Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Metylert RNA immunforebutning analyse for å studere m5C modifikasjon i Arabidopsis

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/61231
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua, 3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Den metylererte RNA immunforekomstanalysen er en antistoffbasert metode som brukes til å berike for metylert RNA-fragmenter. Kombinert med dyp sekvensering, fører det til identifisering av transkripsjoner som bærer m5C modifikasjon.

Abstract

Sekundære basemodifikasjoner på RNA, for eksempel m5C, påvirker strukturen og funksjonen til de modifiserte RNA-molekylene. Metylert RNA Immunoprecipitation and sequencing (MeRIP-seq) er en metode som tar sikte på å berike for metylert RNA og til slutt identifisere modifiserte transkripsjoner. Kort sagt, sonicated RNA inkuberes med et antistoff for 5-metylert cytosiner og utfelles ved hjelp av protein G perler. De berikede fragmentene blir deretter sekvensert, og de potensielle metyleringsstedene tilordnes basert på fordelingen av lysene og toppdeteksjonen. MeRIP kan brukes på enhver organisme, da det ikke krever noen tidligere sekvens eller endring av enzymkunnskap. I tillegg, i tillegg til fragmentering, blir RNA ikke utsatt for noen annen kjemisk eller temperaturbehandling. MeRIP-seq gir imidlertid ikke enkjerners forutsigelse av metyleringsstedet som andre metoder gjør, selv om det metylert området kan begrenses ned til noen få nukleotider. Bruken av ulike modifikasjonsspesifikke antistoffer gjør at MeRIP kan justeres for de forskjellige basemodifikasjonene som finnes på RNA, og utvider mulige anvendelser av denne metoden.

Introduction

I alle tre levekårer gjennomgår RNA-arter etter transkripsjonsmodifikasjoner, og forskning på disse funksjonelt relevante biokjemiske modifikasjonene kalles "epitranscriptomics". Epitranscriptomics er et voksende felt og ulike metoder utvikles for å studere og kartlegge modifikasjoner på RNA molekyler (gjennomgåtti 1,2). Mer enn hundre RNA modifikasjoner har blitt funnet, oppdaget i rRNAs, tRNAs, andre ncRNAs, samt mRNAs3,4. Selv om tilstedeværelsen og funksjonen til kjemisk varierte post-transkripsjonelle modifikasjoner i tRNAs og rRNAs er grundig studert5,6,7,8, bare nylig har mRNA modifikasjoner blitt karakterisert. I planter har mange mRNA modifikasjoner blitt identifisert til dags dato, inkludert m7G på hettenstruktur 9, m1A10, hm5C11,12, og uridylation13. Men bare m6A10,14,15, m5C11,16,17, og pseudouridine18 har blitt kartlagt transkripsjonome-wide i Arabidopsis. Post-transkripsjons mRNA base modifikasjoner er involvert i flere utviklingsprosesser19,20.

En av de mest brukte tilnærmingene i epitranscriptomics er den metylert RNA immunprecipitation kombinert med dyp sekvensering (MeRIP-seq). MeRIP-seq ble utviklet i 2012 for å studere m6A ipattedyrceller 21,22. Det krever bruk av et antistoff for ønsket modifikasjon og tar sikte på å berike for RNA fragmenter som bærer de modifiserte nukleotid(er). Det etterfølges vanligvis av dyp sekvensering for å identifisere og kartlegge de berikede fragmentene eller kvantitative PCR for å verifisere bestemte RNA-mål. Nøyaktigheten av MeRIP er basert på spesifisiteten av antistoffet for å gjenkjenne den modifiserte nukleotid over lignende modifikasjoner (f.eks m5C og hm5C11,23). Foruten m6A, MeRIP-seq har også blitt brukt til studie m1A og m5C RNA metylering i flere organismer11,17,23,24,25.

Metylering av cytosin ved femte karbonposisjon (m5C) er den mest utbredteDNA-modifikasjonen 26,27 og en av de vanligste RNA-modifikasjonene også3,4. Mens m5C ble oppdaget i eukaryotiske mRNAs i 197528, bare nylig har studier fokusert på å kartlegge modifikasjonen transkripsjon-wide, i koding og ikke-koding RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.

Alternative metoder som brukes i m5C RNA forskning inkluderer kjemisk konvertering av ikke-metylert cytosiner til uracils (bisulfite sekvensering) og immunforebygging analyser basert på en irreversibel binding av en kjent RNA cytosin metyltransferase til sine RNA mål (miCLIP, aza-IP). Kort sagt utnytter bisulfittsekvensering funksjonen til 5-metylert cytosin for å være resistent mot natriumbisulfittbehandling som deaminates umodifiserte cytosiner til uracil. Metoden ble først utviklet forDNA,men tilpasset for RNA også, og mange studier har valgt denne tilnærmingen til å oppdage m5C-steder i RNA16,23,29,32,34,35. Både miCLIP og aza-IP krever tidligere kunnskap om RNA cytosinmetyltransferase og bruk av det respektive antistoffet. Ved miCLIP (metylering individuell nukleotid-oppløsning krysskobling og immunoprecipitation), bærer metyltransferase en enkelt aminosyremutasjon slik at den binder seg til RNA-substratet, men kan ikke frigjøres30. I aza-IP (5-azacytidin-mediert RNA immunoprecipitation), den irreversible bindingen er dannet mellom 5-azaC nukleosid og RNA cytosin metyltransferase når eksogent gitt 5-azaC er innlemmet av RNA polymeraser i et mål RNAmolekyl 31.

Den største fordelen med disse tre metodene er at de tillater enkel nukleotid oppløsning kartlegging av m5C. I tillegg gir miCLIP og aza-IP informasjon om de spesifikke målene for en valgt RNA cytosinmetyltransferase, og dechiffrerer dypere mekanismen og rollen til posttranskripsjonelle RNA-modifikasjoner. MeRIP-seq-tilnærmingen kan imidlertid identifisere transkripsjonsområder m5C uten at noen forkunnskap er nødvendig og unngår tøffe kjemiske og temperaturforhold, for eksempel bisulfittbehandling eller inkubasjon med 5-azaC. Både MeRIP og bisulfittsekvensering kan hemmes av sekundære RNA-strukturer36. Fragmenteringstrinnet som inngår i MeRIP-analysen før immunforekomst tar sikte på å lette antistoffbindingen og øke oppløsningen av m5C-identifikasjon.

En annen metode verdt å nevne er massespektrometri (MS) av RNA-nukleosider. MS kan oppdage og skille alle typer modifikasjoner både på DNA og på RNA. Kort sagt, RNA er ekstrahert og DNase fordøyd, deretter desalted og fordøyd til enkelt nukleosider. RNA-nukleosider analyseres av et massespektrometer. Denne metoden kan brukes til å kvantifisere nivåene av hver modifikasjon, og det er ikke avhengig av et antistoff eller en kjemisk konvertering. En stor ulempe er imidlertid at den gir masseinformasjon om tilstedeværelsen av RNA-modifikasjoner. For å kartlegge modifikasjonene må MS kombineres med RNase fordøyelse og sekvenseringsinformasjon om spesifikke RNA-molekyler, som i tilfelle av humant tRNALeu(CAA)37.

Her beskriver og diskuterer vi MeRIP-analysen som brukes til å studere m5C RNA-metylering i Arabidopsis17.

Protocol

1. Klargjøre RNA

  1. Grind 200 mg plantevev til pulver i flytende nitrogen, og pass på at vevet forblir frosset gjennom hele prosedyren.
  2. Trekk ut RNA fra ønsket plantevev etter en syre guanidinium tiocyanat-fenol-kloroform utvinning protokoll. For å redusere muligheten for å forurense RNA med DNA under faseseparasjonen, bruk 1-bromo-3-kloropropan i stedet for kloroform.
    1. Tilsett 1 ml RNA ekstraksjonsreagens som inneholder guanidinthiocyanat og sur fenol til det slipte plantevevet (500 μL per 100 mg vev). Bland godt ved å invertere og sørg for at alt vevet er vått. Inkuber i 10 min ved romtemperatur for å ta avstand fra ribonucleoproteinkompleksene.
    2. Sentrifuge i 10 min ved 12 000 x g ved 4 °C og overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml rør.
    3. Tilsett 200 μL 1-bromo-3-kloropropan (100 μL per 500 μL RNA ekstraksjonsreagens) og virvel kraftig.
    4. Sentrifuge i 15 min ved 12 000 x g ved 4 °C og overfør den øvre vandige fasen (ca. 500 μL) til et nytt 1,5 ml rør.
    5. Tilsett 1 volum isopropanol (500 μL) og 0,1 volum på 3 M natriumacetat pH 5,5 (50 μL), bland godt ved å invertere og utløse 10 min ved -20 °C.
      MERK: Bruk av natriumacetat (NaOAc) anbefales for å øke RNA-nedbøren. Protokollen kan settes på pause på dette punktet ved å forlenge nedbøren av RNA i noen timer eller til og med over natten.
    6. Sentrifuge i 30 min ved 12 000 x g ved 4 °C og kast supernatanten.
    7. Vask pellet to ganger med 500 μL på 80 % EtOH, sentrifuge i 5 min ved 12 000 x g ved 4 °C og kast.
    8. Vask pellet en gang med 500 μL 99% EtOH, sentrifuge i 5 min ved 12 000 x g ved 4 °C og kast.
    9. Tørk pelleten i 5-10 min og oppløs i 30 μL RNase-fri H2O.
      MERK: Bruk i stedet en hvilken som helst RNA-uttrekksprotokoll (f.eks. et kolonnebasert system). Hvis en DNase-fordøyelse er inkludert i protokollen, hopper du over den i følgende trinn (trinn 1.3).
  3. Mål RNA-konsentrasjonen (f.eks. ved bruk av et spektrofotometer) og fordøy 20 μg RNA med DNase.
    MERK: DNA er rik på m5C og antistoffet skiller ikke mellom DNA og RNA.
    1. I en typisk DNase-reaksjon, behandle 10 μg RNA i en 50 μL reaksjon. Bland følgende komponenter og inkuber reaksjonen(e) ved 37 °C i 30 min:
      10 μg RNA x μL
      10x DNase buffer 5 μL
      DNase 1 μL (2 enheter)
      RNase-fri H2O opptil 50 μL
    2. Fjern enzymet enten ved å legge til et passende volum av DNase inaktiveringsreagens (hvis det er inkludert i DNase-settet og i henhold til produsentens instruksjoner) eller ved å utføre et oppryddingstrinn (f.eks. kolonnerensing eller fenol/kloroformekstraksjon).
  4. Kontroller kvaliteten og renheten til den isolerte RNA ved kapillær elektroforese og fortsett hvis RNA-integritetsnummeret (RIN) er høyere enn 7, for å sikre at prøvene er av god kvalitet.
  5. VALGFRITT: Fjern ribosomal RNA for å berike eksemplene i mRNA-innhold ved hjelp av et rRNA-fjerningssett og i henhold til produsentens protokoll.
    1. Bruk DNase behandlet RNA fra forrige trinn for rRNA uttømming reaksjon(er). Utfør flere reaksjoner hvis mengden av total RNA er mer enn det maksimale beløpet som er foreslått for reaksjonen.
    2. Vær oppmerksom på at bare 5-10% av inngangsbeløpet vil bli gjenopprettet etter rRNA uttømming. Fortsett med rRNA utarmet RNA (likt beløp for alle eksempler) og ignorere beløpene som er nevnt i følgende trinn, som de refererer til totalt RNA.
      MERK: For en sammenligning og beskrivelse av tilgjengelige rRNA-uttømmingsmetoder, se referanser 38,39,40. rRNA er den viktigste delen av total RNA og er m5C metylert i mange organismer.
  6. Forbered på forhånd in vitro transkripsjoner (IVT) som skal brukes som kontroll RNA sekvenser og legge dem i prøvene.
    1. Produser to distinkte IVT-er ved hjelp av et in vitro-transkripsjonssett, ett med ikke-metylerte nukleosider og en der rCTP erstattes av henholdsvis 5-metyl-rCTP, for å fungere som negative og positive kontroller i MeRIP. Transkripsjonene utarbeidet var de av EGFP og Renilla luciferase.
      MERK: IVTs bør ikke eksistere i transkripsjonen av organismen du analyserer. Hvis IVT-ene er fra samme mal (f.eks. både EGFP), legger du til den positive og negative kontrollen i to forskjellige eksempler. Hvis sekvensen er forskjellig (f.eks. EGFP og Renilla), kan de legges til samme prøve.
    2. Spike i hver prøve 0,1 ng IVT per 3 μg RNA, som kontroller.
  7. Sonicate RNA til ca 100 nt fragmenter.
    MERK: Betingelsene for RNA-klipping må justeres på forhånd, og de varierer for hver sonicator. For modellen som brukes her, er sonikering utført med følgende forhold: Peak power 174, Duty faktor 10, Sykluser / burst 200, 17 min.
    1. Sonicate samme mengde RNA for alle prøver, minst 12 μg RNA per prøve i 80 μL av totalt volum (min 60 μL, maks 100 μL), fylt opp med RNase-fri H2O.
  8. Bekreft effektiviteten av sonikering og konsentrasjonen av RNA-prøvene ved kapillær elektroforese. Den gjennomsnittlige størrelsen på fragmentert RNA bør være rundt 100 nt.

2. Metylert RNA immunforepning (MeRIP)

  1. I lavbindingsrør, tilsett 9 μg sonikert RNA og RNase-fri H2O opptil 60 μL (eller mer, avhengig av konsentrasjonen).
  2. Dissosier de sekundære strukturene ved å varme opp RNA ved 70 °C i et vannbad i 10 min og kjøle seg ned i ytterligere 10 min i en isvannsblanding.
  3. Del prøven i tre deler: En tredjedel (20 μL, hvis 60 μL ble tatt i trinn 2.1) lagres i et eget rør ved -80 °C som inngangsprøven. Fyll de resterende 40 μL med RNase-fri H2O opp til 860 μL og deretter delt i to lavbindingsrør: en for IP og en for Mock-kontrollen (430 μL hver).
  4. Legg til begge rørene:
    50 μL 10x MeRIP-buffer
    10 μL RNase-hemmer
    10 μL α m5C antistoff (10 μg) i IP-prøven per 10 μL H2O i Mock-prøven
    MERK: Antistoffklonen som ble brukt tidligere, er ikke kommersielt tilgjengelig lenger. Imidlertid bør ethvert anti-5-metylcytosin monoklonalt antistoff fungere på samme måte. Antistoffer bør testes for spesifisitet før de brukes til MeRIP11,23.
  5. Forsegle rørene med parafilm og inkuber i 12-14 timer ved 4 °C, med overhead rotasjon.
  6. Neste dag, forberede proteinet G magnetiske perler for binding.
    1. For hvert rør (enten IP- eller Mock-kontroll), bruk 40 μL perler. Tilsett den totale mengden perler (# av rør x 40 μL, for eksempel for 2 IP- og 2 Mock-prøver er det nødvendig med 160 μL perler) i et 15 ml rør og vask tre ganger med 800 μL 1x MeRIP-buffer per prøve (# av rør x 800 μL buffer, f.eks. 3,2 ml for 2 IP- og 2 Mock-prøver).
    2. Utfør vasker ved romtemperatur i 5 min med overhead rotasjon, samle perlene ved hjelp av et magnetisk stativ og kast vaskebufferen. Etter den tredje vasken, resuspend perlene i samme volum av 1x MeRIP buffer som det første volumet av perler tatt (# av rør x 40 μL, f.eks, 160 μL av 1x MeRIP buffer for 2 IP og 2 Mock prøver).
      MERK: Mengden protein G perler som brukes bestemmes av bindingskapasiteten til perlene for den spesifikke antistofftypen og mengden antistoff som brukes. I dette tilfellet har perlene en bindende kapasitet på ca. 8 μg mus IgG per mg perler og 30 mg / ml konsentrasjon. Derfor er 40 μL nok til å binde ca. 9,6 μg antistoff.
  7. Tilsett 40 μL med gjenbrukte perler til hver IP- og Mock-prøve og inkuber i ytterligere 2 timer ved 4 °C, med overheadrotasjon.
  8. Plasser rørene på et magnetisk stativ i 1 min og kast supernatanten eller lagre det som en kontroll (ikke-bundet RNA-prøve).
  9. Vask perlene 5 ganger ved å bruke i 700 μL 1x MeRIP-buffer levert med 0,01 % Tween 20 og inkuber i 10 min ved romtemperatur med overheadrotasjon.
  10. Resuspend vasket perler i 200 μL proteinase K fordøyelsesbuffer og tilsett 3,5 μL proteinase K. Inkuber i 3 timer ved 50 °C, risting ved 800 o/min. Av og til sveiper du manuelt bunnen av røret hvis et sediment av perler dannes under inkubasjonen.
  11. Trekk ut RNA ved tilsetning av 800 μL RNA ekstraksjonsreagens og etter en syre guanidinium tiocyanat-fenol-kloroform ekstraksjonsprotokoll, og fortsett som i trinn 1.2. For å øke synligheten av RNA pellet, kan en farget co-stupbratt legges i isopropanol på nedbørstrinnet. Bruk pelleten på nytt i 20 μL RNase-fri H2O (eller lik inngangsvolumet som holdes i trinn 2.3).

3. Nedstrøms analyse

  1. Send inn- og IP-eksemplene for enkeltsekvenssekvensering med 50 baser leselengde (SE50).
  2. Trim 3' endeadaptere ved hjelp av cutadapt41 og kast lyder som er kortere enn 48 nt.
  3. Kart trimmet leser til Arabidopsis genom (TAIR10 merknad) ved hjelp av STAR42 med en cutoff på 6% for uoverensstemmelser og maksimal intron størrelse på 10 kb. Hold unikt kartlagte leser for videre analyse.
  4. Identifiser berikede RNA-fragmenter i IP-prøver sammenlignet med Input ved hjelp av to forskjellige metoder og vurder de som finnes betydelig beriket av begge.
    1. Først må du oppdage MeRIP-seq-topper ved hjelp av MACS2 peak caller43 på samlede IPer kontra Inndata.
    2. For det andre, følg analysen for MeRIP-seq peak calling som beskrevet i Meyer et al.22 og Yang et al.17.
      1. Bruk egendefinerte R-skript, del genomet i forskjellige 25 nt vinduer og telle antall unikt tilordnede leser for hvert vindu basert på plasseringen av den siste kartlagte nukleotid (siden leser stammer fra 100 nt RNA fragmenter).
      2. Beregn betydelig berikede vinduer i IP-prøver sammenlignet med Input med Fisher Exact Test. Bruk Benjamini-Hochberg-prosedyren til å korrigere for flere tester.
      3. Hold de betydelig berikede toppene som strekker seg over minst to påfølgende vinduer og kast topper som bare dekker ett vindu.
  5. Identifiser kommenterte områder av genomet (transkripsjoner) med betydelig berikede topper funnet ved begge metodene.
  6. Alternativt eller komplementært kan du teste spesifikke RNA-mål for deres berikelse i IP-prøvene.
    1. Omvendt transkribere RNA (samme volum av Input, IP og Mock prøver) med tilfeldige heksamers.
    2. Utfør kvantitativ sanntids-PCR på de valgte målene, og sammenligne Input, IP og Mock via ΔΔCt-metoden.
      MERK: Det genererte produktet bør ikke være lengre enn 100 bp, da dette er den gjennomsnittlige fragmenteringsstørrelsen.

Representative Results

En skjematisk av metoden er angitt i figur 1. De første kritiske trinnene i protokollen er å få RNA av god kvalitet (RIN ≥ 7) og sonikere den til ca 100 nt fragmenter. Effektiviteten av begge trinnene undersøkes av en chip-basert kapillær elektroforese maskin. I figur 2Avises en representativ kjøring av en god RNA-prøve. Prøven fortynnes 1:10 før den lastes på brikken for å ha en konsentrasjon som er innenfor påvisningsområdet av settet som brukes (5-500 ng /μL). Den samme prøven kjøres også etter sonikering og vises i figur 2B. Legg merke til tilstedeværelsen av en jevn topp forskjøvet til venstre for diagrammet, i en størrelse på rundt 100 nukleotider. Den lavere konsentrasjonen skyldes både tap av RNA under fragmentering, men også på grunn av det økte volumet av prøvene (60-100 μL, trinn 1.7.1).

Kvaliteten på IP- og Mock-prøvene kan evalueres av qRT-PCR. For dette formål tjener de piggede IVTene som positive og negative kontroller: den metylererte IVT, hvor det i alle cytosinposisjoner er m5C, forventes å være svært beriket i IP-prøven; Tvert imot bør ikke-metylert IVT ikke ha en forskjell mellom IP og Mock. Primerne som brukes i qRT-PCR-analysen for de to kontroll-IVTene (EGFP og Renilla luciferase) er oppført i tabell 1. Faktisk, som vist i figur 3,ble rundt 80% av den metylerte IVT gjenopprettet i IP-prøven, og bare ca 2% i Mock. For ikke-metylert kontroll var utvinningen under 1% i både IP- og Mock-prøver. Dette bekrefter effektiviteten til MeRIP som metylert RNA fragmenter ble fremskyndet og beriket, og er en god indikator på at prøvene kan brukes til nedstrøms analyse. I tillegg kan foldberikelsen av det ikke-metylererte IVT -forholdet (IP til Mock-forholdet) brukes som en terskel for å estimere betydningen av berikelse i qRT-PCR-analysene.

Etter å ha justert lysene til genomet (figur 4), brukes toppkallalgoritmene som er beskrevet i trinn 3.4.1 og 3.4.2 for å identifisere de statistisk signifikante vinduene, beriket i IP-prøvene sammenlignet med input. Sekvensene som tilsvarer disse vinduene kan brukes videre, for eksempel for å søke etter bevarte metyleringsrelatertemotiver 11,17.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk representasjon av MeRIP-seq-protokollen.
RNA-prøver inkuberes med et antistoff for 5-metylert cytosiner, og kompleksene trekkes ned med protein G magnetiske perler som fanger antistoffene sammen med den bundne RNA. De eluted RNA-prøvene analyseres ved dyp sekvensering og qRT-PCR. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Representative resultater fra kvalitetsanalyse av RNA-prøver.
(A) Representativ profil for en kvalifisert total RNA plante prøve. (B) Representativ profil av en RNA-prøve etter sonikering til 100 nt fragmenter. Utdatafiler fra kapillær elektroforese programvare. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: qRT-PCR analyse av kontroll IVTs.
Metylert og ikke-metylert in vitro transkripsjoner ble brukt som positive og negative kontroller av MeRIP-analysen. Etter immunforepning er den metylerte IVT høyt beriket i IP-prøven (grønn), men ikke i Mock-prøven (uten anti-m5C antistoff; lilla). Den ikke-metylererte IVT viste ingen berikelse og ingen forskjell mellom IP og Mock. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Les justeringen før og etter MeRIP rundt en representativ transkripsjon.
Leser justert til en bestemt transkripsjon i inndataeksempelet (øverste rad) og i to IP-replikeringer (midtre og nederste rad). Den svarte boksen viser et identifisert beriket 50 nt langt vindu basert på MACS243 og MeRIP-seq22 peak-calling analyser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Målet Primer par Produktsekvens Produktlengde
EGFP For: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3' GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG
GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG
GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC		 72 bp
Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'
Renilla luciferase For: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3' GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC
ATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAA
AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC		 75 bp
Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'

Tabell 1: Informasjon om primere og genererte produkter for qRT-PCR-analysen.

Buffer oppskrifter. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

RNA har mer enn hundre forskjellige basemodifikasjoner4 som danner epitranscriptome44. Disse endringene legger til et ekstra lag med regulering av oversettelse og signalisering (gjennomgåtti 5,6,8,20,45,46). Tidlige studier var i stand til å oppdage tilstedeværelsen av post-transkripsjonelle modifikasjoner på RNA28,47, men de spesifikke modifiserte RNA-ene må identifiseres for å forstå epitranscriptomics rolle. MeRIP ble designet som en metode for å kartlegge RNA metylering nettsteder transkripsjon-wide21,22. Det kan tilpasses enhver modifikasjon, hvis et bestemt antistoff er tilgjengelig.

Hovedstyrken i denne protokollen er at det er relativt enkelt, trygt for RNA og brukeren (f.eks. 5-azaC er svært giftig for planter og mennesker) og krever ikke sekvens eller endring av enzyminformasjon. Videre øker berikelsen av metylert RNA-er av IP sjansene for at lave rike mRNAer oppdages, i motsetning til bisulfittsekvensering som ikke inneholder et berikelsestrinn. Når to serierunder med MeRIP utføres, øker berikelsen i RNA-fragmenter som inneholder metyleringsstederytterligere 22. En av begrensningene i MeRIP, spesielt når det brukes på mRNA metyleringsstudier, er den høye mengden RNA som kreves som inngang for analysen. Ribodepletion – eller poly(A) berikelse – trinnet vil redusere bakgrunnen forårsaket av tungt modifisert ribosomal RNA, men det fjerner mer enn 90% av totalt RNA. DNA må også fjernes helt da det er rikt på 5-metylert cytosiner. En annen ulempe er den lavere oppløsningen av den nøyaktige posisjonen til metylering. Sonikering av RNA før inkubasjon med antistoffet hjelper mot denne retningen ved å begrense regionen som inneholder modifikasjonen til 100-200 nukleotider. Når MeRIP kombineres med dyp sekvensering, øker oppløsningen av m5C-nettstedsforutsigelsen etter hvert som sekvenseringen leser danner en gaussisk fordeling rundt det potensielle metyleringsstedet. I tillegg må spesifisiteten av antistoffet bekreftes før analysen (f.eks. med RNA dot blot-analyser, utført med oligos syntetisert med modifiserte nukleotider), men i hvilken grad et antistoff faktisk kan skille mellom nært beslektede modifikasjoner (f.eks m6A og m6Am) er et argumentpunkt ifeltet 48,49. Videre kan svært strukturerte RNA forstyrre antistoff-antigeninteraksjonen, en annen begrensning som for det meste er adressert med fragmentering og denaturation av RNA før IP. Tvert imot, bisulfite sekvensering som også påvirkes av sekundære strukturer, inkluderer ikke et fragmenteringstrinn, og dette kan være en grunn til at det forårsaker avvik mellom m5C-områdene og mRNAs spådd av bisulfite sekvensering16 og MeRIP-seq11,17. Andre cytosinmodifikasjoner (f.eks. hm5C) er også motstandsdyktige mot bisulfittmediert deamination35.

Modifikasjoner av MeRIP-seq inkluderer et krysskoblingstrinn, enten med innføringen av en fotoaktiv ribonucleoside (foto-crosslinking-assistert m6A-seq, PA-m6A-seq 50) eller bruke UV-lys for å lage antistoff-RNA krysskoblinger etter IP (miCLIP49, annen metode enn miCLIP beskrevet iintroduksjonen 30, men også med individuell nukleotid oppløsning). I fremtiden, og som kunnskap om RNA metylering akkumuleres, mer målrettede tilnærminger kan være å foretrekke, basert på endrende enzymer og / eller konsensus sekvenser der metylering vises. Identifisering av leserproteiner er avgjørende for forståelsen av molekylær og signalfunksjonen til post-transkripsjonelle modifikasjoner. Nanopore sekvenseringsteknologi tillater allerede direkte identifisering av modifiserte nukleotider uten tidligere behandling av RNA17, men det er fortsatt rom for forbedring på dette feltet angående sekvensdybde og bioinformatisk analyse. Samlet sett er MeRIP-seq for tiden en etablert, pålitelig og objektiv tilnærming for å identifisere metylert RNA-transkripsjoner.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et IMPRS PhD-stipend til E.S, et EMBO Long-Term Fellowship til V.P., og MPI-MPP interne midler til F.K. En del av dette arbeidet ble også finansiert gjennom PLAMORF, et prosjekt som har mottatt støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under Den europeiske unions Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram (Grant agreement No. 810131). Forfatterne vil gjerne takke Federico Apelt for den bioinformatiske analysen og kommentarene til manuskriptet, og Mathieu Bahin og Amira Kramdi for den bioinformatiske analysen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microcentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trixl, L., Lusser, A. The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).
  2. Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. Detection and analysis of RNA methylation. F1000Research. 8, 559 (2019).
  3. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, SUPPL 1 195-201 (2011).
  4. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).
  5. Agris, P. F. Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications. EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).
  6. Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).
  7. Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability. RNA. 20 (10), New York, N.Y. 1632-1644 (2014).
  8. Motorin, Y., Helm, M. tRNA Stabilization by Modified Nucleotides. Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).
  9. Shatkin, A. Capping of eucaryotic mRNAs. Cell. 9 (4), 645-653 (1976).
  10. Shen, L., et al. N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).
  11. Cui, X., et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana. Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).
  12. Huber, S. M., et al. Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).
  13. Zuber, H., et al. Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis. Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).
  14. Luo, G. Z., et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nature Communications. 5 (1), 5630 (2014).
  15. Wan, Y., et al. Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana. Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).
  16. David, R., et al. Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs. The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).
  17. Yang, L., et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants. Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).
  18. Sun, L., et al. Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089 (2019).
  19. Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. In search of the mRNA modification landscape in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 421 (2019).
  20. Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants. Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).
  21. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  22. Meyer, K. D., et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and near Stop Codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  23. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS genetics. 9 (6), 1003602 (2013).
  24. Dominissini, D., et al. The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  25. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  26. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).
  27. Wyatt, G. R. Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids. Nature. 166, 237-238 (1950).
  28. Dubin, D. T., Taylor, R. H. The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells. Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).
  29. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).
  30. Hussain, S., et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs. Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).
  31. Khoddami, V., Cairns, B. R. Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases. Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).
  32. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  33. Yang, X., et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).
  34. Burgess, A., David, R., Searle, I. R. Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae. BMC Plant Biology. 15 (1), 199 (2015).
  35. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).
  36. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).
  37. Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific. RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).
  38. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  39. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7 (1), 41114 (2017).
  40. Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics. Nucleic Acids Research. 48 (4), 20 (2020).
  41. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  42. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  43. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  44. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  45. Schwartz, S. Cracking the epitranscriptome. RNA. 22 (2), 169-174 (2016).
  46. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).
  47. Keith, G. Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography. Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).
  48. Feederle, R., Schepers, A. Antibodies specific for nucleic acid modifications. RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).
  49. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  50. Chen, K., et al. High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).

Tags

Genetikk utgave 159 RNA-metylering 5-metylcytosin (m5C) immunforeskemmelse (IP) Arabidopsis epitranscriptomics mRNA RNA sekvensering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis
Posted by JoVE Editors on 05/19/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. The author list was updated.

The author list was updated from:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua

to:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Metylert RNA immunforebutning analyse for å studere m<sup>5</sup>C modifikasjon i Arabidopsis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot,… More

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter