Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Metylerad RNA immunoprecipitation assay att studera m5C modifiering i Arabidopsis

Published: May 14, 2020 doi: 10.3791/61231
Automatic Translation
*1, *2, 3, 1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua, 3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Den metylerade RNA immunoprecipitation assay är en antikroppsbaserad metod som används för att berika för metylerade RNA fragment. Tillsammans med djup sekvensering leder det till identifiering av transkriptioner som bär m5 C-modifieringen.

Abstract

Sekundära basändringar på RNA, såsom m5C, påverkar strukturen och funktionen hos de modifierade RNA-molekylerna. Metylerad RNA immunoprecipitation och sekvensering (MeRIP-seq) är en metod som syftar till att berika för metylerat RNA och slutligen identifiera modifierade transkriptioner. Kort, sonicated RNA inkuberas med en antikropp för 5-metylerade cytosiner och fälls ut med hjälp av protein G pärlor. De berikade fragmenten sekvenseras sedan och de potentiella metyleringsplatserna mappas baserat på fördelningen av läsningar och toppidentifiering. MeRIP kan appliceras på vilken organism som helst, eftersom det inte kräver någon tidigare sekvens eller modifierande enzymkunskap. Dessutom, förutom fragmentering, utsätts RNA inte för någon annan kemisk eller temperaturbehandling. MeRIP-seq ger dock inte enkärnig förutsägelse av metyleringsstället som andra metoder gör, även om det metylerade området kan minskas till några nukleotider. Användningen av olika modifieringsspecifika antikroppar gör det möjligt att justera MeRIP för de olika basändringar som finns på RNA, vilket utökar de möjliga tillämpningarna av denna metod.

Introduction

I alla tre livets riken genomgår RNA-arter post-transkriptionella modifieringar och forskning om dessa funktionellt relevanta biokemiska modifieringar kallas "epitranscriptomics". Epitranscriptomics är ett växande fält och olika metoder utvecklas för att studera och kartlägga modifieringarna på RNA-molekyler (granskasi 1,2). Mer än hundra RNA-modifieringar har hittats, upptäckts i rRNAs, tRNAs, andra ncRNAs, liksom mRNAs3,4. Även om förekomsten och funktionen av kemiskt olika post-transcriptional modifieringar i tRNAs och rRNAs studerasutförligt 5,6,7,8, har bara nyligen mRNA modifieringar karakteriserats. I växter har många mRNA-modifieringar identifierats hittills, inklusive m7G vid locketsstruktur 9,m1A10,hm 5C11,12och uridylation13. Emellertid, endast m6A10,14,15, m5C11,16,17, och pseudouridin18 har kartlagts transkriptom-wide i Arabidopsis. Post-transcriptional mRNA bas modifieringar är involverade i flera utvecklingsprocesser19,20.

En av de vanligaste metoderna inom epitranscriptomics är den metylerade RNA immunoprecipitation i kombination med djup sekvensering (MeRIP-seq). MeRIP-seq utvecklades 2012 för att studera m6A i däggdjursceller21,22. Det kräver användning av en antikropp för önskad modifiering och syftar till att berika för RNA-fragment som bär de modifierade nukleotiderna. Det följs vanligtvis av djup sekvensering för att identifiera och kartlägga de berikade fragmenten eller kvantitativ PCR för att verifiera specifika RNA-mål. Noggrannheten hos MeRIP baseras på antikroppens specificitet för att känna igen den modifierade nukleotid över liknande modifieringar (t.ex. m5C ochhm 5C11,23). Förutom m6A har MeRIP-seq också tillämpats för att studera m1A och m5C RNA metylering i flera organismer11,17,23,24,25.

Metylering av cytosin vid femte kolpositionen (m5C) är den vanligaste DNA-modifieringen26,27 och en av de vanligaste RNA-modifieringarna för3,4. Medan m5C upptäcktes i eukaryota mRNAs 197528, har nyligen studier fokuserat på att kartlägga ändringen transkriptom-wide, i kodning och icke-kodning RNAs11,16,17,23,29,30,31,32,33,34.

Alternativa metoder som används i m5C RNA-forskning inkluderar kemisk omvandling av icke-metylerade cytosin till uraciler (bisulfitsekvensering) och immunoprecipitationsanalyser baserade på en irreversibel bindning av en känd RNA-cytosinmetyltransferas till dess RNA-mål (miCLIP, aza-IP). I korthet utnyttjar bisulfitsekvensering funktionen hos 5-metylerat cytosin för att vara resistent mot natriumbisulfitbehandling som deaminerar oförändrade cytosin till uracil. Metoden utvecklades först för DNA men anpassades för RNA också och många studier har valt detta tillvägagångssätt för att upptäcka m5C platser i RNA16,23,29,32,34,35. Både miCLIP och aza-IP kräver tidigare kunskaper om RNA cytosin metyltransferas och användning av respektive antikropp. När det gäller miCLIP (metylering individuell nukleotidupplösning korslänkning och immunprecipitation) bär metyltransferasen en enda aminosyramutation så att den binder till RNA-substratet men inte kan släppas30. I aza-IP (5-azacytidin-medierad RNA immunprecipitation) bildas den irreversibla bindningen mellan 5-azaC nukleosiden och RNA cytosin metyltransferas när exogent förutsatt 5-azaC införlivas av RNA polymeraser i en mål RNA molekyl31.

Den största fördelen med dessa tre metoder är att de tillåter kartläggning av enstaka nukleotidupplösning på m5C. Dessutom ger miCLIP och aza-IP information om de specifika målen för en utvald RNA cytosin metyltransferas, dechiffrering djupare mekanismen och rollen av post-transkriptionional RNA modifieringar. MeRIP-seq-metoden kan dock identifiera transkriptomomfattande m5C-regioner utan förkunskaper som krävs och undviker hårda kemiska och temperaturförhållanden, såsom bisulfitbehandling eller inkubation med 5-azaC. Både MeRIP- och bisulfitsekvensering kan hämmas av sekundära RNA-strukturer36. Fragmenteringssteget som ingår i MeRIP-analysen före immunprecipitation syftar till att underlätta antikroppsbindning och öka upplösningen av m5C-identifiering.

En annan metod som är värd att nämna är masspektrometri (MS) av RNA-kärnor. MS kan upptäcka och urskilja alla typer av modifieringar både på DNA och på RNA. Kort extraheras RNA och DNase smälts, sedan avsaltas och smälts till enstaka nukleossidor. RNA-kärnorna analyseras av en masspektrometer. Denna metod kan användas för att kvantifiera nivåerna för varje modifiering och den förlitar sig inte på en antikropp eller en kemisk omvandling. En stor nackdel är dock att det ger bulkinformation om förekomsten av RNA-modifieringar. För att kartlägga ändringarna måste MS kombineras med RNase-matsmältning och sekvenseringsinformation om specifika RNA-molekyler, som i fallet med human tRNALeu(CAA)37.

Här beskriver och diskuterar vi MeRIP-analysen som används för att studera m5C RNA metylering i Arabidopsis17.

Protocol

1. Förbereda RNA

  1. Mala 200 mg växtvävnad till pulver i flytande kväve och se till att vävnaden förblir frusen under hela proceduren.
  2. Extrahera RNA från önskad växtvävnad efter ett syra guanidinium tiocyanat-fenol-kloroform extraktionsprotokoll. För att minska möjligheten att förorena RNA med DNA under fasseparationen, använd 1-bromo-3-klorpropan istället för kloroform.
    1. Tillsätt 1 ml RNA-extraktionsreagens som innehåller guanidintiocyanat och sur fenol till den slipade växtvävnaden (500 μL per 100 mg vävnad). Blanda väl genom att vända och se till att all vävnad är våt. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur för att skilja ribonukleoproteinkomplexen åt.
    2. Centrifug i 10 min vid 12 000 x g vid 4 °C och överför supernaten till ett nytt 1,5 ml-rör.
    3. Tillsätt 200 μL 1-bromo-3-klorpropan (100 μL per 500 μL RNA-extraktionsreagens) och virvel kraftigt.
    4. Centrifug i 15 min vid 12 000 x g vid 4 °C och överför den övre vattenfasen (ca 500 μL) till ett nytt 1,5 ml-rör.
    5. Tillsätt 1 volym isopropanol (500 μL) och 0,1 volym 3 M natriumacetat pH 5,5 (50 μL), blanda väl genom att invertera och fälla ut 10 min vid -20 °C.
      OBS: Användning av natriumacetat (NaOAc) rekommenderas för att förbättra RNA-utfällningen. Protokollet kan pausas vid denna tidpunkt genom att förlänga nederbörden av RNA i några timmar eller till och med över natten.
    6. Centrifug i 30 min vid 12 000 x g vid 4 °C och kassera supernaten.
    7. Tvätta pelleten två gånger med 500 μL 80% EtOH, centrifug i 5 min vid 12 000 x g vid 4 °C och kassera.
    8. Tvätta pelleten en gång med 500 μL 99% EtOH, centrifug i 5 min vid 12 000 x g vid 4 °C och kassera.
    9. Torka pelleten i 5-10 min och lös upp i 30 μL RNase-fritt H2O.
      OBS: Använd istället val av val av RNA-extraktionsprotokoll (t.ex. ett kolumnbaserat system). Om en DNase-matsmältning ingår i protokollet hoppar du över det i följande steg (steg 1.3).
  3. Mät RNA-koncentrationen (t.ex. med hjälp av en spektrofotometer) och smält 20 μg RNA med DNase.
    OBS: DNA är rikt på m5C och antikroppen skiljer inte mellan DNA och RNA.
    1. I en typisk DNase-reaktion, behandla 10 μg RNA i en 50 μL-reaktion. Blanda följande komponenter och inkubera reaktionen/reaktionerna vid 37 °C i 30 min:
      10 μg RNA x μL
      10x DNase buffert 5 μL
      DNase 1 μL (2 enheter)
      RNase-fritt H2O upp till 50 μL
    2. Avlägsna enzymet antingen genom att tillsätta en lämplig volym DNase inaktiveringsreagens (om det ingår i DNase-satsen och enligt tillverkarens instruktioner) eller genom att utföra ett rengöringssteg (t.ex. kolonnrening eller fenol/kloroformextraktion).
  4. Kontrollera kvaliteten och renheten hos det isolerade RNA med kapillärelektrofores och fortsätt om RNA-integritetsnumret (RIN) är högre än 7, för att säkerställa att proverna är av god kvalitet.
  5. VALFRITT: Ta bort ribosomala RNA för att berika proverna i mRNA-innehåll med hjälp av ett rRNA-borttagningskit och enligt tillverkarens protokoll.
    1. Använd det DNase-behandlade RNA från föregående steg för rRNA-utarmningsreaktionerna. Utför flera reaktioner om mängden totalt RNA är mer än den maximala mängd som föreslås för reaktionen.
    2. Observera att endast 5-10% av ingångsmängden kommer att återställas efter rRNA-utarmning. Fortsätt med rRNA utarmat RNA (lika mycket för alla prover) och ignorera de mängder som nämns i följande steg, eftersom de hänvisar till totalt RNA.
      OBS: För en jämförelse och beskrivning av tillgängliga rRNA utarmningsmetoder se referenser 38,39,40. rRNA är den största delen av totalt RNA och är m5C metylerat i många organismer.
  6. Förbered i förväg in vitro-transkriptioner (IVT) som ska användas som kontroll RNA-sekvenser och lägg till dem i proverna.
    1. Producera två distinkta IVT med hjälp av ett in vitro-transkriptionskit, ett med icke-metylerade nukleoser och ett där rCTP ersätts med 5-metyl-rCTP, för att fungera som negativa respektive positiva kontroller i MeRIP. De avskrifter som utarbetades var EGFP:s och Renilla luciferases.
      OBS: IVTs bör inte finnas i transkriptomen av den organism du analyserar. Om IVT:erna kommer från samma mall (t.ex. både EGFP) lägger du till den positiva och negativa kontrollen i två olika prover. Om deras sekvens är annorlunda (t.ex. EGFP och Renilla) kan de läggas till i samma prov.
    2. Spika i varje prov 0,1 ng IVT per 3 μg RNA, som kontroller.
  7. Sonicate RNAen till ungefärligt 100 nt fragment.
    OBS: Förutsättningarna för RNA-skevning måste justeras i förväg och de skiljer sig åt för varje ljuddator. För den modell som används här utförs ultraljudsbehandling med följande villkor: Toppeffekt 174, Arbetsfaktor 10, Cykler/burst 200, 17 min.
    1. Sonicate samma mängd RNA för alla prover, minst 12 μg RNA per prov i 80 μL av total volym (min 60 μL, max 100 μL), fylld med RNase-fri H2O.
  8. Bekräfta effektiviteten av ultraljudsbehandling och koncentrationen av RNA prover av kapillär elektrofores. Den genomsnittliga storleken på fragmenterat RNA bör vara cirka 100 nt.

2. Metylerad RNA-immunprecipitation (MeRIP)

  1. I lågbindande rör, tillsätt 9 μg sonikerat RNA och RNase-fritt H2O upp till 60 μL (eller mer, beroende på koncentrationen).
  2. Dissociera de sekundära strukturerna genom att värma RNA vid 70 °C i ett vattenbad i 10 minuter och kyla ner i ytterligare 10 minuter i en isvattenblandning.
  3. Dela provet i tre delar: en tredjedel (20 μL, om 60 μL togs i steg 2.1) sparas i ett separat rör vid -80 °C som ingångsprov. Fyll de återstående 40 μL med RNase-fria H2O upp till 860 μL och dela sedan i två lågbindande rör: ett för IP och ett för Mock-kontrollen (430 μL vardera).
  4. Lägg till i båda rören:
    50 μL 10x MeRIP-buffert
    10 μL RNase-hämmare
    10 μL α m5C antikropp (10 μg) i IP-provet per 10 μL H2O i mockprovet
    OBS: Antikroppsklonen som användes tidigare är inte längre kommersiellt tillgänglig. Alla anti-5-metylcytosin monoklonala antikroppar bör dock fungera på samma sätt. Antikroppar ska testas med särskildhet innan de används för MeRIP11,23.
  5. Försegla rören med parafilm och inkubera i 12-14 timmar vid 4 °C, med överliggande rotation.
  6. Nästa dag, förbered proteinet G magnetiska pärlor för bindning.
    1. För varje rör (antingen IP- eller Mock-kontroll), använd 40 μL pärlor. Tillsätt den totala mängden pärlor (# av rör x 40 μL, T.ex. för 2 IP- och 2 Mock-prover behövs 160 μL pärlor) i ett 15 ml-rör och tvättas tre gånger med 800 μL 1x MeRIP-buffert per prov (# av rör x 800 μL-buffert, t.ex. 3,2 ml för 2 IP- och 2 Mock-prover).
    2. Utför tvättar vid rumstemperatur i 5 minuter med överliggande rotation, samla pärlor med hjälp av ett magnetiskt rack och kassera tvättbufferten. Efter den tredje tvätten återanvände pärlorna i samma volym av 1x MeRIP-buffert som den ursprungliga volymen pärlor som tagits (# av rör x 40 μL, t.ex. 160 μL 1x MeRIP-buffert för 2 IP- och 2 Mock-prover).
      OBS: Mängden protein G-pärlor som används bestäms av bindningskapaciteten hos pärlorna för den specifika antikroppstypen och mängden antikropp som används. I detta fall har pärlorna en bindningskapacitet på ca 8 μg mus IgG per mg pärlor och 30 mg/ml koncentration. Därför är 40 μL tillräckligt för att binda ca 9,6 μg antikropp.
  7. Tillsätt 40 μL återanvända pärlor till varje IP- och Mock-prov och inkubera i ytterligare 2 timmar vid 4 °C, med överliggande rotation.
  8. Placera rören på ett magnetiskt rack i 1 minut och kassera supernaten eller spara den som en kontroll (icke-bundet RNA-prov).
  9. Tvätta pärlorna 5 gånger genom att återanvända i 700 μL 1x MeRIP-buffert som levereras med 0,01% interpolering 20 och inkubera i 10 min vid rumstemperatur med överliggande rotation.
  10. Återanvänd de tvättade pärlorna i 200 μL proteinas K-rötningsbuffert och tillsätt 3,5 μL proteinas K. Inkubera i 3 timmar vid 50 °C och skaka vid 800 varv/min. Snärta ibland manuellt i botten av röret om ett sediment av pärlor bildas under inkubationen.
  11. Extrahera RNA genom tillsats av 800 μL RNA-extraktionsreagens och efter ett syra guanidinium tiocyanat-fenol-kloroform extraktionsprotokoll och fortsätt som i steg 1. För att öka synligheten av RNA-pelleten kan en färgad co-fällningsmedel tillsättas i isopropanol vid utfällningssteget. Återanvänd pelleten i 20 μL RNase-fritt H2O (eller lika med ingångsvolymen i steg 2.3).

3. Analys nedströms

  1. Skicka in- och IP-proverna för enkelslutssekvensering med 50 baser läslängd (SE50).
  2. Trimma 3' ändadaptrar med cutadapt41 och kassera läsningar som är kortare än 48 nt.
  3. Kartan trimmad läser till Arabidopsis genom (TAIR10-anteckning) med STAR42 med en cutoff på 6% för missmatchningar och maximal intronstorlek på 10 kb. Håll unikt mappade läsningar för vidare analys.
  4. Identifiera berikade RNA-fragment i IP-prover jämfört med Input med två distinkta metoder och beakta de som finns avsevärt berikade av båda.
    1. Identifiera först MeRIP-seq-toppar med MACS2 peak caller43 på poolade IPs kontra Input.
    2. För det andra, följ analysen för MeRIP-seq peak calling som beskrivs i Meyer et al.22 och Yang et al.17.
      1. Med hjälp av anpassade R-skript delar du upp genomet i distinkta 25 nt-fönster och räknar antalet unikt mappade läsningar för varje fönster baserat på positionen för den senast kartlagda nukleotid (eftersom läsningarna härstammar från 100 nt RNA-fragment).
      2. Beräkna betydligt berikade fönster i IP-prover jämfört med Input med Fisher Exact Test. Använd Benjamini-Hochberg-proceduren för att korrigera för flera tester.
      3. Håll de betydligt berikade topparna som sträcker sig över minst två på varandra följande fönster och kassera toppar som bara täcker ett fönster.
  5. Identifiera kommenterade regioner i genomet (transkriptioner) med betydligt berikade toppar som finns med båda metoderna.
  6. Alternativt eller komplettera, testa specifika RNA-mål för deras berikning i IP-proverna.
    1. Omvänd transkribera RNA (samma volym av indata-, IP- och mockprover) med slumpmässiga hexamerer.
    2. Utför kvantitativ pcr i realtid på de valda målen och jämför Input, IP och Mock via ΔΔCt-metoden.
      OBS: Den genererade produkten bör inte vara längre än 100 bp, eftersom detta är den genomsnittliga fragmenteringsstorleken.

Representative Results

En schematisk metod anges i figur 1. De första kritiska stegen i protokollet är att erhålla RNA av god kvalitet (RIN ≥ 7) och soniska det till cirka 100 nt fragment. Effektiviteten hos båda stegen undersöks av en spånbaserad kapillärelektroforesmaskin. I figur 2Avisas en representativ körning av ett bra RNA-prov. Provet späds ut 1:10 innan det lastas på chipet för att ha en koncentration som ligger inom detektionsområdet för det använda satsen (5-500 ng/μL). Samma prov körs också efter ultraljudsbehandling och visas i figur 2B. Observera närvaron av en enhetlig topp som flyttas till vänster om diagrammet, med en storlek på cirka 100 nukleotider. Den lägre koncentrationen orsakas både av förlust av RNA under fragmentering men också på grund av den ökade volymen av proverna (60-100 μL, steg 1.7.1).

Kvaliteten på IP- och Mock-exemplen kan utvärderas av qRT-PCR. I detta syfte fungerar de spikade IVTs som positiva och negativa kontroller: metylerad IVT, där det i alla cytosinpositioner finns m5C, förväntas vara mycket berikat i IP-provet; Tvärtom bör den icke-metylerade IVT inte ha någon skillnad mellan IP och Mock. De primers som används i qRT-PCR-analysen för de två kontroll-IVTs(EGFP och Renilla luciferase) anges i tabell 1. Som framgår av figur 3återfanns omkring 80 % av den metylerade IVT:et i IP-provet och endast cirka 2 % i mock. För den icke-metylerade kontrollen var återställningen under 1% i både IP- och Mock-prover. Detta verifierar effektiviteten hos MeRIP att metylerade RNA-fragment fälldes ut och berikades, och är en bra indikator på att proverna kan användas för nedströmsanalys. Dessutom kan vikberikningen av icke-metylerad IVT (IP-till-mock-förhållande) tillämpas som ett tröskelvärde för att uppskatta betydelsen av berikning i qRT-PCR-analyserna.

Efter att läsningarna justerats till genomet (figur 4) tillämpas de algoritmer för toppanrop som beskrivs i steg 3.4.1 och 3.4.2 för att identifiera de statistiskt signifikanta fönstren, berikade i IP-proverna jämfört med indata. De sekvenser som motsvarar dessa fönster kan användas ytterligare, till exempel för att söka efter bevarade metyleringsrelaterade motiv11,17.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av MeRIP-seq-protokollet.
RNA-prover inkuberas med en antikropp för 5-metylerade cytosiner och komplexen dras ner med protein G magnetiska pärlor som fångar antikropparna tillsammans med det bundna RNA. De eluterade RNA-proverna analyseras genom djup sekvensering och qRT-PCR. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Representativa resultat från kvalitetsanalys av RNA-prover.
A)Representativ profil för ett kvalificerat totalt RNA-växtprov. B)Representativ profil för ett RNA-prov efter ultraljudsbehandling till 100 nt fragment. Utgångsfiler från kapillärelektrofores programvara. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: qRT-PCR-analys av kontroll-IVT.
Metylerade och icke-metylerade in vitro-transkriptioner användes som positiva respektive negativa kontroller av MeRIP-analysen. Efter immunprecipitation är den metylerade IVT mycket berikad i IP-provet (grönt) men inte i Mock-provet (utan anti-m5C-antikroppar; lila). Den icke-metylerade IVT visade ingen berikning och ingen skillnad mellan IP och Mock. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Bild 4: Läs justering före och efter MeRIP runt en representativ transkription.
Läser justerad mot en specifik transkription i indata exemplet (översta raden) och i två IP-replikat (mitten och den nedre raden). Den svarta rutan visar ett identifierat berikat 50 nt långt fönster baserat på MACS243 och MeRIP-seq22 peak-calling analyser. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Mål Primer par Produktsekvens Produktens längd
EGFP För: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3' GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG (OLIKA)
GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG
GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC		 72 bp
Rev: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'
Renilla luciferase (njure luciferase) För: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3' GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC (OLIKA BETYDELSER)
ATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAA
AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC		 75 bp
Rev: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAAA -3'

Tabell 1: Information om primers och genererade produkter för qRT-PCR-analysen.

Buffert recept. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

RNA bär mer än hundra distinkta basändringar4 som bildar epitranscriptome44. Dessa ändringar lägger till ytterligare ett lager av reglering av översättning och signalering (granskasi 5,6,8,20,45,46). Tidiga studier kunde upptäcka förekomsten av post-transcriptional modifieringar på RNA28,47 mende specifika modifierade RNAs måste identifieras för att förstå rollen av epitranscriptomics. MeRIP utformades som en metod för att kartlägga RNA metyleringsplatser transcriptome-wide21,22. Det kan anpassas till alla modifieringar, om en specifik antikropp finns tillgänglig.

Den huvudsakliga styrkan i detta protokoll är att det är relativt enkelt, säkert för RNA och användaren (t.ex. 5-azaC är mycket giftigt för växter och människor) och kräver inte sekvens- eller ändring av enzyminformation. Dessutom ökar berikningen av metylerade RNAs genom undersökningsperioden risken för att låga rikliga mRNAs upptäcks, till skillnad från bisulfitsekvensering som inte innehåller ett anrikningssteg. När två seriella rundor av MeRIP utförs ökar anrikningen i RNA-fragment som innehåller metyleringsplatser ytterligare22. En av begränsningarna i MeRIP, särskilt när den tillämpas på mRNA-metyleringsstudier, är den höga mängden RNA som krävs som insats för analysen. Ribodepletionen – eller poly(A) anrikning – steget kommer att minska bakgrunden som orsakas av det kraftigt modifierade ribosomala RNA men det tar bort mer än 90% av det totala RNA. DNA måste också avlägsnas helt eftersom det är rikt på 5-metylerade cytosiner. En annan nackdel är den lägre upplösningen av metyleringens exakta position. Ultraljudsbehandling av RNA före inkubation med antikroppen hjälper mot denna riktning genom att begränsa regionen som innehåller modifieringen till 100-200 nukleotider. När MeRIP kombineras med djup sekvensering ökar upplösningen av m5C-webbplatsförutsägelsen när sekvenseringsläsningarna bildar en gaussisk fördelning runt den potentiella metyleringsplatsen. Dessutom måste antikroppens specificitet bekräftas före analysen (t.ex. med RNA dot blot-analyser, utförda med oligos syntetiserade med modifierade nukleotider), men i vilken utsträckning en antikropp faktiskt kan skilja mellan närbesläktade modifieringar (t.ex. m6A och m6Am) är en argumentation ifält 48,49. Dessutom kan högstrukturerade RNAs störa antikropp-antigen interaktionen, en annan begränsning som främst behandlas med fragmentering och denaturation av RNA före IP. Tvärtom innehåller bisulfitsekvensering som också påverkas av sekundära strukturer inte ett fragmenteringssteg och detta kan vara en anledning som orsakar diskrepans mellan m5C-platserna och mRNAs som förutspås av bisulfitsekvensering16 och MeRIP-sekvens11,17. Andra cytosinmodifieringar (t.ex. hm5C) är också resistenta mot bisulfitmedierad deamination35.

Ändringar av MeRIP-seq inkluderar ett korslänkningssteg, antingen med införandet av en fotoaktiv ribonukleoside (fotokorslänkningsassisterad m6A-seq, PA-m6A-seq 50) eller med UV-ljus för att skapa antikropps-RNA-korslänkar efter IP (miCLIP49, annan metod än miCLIP som beskrivs i introduktion30, men också med individuell nukleotidupplösning). I framtiden, och när kunskap om RNA-metylering ackumuleras, kan mer riktade metoder vara att föredra, baserat på de modifierande enzymerna och/eller konsensussekvenserna där metylering uppträder. Identifiering av läsarproteiner är avgörande för förståelsen av den molekylära och signalerande funktionen hos post-transkriptionella modifieringar. Nanoporsekvenseringsteknik möjliggör redan direkt identifiering av modifierade nukleotider utan föregående behandling av RNA17, men det finns fortfarande utrymme för förbättringar på detta område när det gäller sekvensdjup och bioinformatisk analys. Sammantaget är MeRIP-seq för närvarande ett etablerat, tillförlitligt och opartiskt tillvägagångssätt för att identifiera metylerade RNA-transkriptioner.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av ett IMPRS-doktorandstipendium till E.S, ett EMBO Long-Term Fellowship to V.P., och MPI-MPP interna medel till F.K. En del av detta arbete finansierades också genom PLAMORF, ett projekt som har fått finansiering från Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 810131). Författarna vill tacka Federico Apelt för den bioinformatiska analysen och kommentarerna till manuskriptet, och Mathieu Bahin och Amira Kramdi för den bioinformatiska analysen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-m5C antibody ZymoResearch A3001 (discontinued), A3002 available Clone 10G4 (discontinued), 7D21 available
Chip and reagents for capillary electrophoresis Agilent 5067-1511 RNA 6000 Nano kit
Dnase Ambion AM1907 TURBO DNA-free kit
Co-precipitant of nucleic acids Ambion AM9515 Glycoblue, 15 mg/mL
In vitro transcription kit Promega P1300 T7 RiboMAX Large Scale RNA Production System
Low-binding reaction tubes Kisker Biotech G017 1.7 ml microcentrifuge tubes
Protein G magnetic beads Invitrogen 10003D Dynabeads Protein G
Proteinase K Ambion AM2546 20mg/mL stock solution, RNA grade
RNase inhibitor Promega N2615 RNasin Plus 40 U/μl
rRNA removal kit Epicentre RZPL11016 Ribo-Zero rRNA removal kit (Plant leaf)
Sonication tubes Covaris 520045 microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm
RNA extraction reagent Ambion 15596018 TRIzol reagent
Equipment
Capillary electrophoresis machine Agilent G2939BA 2100 Bioanalyzer System
Magnetic rack Invitrogen 12321D DynaMag-2
Microcentrifuge Eppendorf discontinued 5417R model
Rotator Benchmark R4040 RotoBot Mini
Sonicator Covaris 500217 S220 Focused-ultrasonicator
Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-ONEC-W NanoDrop OneC
Waterbath GFL 1012 1012 Incubation bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trixl, L., Lusser, A. The dynamic RNA modification 5-methylcytosine and its emerging role as an epitranscriptomic mark. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (1), 1-17 (2019).
  2. Mongan, N. P., Emes, R. D., Archer, N. Detection and analysis of RNA methylation. F1000Research. 8, 559 (2019).
  3. Cantara, W. A., et al. The RNA modification database, RNAMDB: 2011 update. Nucleic Acids Research. 39, SUPPL 1 195-201 (2011).
  4. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 303-307 (2018).
  5. Agris, P. F. Bringing order to translation: the contributions of transfer RNA anticodon-domain modifications. EMBO reports. 9 (7), 629-635 (2008).
  6. Chow, C. S., Lamichhane, T. N., Mahto, S. K. Expanding the Nucleotide Repertoire of the Ribosome with Post-Transcriptional Modifications. ACS Chemical Biology. 2 (9), 610-619 (2007).
  7. Gigova, A., Duggimpudi, S., Pollex, T., Schaefer, M., Koš, M. A cluster of methylations in the domain IV of 25S rRNA is required for ribosome stability. RNA. 20 (10), New York, N.Y. 1632-1644 (2014).
  8. Motorin, Y., Helm, M. tRNA Stabilization by Modified Nucleotides. Biochemistry. 49 (24), 4934-4944 (2010).
  9. Shatkin, A. Capping of eucaryotic mRNAs. Cell. 9 (4), 645-653 (1976).
  10. Shen, L., et al. N 6 -Methyladenosine RNA Modification Regulates Shoot Stem Cell Fate in Arabidopsis. Developmental Cell. 38 (2), 186-200 (2016).
  11. Cui, X., et al. 5-Methylcytosine RNA Methylation in Arabidopsis Thaliana. Molecular Plant. 10 (11), 1387-1399 (2017).
  12. Huber, S. M., et al. Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. ChemBioChem. 16 (5), 752-755 (2015).
  13. Zuber, H., et al. Uridylation and PABP Cooperate to Repair mRNA Deadenylated Ends in Arabidopsis. Cell Reports. 14 (11), 2707-2717 (2016).
  14. Luo, G. Z., et al. Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana. Nature Communications. 5 (1), 5630 (2014).
  15. Wan, Y., et al. Transcriptome-wide high-throughput deep m6A-seq reveals unique differential m6A methylation patterns between three organs in Arabidopsis thaliana. Genome Biology. 16 (1), 1-26 (2015).
  16. David, R., et al. Transcriptome-Wide Mapping of RNA 5-Methylcytosine in Arabidopsis mRNAs and Noncoding RNAs. The Plant Cell. 29 (3), 445-460 (2017).
  17. Yang, L., et al. m5C Methylation Guides Systemic Transport of Messenger RNA over Graft Junctions in Plants. Current Biology. 29 (15), 2465-2476 (2019).
  18. Sun, L., et al. Transcriptome-wide analysis of pseudouridylation of mRNA and non-coding RNAs in Arabidopsis. Journal of Experimental Botany. 70 (19), 5089 (2019).
  19. Chmielowska-Bąk, J., Arasimowicz-Jelonek, M., Deckert, J. In search of the mRNA modification landscape in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 421 (2019).
  20. Liang, Z., Riaz, A., Chachar, S., Ding, Y., Du, H., Gu, X. Epigenetic Modifications of mRNA and DNA in Plants. Molecular Plant. 13 (1), 14-30 (2020).
  21. Dominissini, D., et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature. 485 (7397), 201-206 (2012).
  22. Meyer, K. D., et al. Comprehensive Analysis of mRNA Methylation Reveals Enrichment in 3' UTRs and near Stop Codons. Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).
  23. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m5C within archaeal mRNAs. PLoS genetics. 9 (6), 1003602 (2013).
  24. Dominissini, D., et al. The dynamic N1-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).
  25. Li, X., et al. Transcriptome-wide mapping reveals reversible and dynamic N1-methyladenosine methylome. Nature Chemical Biology. 12 (5), 311-316 (2016).
  26. Hotchkiss, R. D. The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography. Journal of Biological Chemistry. 175 (175), 315-332 (1948).
  27. Wyatt, G. R. Occurence of 5-Methyl-Cytosine in Nucleic Acids. Nature. 166, 237-238 (1950).
  28. Dubin, D. T., Taylor, R. H. The methylation state of poly A-containing- messenger RNA from cultured hamster cells. Nucleic Acids Research. 2 (10), 1653-1668 (1975).
  29. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1-16 (2017).
  30. Hussain, S., et al. NSun2-mediated cytosine-5 methylation of vault noncoding RNA determines its processing into regulatory small RNAs. Cell Reports. 4 (2), 255-261 (2013).
  31. Khoddami, V., Cairns, B. R. Identification of direct targets and modified bases of RNA cytosine methyltransferases. Nature biotechnology. 31 (5), 458-464 (2013).
  32. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  33. Yang, X., et al. 5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27 (5), 606-625 (2017).
  34. Burgess, A., David, R., Searle, I. R. Conservation of tRNA and rRNA 5-methylcytosine in the kingdom Plantae. BMC Plant Biology. 15 (1), 199 (2015).
  35. Schaefer, M., Pollex, T., Hanna, K., Lyko, F. RNA cytosine methylation analysis by bisulfite sequencing. Nucleic Acids Research. 37 (2), (2009).
  36. Weber, M., et al. Chromosome-wide and promoter-specific analyses identify sites of differential DNA methylation in normal and transformed human cells. Nature Genetics. 37 (8), 853-862 (2005).
  37. Auxilien, S., Guérineau, V., Szweykowska-Kulińska, Z., Golinelli-Pimpaneau, B. The human tRNA m (5) C methyltransferase Misu is multisite-specific. RNA Biology. 9 (5), 1331-1338 (2012).
  38. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  39. Petrova, O. E., Garcia-Alcalde, F., Zampaloni, C., Sauer, K. Comparative evaluation of rRNA depletion procedures for the improved analysis of bacterial biofilm and mixed pathogen culture transcriptomes. Scientific Reports. 7 (1), 41114 (2017).
  40. Huang, Y., Sheth, R. U., Kaufman, A., Wang, H. H. Scalable and cost-effective ribonuclease-based rRNA depletion for transcriptomics. Nucleic Acids Research. 48 (4), 20 (2020).
  41. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  42. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  43. Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137 (2008).
  44. Saletore, Y., et al. The birth of the Epitranscriptome: deciphering the function of RNA modifications. Genome Biology. 13 (10), 175 (2012).
  45. Schwartz, S. Cracking the epitranscriptome. RNA. 22 (2), 169-174 (2016).
  46. Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 31-42 (2016).
  47. Keith, G. Mobilities of modified ribonucleotides on two-dimensional cellulose thin-layer chromatography. Biochimie. 77 (1-2), 142-144 (1995).
  48. Feederle, R., Schepers, A. Antibodies specific for nucleic acid modifications. RNA Biology. 14 (9), 1089-1098 (2017).
  49. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  50. Chen, K., et al. High-Resolution N 6 -Methyladenosine (m 6 A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m 6 A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).

Tags

Genetik utgåva 159 RNA-metylering 5-metylcytosin (m5C) immunprecipitation (IP) Arabidopsis epitranscriptomics mRNA RNA-sekvensering

Erratum

Formal Correction: Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis
Posted by JoVE Editors on 05/19/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. The author list was updated.

The author list was updated from:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua

to:

Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
3Biologie de l'Ecole Normale Supérieure (IBENS), Paris, France

Metylerad RNA immunoprecipitation assay att studera m<sup>5</sup>C modifiering i Arabidopsis
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot,… More

Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. J. Vis. Exp. (159), e61231, doi:10.3791/61231 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter