. שינויים אלה מוסיפים שכבה נוספת של רגולציה של תרגום ואיתות (נבדק ב5,6,8,20,45,46). מחקרים מוקדמים הצליחו לזהות את נוכחותם של שינויים שלאחר שעתוק על RNA28,47 אבל RNAs שונה ספציפי צריך להיות מזוהה על מנת להבין את התפקיד של אפיטראנודיה. MeRIP תוכנן כשיטה למיפוי אתרי מתילציה RNA תעתיק רחב21,22. זה יכול להיות מותאם לכל שינוי, אם נוגדן ספציפי זמין.

החוזק העיקרי של פרוטוקול זה הוא פשוט יחסית, בטוח עבור RNA והמשתמש (למשל, 5-azaC הוא רעיל מאוד עבור צמחים ובני אדם) ואינו דורש רצף או שינוי מידע אנזים. יתר על כן, העשרת RNAs מתילציה על ידי ה-IP מגדילה את הסיכויים של mRNAs בשפע נמוך להתגלות, בניגוד רצף ביסולפיט שאינו מכיל צעד העשרה. כאשר מבוצעים שני סבבים סדרתיים של MeRIP, העשרה בקטעי RNA המכילים אתרי מתילציה עולה עוד22. אחת המגבלות של MeRIP, במיוחד כאשר מוחל על מחקרי מתילציה mRNA, היא כמות גבוהה של RNA הנדרש כקלט עבור התסמכת. ריבודפלציה – או poly(A) העשרה – צעד יקטין את הרקע שנגרם על ידי RNA ריבוזומלי שונה בכבדות אבל זה מסיר יותר מ 90% של RNA הכולל. DNA חייב גם להיות מוסר לחלוטין כפי שהוא עשיר 5-מתילציה ציטוזינות. חיסרון נוסף הוא הרזולוציה הנמוכה יותר של המיקום המדויק של מתילציה. Sonication של RNA לפני הדגירה עם הנוגדן מסייע לכיוון זה על ידי צמצום האזור המכיל את השינוי 100-200 נוקלאוטידים. כאשר MeRIP משולב עם רצף עמוק, הרזולוציה של חיזוי אתר m5C גדלה ככל שהרצף קורא ליצור התפלגות גאוסיאנית סביב אתר מתילציה פוטנציאלי. בנוסף, יש לאשר את הספציפיות של הנוגדן לפני ההסתעפות (למשל, עם מבחני כתמי נקודה RNA, המבוצעים עם אוליגוס מסונתז עם נוקלאוטידים מותאמים), עם זאת, עד כמה נוגדן יכול למעשה להבחין בין שינויים הקשורים קשר הדוק (למשל, m6A ו m6Am) הוא נקודת ויכוח בתחום48,49. יתר על כן, RNAs מובנה מאוד עלול להפריע האינטראקציה נוגדן אנטיגן, הגבלה נוספת כי הוא התייחס בעיקר עם פיצול דנטורציה של RNA לפני IP. להיפך, רצף ביסולפיט המושפע גם על ידי מבנים משניים, אינו כולל שלב פיצול וזו עשויה להיותסיבהאחת שגורמת לפער בין אתרי m 5 C לבין mRNAs החזויים על ידי רצף ביסולפיט16 ו MeRIP-seq11,17. שינויים אחרים ציטוצין (למשל, hm5C) הם גם עמידים deamination בתיווך ביסולפיט35.

שינויים של MeRIP-seq כוללים שלב הצלבה, או עם כניסתה של ריבונוקלאוסייד פוטואקטיבי (צילום-crosslinking בסיוע m6A-seq, PA-m6A-seq 50)או באמצעות אור UV כדי ליצור נוגדן-RNA crosslinks לאחר ה-IP (miCLIP49, שיטה שונה מאשר miCLIP המתואר במבוא30, אלא גם עם רזולוציה אינדיבידואלית-נוקליאוטיד). בעתיד, וכיוון שהידע על מתילציה של RNA מצטבר, גישות ממוקדות יותר עשויות להיות עדיפות, בהתבסס על האנזימים המשנים ו/או רצפי הקונצנזוס שבהם מופיע מתילציה. זיהוי חלבוני הקורא חיוני להבנת הפונקציה המולקולרית והאותתנית של שינויים שלאחר שעתוק. טכנולוגיית ריצוף Nanopore כבר מאפשר זיהוי ישיר של נוקלאוטידים שונה ללא טיפול מוקדם של RNA17 אבל עדיין יש מקום לשיפור בתחום זה לגבי עומק רצף וניתוח ביואינפורמטי. בסך הכל, MeRIP-seq היא כיום גישה מבוססת, אמינה ובלתי משוחדת לזיהוי תעתיקי RNA מתילציה.

Disclosures

המחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מלגת דוקטורט של IMPRS ל- E.S, מלגת EMBO לטווח ארוך לסמנכ"ל כספים, וקרנות פנימיות של MPI-MPP ל- F.K. חלק מעבודה זו מומנה גם באמצעות PLAMORF, פרויקט שקיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס ' 810131). המחברים מבקשים להודות לפדריקו אפלט על הניתוח הביואינפורמטי וההערות על כתב היד, ומתיו בהין ואמירה קראמדי על הניתוח הביואינפורמטי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microcentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trixl, L., Lusser, A. The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).
  2. Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. Detection and analysis of RNA methylation. F1000Research. 8, 559 (2019).
  3. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, SUPPL 1 195-201 (2011).
  4. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).
  5. Agris, P. F. Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications. EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).
  6. Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).
  7. Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability. RNA. 20 (10), New York, N.Y. 1632-1644 (2014).
  8. Motorin, Y., Helm, M. tRNA Stabilization by Modified Nucleotides. Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).
  9. Shatkin, A. Capping of eucaryotic mRNAs. Cell. 9 (4), 645-653 (1976).
  10. Shen, L., et al. N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).
  11. Cui, X., et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana. Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).
  12. Huber, S. M., et al. Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).
  13. Zuber, H., et al. Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis. Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).
  14. Luo, G. Z., et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nature Communications. 5 (1), 5630 (2014).
  15. Wan, Y., et al. Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana. Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).
  16. David, R., et al. Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs. The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).
  17. Yang, L., et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants. Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).
  18. Sun, L., et al. Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089 (2019).
  19. Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. In search of the mRNA modification landscape in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 421 (2019).
  20. Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants. Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).
  21. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  22. Meyer, K. D., et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and near Stop Codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  23. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS genetics. 9 (6), 1003602 (2013).
  24. Dominissini, D., et al. The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  25. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  26. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).
  27. Wyatt, G. R. Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids. Nature. 166, 237-238 (1950).
  28. Dubin, D. T., Taylor, R. H. The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells. Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).
  29. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).
  30. Hussain, S., et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs. Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).
  31. Khoddami, V., Cairns, B. R. Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases. Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).
  32. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  33. Yang, X., et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).
  34. Burgess, A., David, R., Searle, I. R. Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae. BMC Plant Biology. 15 (1), 199 (2015).
  35. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).
  36. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).
  37. Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific. RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).
  38. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  39. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7 (1), 41114 (2017).
  40. Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics. Nucleic Acids Research. 48 (4), 20 (2020).
  41. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  42. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  43. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  44. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  45. Schwartz, S. Cracking the epitranscriptome. RNA. 22 (2), 169-174 (2016).
  46. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).
  47. Keith, G. Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography. Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).
  48. Feederle, R., Schepers, A. Antibodies specific for nucleic acid modifications. RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).
  49. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  50. Chen, K., et al. High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).

Tags

גנטיקה גיליון 159 מתילציה RNA 5-מתילסיטוצין (m5C) כשל חיסוני (IP) Arabidopsis אפיטראנפרנודיה mRNA רצף RNA

Erratum

Formal Correction: Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis
Posted by JoVE Editors on 05/19/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. The author list was updated.

The author list was updated from:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua

to:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m<sup>5</sup>C שינוי ערבידופסיס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot,… More

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter