Summary
Beskrivet är en tids- och utrymmesbesparande metod för att räkna ägg och bestämma kläckningshastigheter för enskilda myggor med hjälp av 24 brunnsvävnadskulturplattor, vilket avsevärt kan öka omfattningen och hastigheten på fecundity och fertilitetsanalyser.
Abstract
Myggor utgör ett betydande folkhälsoproblem som vektorer av olika patogener. För de studier som kräver en bedömning av parametrar för myggkondition, särskilt äggproduktion och kläckningshastigheter på individnivå, har konventionella metoder lagt en betydande börda på utredarna på grund av hög arbetsintensitet och laboratorieutrymmeskrav. Beskrivet är en enkel metod med 24 brunnsvävnadskulturplatta med agarosa i varje brunn och digital avbildning av varje brunn för att bestämma äggnummer och kläckhastigheter på individnivå med väsentligt reducerade tids- och utrymmeskrav.
Introduction
Kontroll av myggor för att skydda människor från vektorburna patogener är ett viktigt folkhälsomål, främst på grund av bristen på effektiva vacciner för de flesta patogener som bärs av myggor. Många studier syftar till att minska myggans kondition i samband med en fält tillämplig befolkningsminskningsstrategi1,2,3. Detta inkluderar omfattande studier för att skapa transgena myggor och / eller CRISPR / Cas9 knockout linjer. Sådana metoder för befolkningsförändringar kräver en detaljerad bedömning av individuella parametrar för ändamålsenligitet4. Konventionella laboratorietekniker för att bedöma kvinnliga myggors kondition inkluderar individuell inneslutning av parade, blodmatade kvinnliga myggor i 100 ml behållare5, modifierade 50 ml koniska rör eller rör för Drosophila-uppfödning modifierad genom att tillhandahålla fuktiga ytor med fuktig bomull och filterpappersskivor för oviposition (dvs. äggpapper)1,2,6,7. Sådana metoder kräver ett relativt stort utrymme (t.ex. 30 cm x 30 cm x 10 cm: W x L x H för upp till 100 Drosophila-rör) (Figur 1), och manipulering av enskilda äggpapper för att räkna ägg och kläckningslarver, vilket kan vara arbetsintensivt. Detta manuskript presenterar en metod för att räkna myggägg och bestämma kläckningshastigheter med 24 brunnsplattor och agarosa som en ovipositionsyta för att kringgå dessa problem8.
Samtidigt beskrev Ioshino et al.9 en detaljerad metod med hjälp av 12 och 24 brunnsplattor för att utföra äggräkning som erhållits från enskilda honor. Deras protokoll representerade en betydande förbättring från konventionella metoder för att spara tid och utrymme9. Protokollet de beskrev fortsätter dock att använda våtfilterpapper som en yta för oviposition, vilket kräver att man vecklar ut varje enskilt papper för att få räkningar, eftersom ägg ofta finns under eller i veck. Deras protokoll inkluderade inte heller användning av bildteknik eller en metod för larvräkning.
Presenteras är en förbättrad metod för att utföra konditionsanalyser för äggnummer (dvs. fecundity) och kläckhastighet (dvs. fertilitet) med agarose som en oviposition yta i ett 24 brunnsvävnad kulturplåt format för Ae. aegypti att oviposit på fuktiga ytor. Dessa plåtar kallades "EAgaL" plattor, från Egg, Agarose och Larva. Dessa 24 brunnstallrikar ger enskilda myggor en minimal yta för att lägga ägg, vilket förenklar och drastiskt minskar den tid och ansträngning som krävs för att räkna och underhålla ägg och kläckta larver i några dagar. EAgaL-plattan använder genomskinlig agarosa för ovipositionsytan, vilket eliminerar behovet av att hantera äggpapper och hitta ägg och larver när de kläcks; Att fotografera varje brunn upprättar en långsiktig arkiverad post över resultaten och skiljer räkningsprocessen i både tid och rum från uppfödnings-/hanteringsprocessen, där tiden ofta är begränsad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av tallrikar
- Borra hål i 24 brunnslock på vävnadskulturplattan (4−6 hål per brunn) med en hushållsborr med en bit på ~1,6 mm(bild 2).
OBS: Dessa hål förhindrar vattenkondens från agarose att ackumuleras på locket, där myggor kan lägga ägg. Standardstorleken på kvinnliga Ae. aegypti ("Liverpool" stam) är ~3,11 mm vingspann. Att minska storleken på hålen rekommenderas när du använder mindre myggor för att undvika att fly från plattan. - Dagen före ovipositionsexperimentet tvättar och sköljer du plattorna noggrant och blötlägger dem i 1−5% blekmedel i 30−60 min vid rumstemperatur. Skölj noggrant under rinnande avjoniserat vatten och torka dem.
OBS: Denna process minskar risken för svampar och bakterier som växer på agarose. - Smält agaros vid 2% i avjoniserat vatten och tillsätt omedelbart 500 μL smält agarosa till varje brunn på 24 brunnsplattorna med en 1 000 μL-pipett(figur 3A,B). När agarosen börjar svalna och täppa till pipettspetsen, värm upp agarosen igen och använd en ny pipettspets.
OBS: Undvik att vidröra brunnens väggar med pipettspetsen eftersom den kan lämna en bit agarosa på väggen där en hona kan lägga ägg, vilket komplicerar bild- och räkningsprocessen. - Torka ut eventuell kondens på brunnsväggarna över natten på en labbbänk(figur 3C,D).
OBS: Tidslinjen för EAgaL-plåttestet från blodmatning till larvavbildning avbildas i figur 4, som är för kolonimyggor (Ae. aegypti "Liverpool" uppfödda under 14 h ljus: 10 h mörk ljuscykel, 27 °C, 80% relativ fuktighet, 500 larver i en 49,5 cm x 29,2 cm x 9,5 cm bricka med 2 L vatten), under insektsförhållanden. Det rekommenderas att varje laboratorium testar EAgaL-plattan med myggorna som används, särskilt när man använder olika stammar, olika myggarter, liksom olika uppfödningsprotokoll.
2. Myggmatning
OBS: Det är viktigt att använda myggor som föds upp under enhetliga förhållanden för alla behandlingsgrupper och kontrollgrupper, eftersom larvnäring påverkar myggens konditionsparametrar10,11. Bakre larver under okränkta förhållanden med tillräcklig mat. Låt kvinnliga myggor eclose i närvaro av män så att parning säkerställs och mogna i minst 3 dagar.
- Ta bort någon vattenkälla och/eller socker från de kvinnliga myggorna minst 16 timmar före blodmatning för att förbättra blodmatningen.
- Värm en vattencirkulationspump för artificiell utfodring vid 37 °C och mata kvinnliga myggor med hjälp av ryggradsdjursblod som placerats i konstgjorda matare i 15−30 min (Figur 5A).
- Söv myggor med CO2 eller på is, överför dem till en glasfat på is och välj de som är instungade med blod (Figur 5B) i en behållare som är försedd med 30% sackarosvatten i mer än 72 h, när kvinnor avslutar utsöndring och äggutveckling.
OBS: Om honorna är försedda med en lägre koncentration av sackarosvatten, ta bort sackarosvattnet och eventuella våta ytor efter 48 timmar för att förhindra att honorna ovipositerar.
3. Oviposition (3) Oviposition
- Ungefär 1 timme innan du överför myggor till plattorna, tillsätt 2−3 droppar (~ 80−120 μL) vatten i varje tallrik väl med hjälp av en överföringspipett.
- Minst 72 timmar efter blodmatning, knockdown myggor med CO2 eller på is, överför dem till en glasrätt på is och placera individuellt varje mygga på ett inverterat lock på 24-brunnsplattan på is (Figur 6A).
OBS: Detta förfarande har tillämpats från Ioshino et al.9. - När alla 24 myggor har placerats, täck locket med en inverterad plåtbotten (Figur 6B), säkra locket och plattan med ett nytt, nytt gummiband och placera i en miljökammare (eller uppfödningsrum) (Figur 6C) tills myggorna återhämtar sig (~ 10−15 min) och vrid plattan höger sida upp (Figur 6D).
- Låt de kvinnliga myggorna oviposit i 24−48 h och ta bort honor genom att släppa dem från plattorna i en stor bur.
OBS: Om det är viktigt att hålla koll på enskilda honor, bedöva dem genom att kyla plattorna och ta bort dem individuellt på is. Fördröjd oviposition och mörka utsöndringar som stör äggräkningen observerades när kvinnor överfördes till plattorna tidigare än 72 timmar efter blodmjöl (PBM) (Figur 7D).
4. Äggräkning
- Kontrollera varje brunn på 24-brunnsplattan, eftersom myggor ibland lägger ägg på väggen av brunnar och vid marginalen av agarose / plastytan, där de är svåra att lösa i fotografier. Använd en våt pensel, flytta äggen som läggs på väggen och kanten av agarose till agaroseens plana yta så att alla ägg är i ett enhetligt plan och inte överlappar varandra.
OBS: Agaroskanten är vanligtvis utanför kamerans brännplan på grund av ytspänningen i agaroslösningen. - Använd tång, ta bort eventuella brutna ben, vingar och andra partiklar i brunnarna som kan störa bildägg (Figur 7C).
- Sätt i vitt papper under plattan för att öka kontrasten mot mörka myggägg före avbildning med hjälp av en stereomikroskopbelysning (Figur 7A).
- Ta en bild av varje brunn med en kompakt digitalkamera i mikroskopläge, vilket gör att användaren kan fokusera på objekt så nära som 1 cm. Denna förmåga gör det möjligt att placera kameran direkt på tallriken för att avbilda ägg utan stativ eller stativ (figur 7A). För att skilja enskilda ägg som läggs i klumpar, använd det fina eller superfina läget för att fånga högupplösta bilder så att närbilder kan ses.
OBS: Rensa kamerans minneskort före användning för att förhindra förvirring mellan nya och gamla bilder. - Efter att ha fotograferat varje brunn på en platta, ta en bild av hela plattan med en bildordningsetikett för att skilja varje platta senare (Figur 7E).
- Tillsätt ett tunt lager ~5 droppar vatten (~200 μL) med en överföringspipett till varje brunn för att förhindra att dess agarosaplugg och ägg torkar och för att inducera embryoutveckling och kläckning. Var uppmärksam på vattennivåerna under de första timmarna och kontrollera varje dag, eftersom det kan finnas vattenförlust på grund av absorption av agaros eller avdunstning. Tillsätt vatten när dess nivå är för låg för att larver ska kläckas.
OBS: Avdunstning av vatten sker ojämnt både inom en tallrik och i en stapel med plattor. Det har observerats att torkning sker i följande ordning: 1) hörnbrunnar (A1, A6, D1, D6) torkar snabbast; följt av 2) brunnar vid plattans ytterkant (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); och sista 3) brunnar inuti. När plattorna staplas torkar toppplattan snabbast. - Överför bilderna till en dator med ImageJ (Fiji) och byt namn på filerna för enklare organisation som "[plate ID]_[well ID].jpg" (Figur 8A,B).
- Skapa en kalkylbladsfil för att registrera äggnummer (dvs. fecundity) och larvnummer och beräkna kläckningshastigheten (dvs. fertilitet) (figur 9E).
- Öppna bilderna med ImageJ (Fiji)12 och använd verktyget "multipunkt" för att markera varje ägg (Figur 9A−C); zooma in eller zooma ut med knappen "+" eller "–" för att räkna äggen i klumpar. När du har markerat alla ägg dubbelklickar du på flerpunktsikonen för att visa antalet märken (bild 9D). Registrera resultaten i ett kalkylblad.
5. Fertilitetsbedömning
OBS: Om 2 dagar kan första instar larver börja eclose i brunnarna. Vänta i 3−5 dagar till innan du avbildar/räknar för att säkerställa att alla livskraftiga ägg kläcks.
- Förbered larvmat genom att blanda 1/16 matsked (~ 168 mg) mark fiskmat (dvs. normal myggvalsdiet) i 20 ml vatten och vänta på att stora fasta partiklar ska sätta sig (Figur 10A−D). Börja lägga till mat (supernaten) till brunnarna som innehåller kläckta larver så snart de dyker upp, eftersom de inte överlever länge utan mat.
OBS: Överskott av matpartiklar kan störa avbildning och räkning av kläckta larver. - Cirka 5-8 dagar efter tillsats av vatten till brunnarna, kyl plattan genom att täcka med krossad is i 15−20 min för att bedöva larver.
- Ta bilder av varje brunn medan du håller plattorna på is som gjordes med äggen. För larvbilder, ge en mörk bakgrund genom att sätta in ett svart material under plattan för att förbättra kontrasten. Efter att ha fotograferat varje brunn på en tallrik, ta en bild av hela plattan med en bildordningsetikett för att skilja varje platta senare.
OBS: Bilder tas medan plattorna är på is eftersom larvrörelser kan äventyra räkningen. Plattorna är återanvändbara; frysa och ta bort myggorna och agarose för att rengöra för nästa användning. EAgaL-plattan är inte lämplig för uppfödning av larver till avancerade steg. - Öppna bilder med ImageJ (Fiji) och använd verktyget "multipunkt" för att räkna genom att klicka på varje larva. Under 3−5 dagar kan vissa larver ha smält, särskilt i brunnar med lågt antal larver. Vid räkning, uteslut därför skjul nagelbanden (dvs exuviae), som ser ut som huvud-bara larver med lite kropp, eller krympta larver (Figur 10E). Registrera resultaten i kalkylbladet.
6. Utför analyser
- Efter att ha samlat in alla nödvändiga data för fecundity och fertilitetsanalys, utför lämplig statistisk analys och skapa grafer med hjälp av föredragen programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myggor injicerades med dsRNA riktade mot en kandidat järn transportör (FeT) eller kontroll gen (EGFP), blodmatad, och mätt för fecundity och fertilitet produktion med hjälp av EAgaL plattan metod, enligt förfarandet beskrivs ovan.
Myggor där FeT-uttrycket tystades efter dsRNA-injektion uppvisade en signifikant minskning av både äggnummer och kläckhastighet (Figur 11A−C). Alla kontroll- och behandlingsmyggor placerades i EAgaL-plattorna efter 72 h PBM. FeT-tystade myggor uppvisade också fördröjd utsöndring och små och ljusa ägg(Figur 12A,B). Exempelresultat finns också i Tsujimoto et al.8.
Figur 1: Flugrör som vanligen används för myggfecundity/fertilitetsanalyser. (A) Ett enda rör med fuktig bomull och cirkulärt filterpapper med svamplock. (B) 100 rör i ett rack (~ 30 cm x 30 cm). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Borra hål i ett lock på 24 brunnsvävnadskulturplatta. (A) Borrning i process. B)Ett lock med hål som förhindrar kondens. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Applicera agaros (2 % i vatten) i brunnarna. a)Applicera agaros med en 1 000 μL-pipett. Observera att spetsen inte vidrör brunnens vägg. B)En platta som innehåller agaros på botten. C)Vägg av en brunn direkt efter agarose stelnat. Notera kondensen på väggen. (D)Vägg av en brunn när kondensen avdunstat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Tidslinje från blodmatning (dag 0) till larvavbildning (dag 10−13). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Artificiell blodmatning och urval av engorged honor. A)Blodmatning med hjälp av konstgjord matare. B)Urval av engorged honor på is. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Överföring av honor till EAgaL-plattan. A)Överför bedövade honor till ett inverterat plåtlock på is. B)Placera sedan försiktigt den inverterade agaroshaltiga plattan på det inverterade locket och (C) ta bort plattan med locket fäst från isen och håll den i ett inverterat läge tills honorna har återhämtat sig från anestesi. D,E) Vänd den honhaltiga plattan uppåt. Observera att locket och den nedre delen av plattan hålls av ett gummiband och att den nedre delen är märkt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7: Bildbehandling av varje brunn efter att honorna avlägsnats. (A) Digitalkamera ovanpå en ägghaltig 24 brunnsplatta för avbildning. (B) Typisk bild av en brunn. C)En brunn som innehåller ett ben och som måste avlägsnas. D)Provbild av en brunn där en hona hade placerats på 48 h PBM. Notera de mörka utsöndringsmärkena, vilket kan komplicera äggräkningen (pilarna). (E) Hela plattan som visar en bildordningsetikett som är förberedd efter avbildning av alla brunnar på plattan. Detta hjälper till att känna igen brunnar under analysen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 8: Byta namn på bilderna för bättre organisation. (A)Bilder av enskilda ägghaltiga brunnar, inklusive en bildordningsetikett med de namn som automatiskt tilldelas av kameran. (B) Samma bilder som bytt namn plateID_wellID.jpg format. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 9: Räkna ägg med hjälp av "Fiji" (ImageJ2) programvara. (A) Skärmdump av Fiji programvara som visar "multi-point" verktyget markerat (turkos kvadrat). (B) En brunnsbild med Fiji räkningsmärken på äggen. (C) Zoomning hjälper vid räkning av större ägggrupper. (D) Dubbelklicka påverktygsikonen" multipunkt " i huvudfönstret visar antal (röd cirkel). (E) Ett exempel på ett kalkylblad med beräkningsformel för kläckhastighet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 10: Larvdietpreparat och en brunn som innehåller larver och exuviae. A)Mald fiskmat. B)20 ml vatten i en kopp. c)Blandning av mald fiskmat och vatten. D)Livsmedel/vatten har avgjorts i 15 minuter. Ta supernatant av denna blandning som larvmat. E)Väl med smälta larver; representativ exuviae indikeras av pilar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 11: Räkna data från ett gensilencingexperiment. Myggor injicerade med dsRNA mot förmodade järntransportör (FeT) uppvisade betydande minskning av (A) äggnummer, (B) larvnummer, och (C) kläckhastighet i jämförelse med kontroll (EGFP). Barer visar elaka ± SD. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 12: Representativa bilder av brunnarna som visar ytterligare fenotyper i genen tystade myggor. dsFeT visade fördröjd utsöndring (mörkbruna märken) och små, lätt färgade ägg. Två representativa brunnar för varje behandling visas. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Ft. | EAgal (olika) | |
| (1) Förberedelser | 20 min 29,0 sek | 3 min 49,3 sek |
| (2) F_in | 3 min 55,0 sek | 1 min 56,0 sek |
| (3) F_out/E_img | 43 min 44,3 sek | 15 min 28,3 sek |
| (4) L_img | 38 min 03,5 sek | 9 min 30,5 sek |
Tabell 1: Tidskrav för slutförande av flugrörsmetoden (FT) i jämförelse med EAgaL-plåtmetoden. (1) Förberedelse: Tid som krävs för att placera bomull, hälla vatten i och föra in filterpappersskivan i Drosophila uppfödningsrör (FT) jämfört med hällning av agarosa i brunnar med 24 brunnsplåtar (EAgaL). (2) F_in: Tid som krävs för att placera enskilda myggor i uppfödningsrör (FT) eller brunnar på 24 brunnsplattan (EAgaL). (3) F_out/E_img: Tid som krävs för att släppa mygga i en större bur, ta bort, veckla ut äggpapper och avbilda äggen på papperet (FT) eller släppa myggor i en större bur och avbilda varje brunn av 24-brunnsplattan (EAgaL). (4) L_img: Tid som krävs för att avbilda larver som kläckts i en liten behållare (FT) eller varje brunn på 24 brunnsplattan (EAgaL) efter kallbedövning. Totalt användes 24 rör för FT.
| Bulkkostnader | |||||
| EAgaL-platta | Flugrör | ||||
| sak | pris | kvantitet | sak | pris | kvantitet |
| 24-brunnsplattor | $45.61 | Fall av 50 | Pappersark för kromatografi | $103.63 | 46 × 57 cm 100 ark/PK |
| Agarose (agarose) | $250.97 | 500 gram | Fly tube rack + rör | $68.45 | 5 brickor med 100 |
| Olympus TG-6 | $375.00 | Flugrörspluggar | $66.10 | Fall av 200 | |
| Bomullstussar | $104.27 | Fall av 2000 | |||
| Startsumma | $671.58 | Startsumma | $342.45 | ||
| Enhetskostnad (en 24-brunnsplatta eller 24 rör) | |||||
| EAgaL-platta | Flugrör | ||||
| sak | pris | not | sak | pris | not |
| en 24-brunnsplatta | $0.91 | bulkpris/50 | Pappersark för kromatografi | $0.16 | 641.7 uppsättningar av 24 rör värda(2) |
| Agarose per tallrik | $0.15 | 500g= 1667 plattor(1) | Fly tube rack + rör | $3.29 | (bulkpris/500) × 24 |
| Flugrörspluggar | $7.93 | (bulkpris/200) × 24 | |||
| Bomullstussar | $1.25 | (bulkpris/2000) × 24 | |||
| Totalt antal enheter | $1.06 | Totalt antal enheter | $12.63 | ||
Tabell 2: Kostnadsjämförelse mellan EAgaL-plattan och FT. Överst: Bulkkostnader för start (förutsatt att en borrmaskin och en borrkrona kan tillhandahållas av en forskare). Botten: Beräknade kostnader för en 24 brunnsplatta (EAgaL-platta) och 24 FT. (1) Förutsatt att en platta kräver något mer än bara tillräckligt för en 24 brunnsplatta (12mL), 15 ml 2% = 0,3 g agarose per tallrik, kan totalt 500 g agarose göra 1 667 plattor. (2) Ett pappersark kan göra skivor med en diameter på 154 mm. Med 100 ark kan 641,7 (15 400/24) uppsättningar av 24 rör tillverkas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EAgaL-plattan minskar drastiskt arbete, tid och utrymme för att utföra individuella fecundity- och fertilitetsanalyser i Aedes aegypti jämfört med FT-metoden. Den preliminära jämförelsen mellan FT-metoden och EAgaL-plattan resulterade i kortare tider för alla steg (bildteknik tillämpades på FT-metoden) (tabell 1). Som referens anges en uppskattning av start- och per analyskostnader (en 24-brunns EAgaL-platta jämfört med 24 FT) i tabell 2.
Det finns några punkter att tänka på när du använder EAgaL-plattorna. Ett första bekymmer var att myggor som placerats i ett så litet utrymme kanske inte lägger alla ägg på grund av begränsad rörelse. För att avgöra om så var fallet överfördes myggorna kollektivt till en större bur med en ovipositionkopp fodrad med en pappershandduk med vatten i ytterligare 48 h efter att de tillbringade 48 h i EAgaL-plattorna. Myggorna lade verkligen ytterligare ägg, men det genomsnittliga antalet ägg per kvinna var bara 2,1, vilket inte resulterar i någon skillnad i resultatet av någon statistisk analys i de flesta, om inte alla, fall. Dessa siffror kommer från mer än 500 myggor som testats (data visas inte). Detta kan dock endast vara för Ae. aegypti "Liverpool" myggstam med de beskrivna förhållandena. Varje laboratorium kan behöva testa om detta är fallet för sina myggor och förhållanden.
För avbildning täckte den enda bilden av en kamera som är ansluten till ett stereomikroskop inte en hel brunn ens vid den lägsta förstoringen. Detta krävde att du fick flera bilder per brunn och i sin tur korrigerade bilderna, eller höll reda på ägg överlappade i flera bilder av samma brunn. Båda tillvägagångssätten komplicerade analysen allvarligt och ökade arbetet avsevärt. På grund av ett stereomikroskops natur är kameravinkeln dessutom alltid något vänster eller höger från vinkelvinkeln, vilket gör att vänster eller höger sidovägg blockerar en del av agarosaytan.
Kontaminering av mikroorganismer, särskilt svampar, kan vara ett problem under analysen. Även om blekning kan minimera föroreningen före ovipositionen, kan svampar vara närvarande i insektsmiljön och bäras av myggorna själva. I sådana fall kan hålla insektsutrymmen rena minska incidensen. Det är bäst för varje labb att testa en EAgaL-platta för att upptäcka eventuella problem.
Observera att EAgaL-plåtmetoden inte var utformad för att upprätthålla myggkulturer bortom de tidiga larvstadierna. Det genomsnittliga antalet larver per brunn var vanligtvis över 60, och det är inte ovanligt att ha mer än 100 larver per brunn. Detta skapar trånga förhållanden, vilket resulterar i en försening i utvecklingen, lägre pupationshastighet och mycket små vuxna, vilket kan äventyra nedströmsstudier.
För närvarande har denna metod endast testats med Ae. aegypti. Det testas dock för närvarande för att utöka sin tillämpning på andra arter av Aedes och till och med andra släkten av myggor som Anopheles och Culex.
På grund av de minskade tids- och utrymmeskraven för EAgaL-plattmetoden kan fecundity- och fertilitetsanalyserna skalas upp till halvhög genomströmning (dvs. 5–10 plattor eller mer per experiment). Denna egenskap hos EAgaL-plattmetoden kan vara extremt användbar för att bedöma de viktiga fitnessparametrarna hos myggor för insekticidtestning, sterilitetsutvärdering, transgenes och genredigeringsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter för denna studie.
Acknowledgments
Vi tackar Texas A&M Agrilife Research Insect Vectored Diseases Grant Program för finansiering. Vi tackar också Adelman lab-medlemmarna för hjälp med att utveckla denna metod och förslag när manuskriptet utarbetas, liksom Kevin Myles labbmedlemmar. Vi tackar också recensenter och redaktörer för deras hjälp att göra detta manuskript bättre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
