Summary
الموصوفة هي طريقة لتوفير الوقت والمكان لحساب البيض وتحديد معدلات فقس البعوض الفردية باستخدام 24 لوحات زراعة أنسجة الآبار، والتي يمكن أن تزيد بشكل كبير من حجم وسرعة البراز والخصوبة المقايسات.
Abstract
يمثل البعوض مشكلة صحية عامة كبيرة كناقلات لمختلف مسببات الأمراض. وبالنسبة للدراسات التي تتطلب تقييما لمعلمات لياقة البعوض، ولا سيما معدلات إنتاج البيض والفقس على المستوى الفردي، وضعت الطرق التقليدية عبئا كبيرا على المحققين بسبب كثافة العمالة العالية ومتطلبات الحيز المختبري. وصف هو وسيلة بسيطة باستخدام 24 لوحة زراعة الأنسجة جيدا مع agarose في كل بئر والتصوير الرقمي لكل بئر لتحديد أعداد البيض ومعدلات فقس على مستوى فردي مع انخفاض كبير في الوقت ومتطلبات الفضاء.
Introduction
إن مكافحة البعوض لحماية البشر من مسببات الأمراض المنقولة بالنواقل هدف هام للصحة العامة، ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود لقاحات فعالة لمعظم مسببات الأمراض التي يحملها البعوض. تهدف العديد من الدراسات إلى الحد من لياقة البعوض بالتزامن معاستراتيجيةالحد من السكان المطبقة ميدانيا 1و2و3. وهذا يشمل دراسات مستفيضة لإنشاء البعوض المعدلة وراثيا و / أو CRISPR / Cas9 خطوط خروج المغلوب. تتطلب نهج تعديل السكان هذه تقييما مفصلا لمعلمات اللياقة البدنية الفردية4. تقنيات المختبر التقليدية لتقييم اللياقة البدنية للبعوض الإناث تشمل الاحتواء الفردي للبعوض الأنثوي المتزاوج الذي يتغذى على الدم في حاويات 100 مل5، تعديل 50 مل أنابيب مخروطية ، أو أنابيب لتربية Drosophila المعدلة عن طريق توفير أسطح رطبة باستخدام القطن الرطب وأقراص الورق المرشحة للoviposition (أي أوراق البيض)1،2،6،7. تتطلب هذه الطرق مساحة كبيرة نسبيا (على سبيل المثال ، 30 سم × 30 سم × 10 سم: W × L x H لمدة تصل إلى 100 أنبوب Drosophila) (الشكل 1) ، والتلاعب بأوراق البيض الفردية لحساب البيض ويرقات الفقس ، والتي يمكن أن تكون كثيفة العمالة. تقدم هذه المخطوطة طريقة لحساب بيض البعوض وتحديد معدلات الفقس باستخدام 24 لوحة بئر وأغاروز كسطح أوفييشن للتحايل على هذه القضايا8.
وفي الوقت نفسه، وصف إيوشينو وآخرونطريقة مفصلة باستخدام 12 و 24 لوحة بئر لأداء عد البيض الذي تم الحصول عليه من الإناث الفردية. يمثل بروتوكولها تحسنا كبيرا عن الطرق التقليدية في توفير الوقت والمكان9. ومع ذلك ، فإن البروتوكول الذي وصفوه لا يزال يستخدم ورق التصفية الرطب كسطح للoviposition ، مما يتطلب تتكشف كل ورقة فردية للحصول على التهم ، كما يتم العثور على البيض في كثير من الأحيان تحت أو في طيات. كما أن بروتوكولها لم يتضمن استخدام تقنيات التصوير أو طريقة لحساب اليرقات.
يقدم هو طريقة محسنة لأداء اختبارات اللياقة البدنية لعدد البيض (أي البراز) ومعدل الفتحة (أي الخصوبة) باستخدام الآغروز كسطح oviposition في شكل لوحة زراعة الأنسجة 24 جيدا لAe. aegypti أن oviposit على الأسطح الرطبة. سميت هذه اللوحات لوحات "EAgaL" ، من Egg ، ارتفع الآغا، وLarva. توفر لوحات الآبار ال 24 هذه للبعوض الفردي سطحا ضئيلا لوضع البيض ، وبالتالي تبسيط وتقليل الوقت والجهد اللازمين لعد البيض واليرقات المفقسة وصيانته لبضعة أيام. يستخدم صفيحة EAgaL agarose شفافة لسطح oviposition ، مما يلغي الحاجة إلى التعامل مع أوراق البيض والعثور على البيض واليرقات عند فقسها ؛ تصوير كل بئر يؤسس سجل طويل الأجل المؤرشفة من النتائج ويفصل عملية العد في كل من الزمان والمكان من عملية تربية / المناولة، حيث الوقت غالبا ما تكون محدودة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد لوحة
- حفر ثقوب في 24 أغطية لوحة زراعة أنسجة البئر (4-6 ثقوب لكل بئر) باستخدام حفر المنزلية مع ~ 1.6 ملم (1/16 في) بت (الشكل 2).
ملاحظة: تمنع هذه الثقوب تكثيف المياه من الآغاروز لتتراكم على الغطاء، حيث قد يضع البعوض البيض. الحجم القياسي للإناث Ae. aegypti ("ليفربول" سلالة) هو ~ 3.11 ملم جناحيها. يوصى بتقليل حجم الثقوب عند استخدام البعوض الأصغر لتجنب الهروب من اللوحة. - في اليوم السابق لتجربة التبييض، اغسل وشطف الأطباق جيدا وانقعها في تبييض بنسبة 1-5٪ لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. شطف جيدا تحت تشغيل المياه deionized وتجفيفها.
ملاحظة: هذه العملية يقلل من فرصة الفطريات والبكتيريا تنمو على الآغاروز. - تذوب agarose في 2٪ في الماء deionized وإضافة فورا 500 ميكرولتر من الآغاروز المنصهر إلى كل بئر من لوحات الآبار 24 باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر (الشكل 3A،B). عندما يبدأ agarose لتبرد تسد طرف ماصة، إعادة تسخين agarose واستخدام طرف ماصة جديدة.
ملاحظة: تجنب لمس جدران البئر مع طرف ماصة لأنه قد يترك قطعة من الآجروز على الحائط حيث قد تضع الأنثى البيض، مما يعقد عملية التصوير والعد. - قبل الاستخدام، تجف أي تكثيف على جدران البئر بين عشية وضحاها على مقاعد البدلاء مختبر (الشكل 3C،D).
ملاحظة: يصور الجدول الزمني لل المقايسة لوحة EAgaL من تغذية الدم لتصوير اليرقات في الشكل 4، وهو للبعوض مستعمرة (Ae. aegypti "ليفربول" تربى تحت 14 ساعة ضوء: 10 ساعة دورة الضوء الداكن، 27 درجة مئوية، 80٪ الرطوبة النسبية، 500 يرقة في 49.5 سم × 29.2 سم × 9.5 سم صينية مع 2 لتر من الماء)، في ظل ظروف حشرية. يوصى بأن يقوم كل مختبر باختبار لوحة EAgaL باستخدام البعوض ، خاصة عند استخدام سلالات مختلفة ، أنواع مختلفة من البعوض ، بالإضافة إلى بروتوكولات تربية مختلفة.
2. تغذية البعوض
ملاحظة: من المهم استخدام البعوض الذي تتم تربيته في ظروف موحدة لجميع مجموعات العلاج ومجموعات المكافحة ، لأن تغذية اليرقات لها تأثير على معلمات اللياقة البدنية للبعوض10،11. اليرقات الخلفية في ظل ظروف غير مزدحمة مع ما يكفي من الغذاء. السماح للبعوض الإناث eclose في وجود الذكور بحيث يتم ضمان التزاوج، وناضجة لمدة 3 أيام على الأقل.
- إزالة أي مصدر للمياه و / أو السكر من البعوض الإناث على الأقل 16 ساعة قبل تغذية الدم من أجل تعزيز تغذية الدم.
- سخني مدور الماء للتغذية الاصطناعية عند 37 درجة مئوية وأطعم البعوض الأنثوي باستخدام الدم الفقاري الموضوع في مغذيات اصطناعية لمدة 15-30 دقيقة(الشكل 5A).
- تخدير البعوض مع CO2 أو على الجليد، ونقلها إلى طبق زجاجي على الجليد، واختيار تلك التي هي محفورة مع الدم(الشكل 5B)في وعاء المقدمة مع الماء السكروز 30٪ لأكثر من 72 ساعة، عندما تنتهي الإناث إفراز وتطوير البيض.
ملاحظة: إذا تم تزويد الإناث بتركيز أقل من ماء السكروز، قم بإزالة ماء السكروز وأي أسطح رطبة بعد 48 ساعة لمنع الإناث من ovipositing.
3. أوفيييشن
- قبل نقل البعوض إلى الصفائح بحوالي ساعة واحدة، أضف 2−3 قطرات (~80−120 ميكرولتر) من الماء إلى كل بئر صفيحة باستخدام ماصة نقل.
- على الأقل 72 ساعة بعد تغذية الدم، وضرب البعوض مع CO2 أو على الجليد، ونقلها إلى طبق زجاجي على الجليد، ووضع كل البعوض بشكل فردي على غطاء مقلوب من لوحة بئر 24 على الجليد (الشكل 6A).
ملاحظة: تم تطبيق هذا الإجراء من إيوشينووآخرون. - مرة واحدة وقد وضعت جميع البعوض 24، وتغطية الغطاء مع قاع لوحة مقلوبة(الشكل 6B)،وتأمين الغطاء ولوحة مع الطازجة، شريط مطاطي جديد ومكان في غرفة بيئية (أو غرفة تربية) (الشكل 6C) حتى يتعافى البعوض (~ 10-15 دقيقة) وتحويل لوحة الجانب الأيمن لأعلى(الشكل 6D).
- السماح للبعوض الإناث لoviposit لمدة 24-48 ساعة وإزالة الإناث عن طريق الإفراج عنهم من لوحات في قفص كبير.
ملاحظة: إذا كان من المهم تتبع الإناث الفردية، تخدير لهم عن طريق تقشعر لها الأبدان لوحات وإزالتها بشكل فردي على الجليد. لوحظ تأخر oviposition والإفرازات الداكنة التي تتداخل مع عد البيض عندما تم نقل الإناث إلى لوحات في وقت سابق من 72 ساعة بعد وجبة الدم (PBM) (الشكل 7D).
4. عد البيض
- تحقق من كل بئر من لوحة البئر ال 24 ، حيث يضع البعوض البيض في بعض الأحيان على جدار الآبار وعلى هامش سطح الآغاروز / البلاستيك ، حيث يصعب حلها في الصور الفوتوغرافية. باستخدام فرشاة الطلاء الرطب، نقل البيض وضعت على الجدار وحافة الآغاروز إلى السطح المسطح من الآغاروز بحيث يكون كل البيض في طائرة موحدة ولا تتداخل مع بعضها البعض.
ملاحظة: حافة agarose عادة ما تكون خارج الطائرة المحورية للكاميرا بسبب التوتر السطحي للمحلول agarose. - باستخدام ملقط، وإزالة أي كسر في الساقين، وأجنحة، وغيرها من الجسيمات في الآبار التي قد تتداخل مع البيض التصوير(الشكل 7C).
- أدخل ورقة بيضاء أسفل اللوحة لزيادة التباين مع بيض البعوض الداكن قبل التصوير باستخدام مضيء مجسم(الشكل 7A).
- التقاط صورة لكل بئر باستخدام كاميرا رقمية مدمجة في وضع المجهر، والذي يسمح للمستخدم للتركيز على كائنات أقرب إلى 1 سم. هذه القدرة تسمح للكاميرا أن توضع مباشرة على لوحة لصور البيض دون ترايبود أو موقف(الشكل 7A). لتمييز البيض الفردي الموضوع في كتل، استخدم الوضع الدقيق أو فائق الدقة لالتقاط صور عالية الدقة بحيث يمكن رؤية التفاصيل عن قرب.
ملاحظة: مسح بطاقة الذاكرة للكاميرا قبل استخدامها لمنع الخلط بين الصور الجديدة والازهقة. - بعد تصوير كل بئر من لوحة، التقط صورة للوحة كاملة مع تسمية أمر التصوير لتمييز كل لوحة في وقت لاحق(الشكل 7E).
- إضافة طبقة رقيقة ~ 5 قطرات من الماء (~ 200 ميكرولتر) مع ماصة نقل إلى كل بئر لمنع المكونات agarose والبيض من التجفيف والحث على نمو الجنين والفقس. انتبه لمستويات المياه في الساعات القليلة الأولى وتحقق كل يوم، لأنه قد يكون هناك فقدان المياه بسبب الامتصاص عن طريق الآغروز أو التبخر. أضف الماء عندما يكون مستواه منخفضا جدا بحيث لا يمكن لليرقات أن تفقس.
ملاحظة: تبخر المياه يحدث بشكل غير موحد سواء داخل لوحة أو داخل كومة من لوحات. وقد لوحظ أن التجفيف يحدث بالترتيب التالي: 1) آبار الزاوية (A1، A6، D1، D6) تجف أسرع؛ 1) الآبار الزاوية (A1، A6، D1، D6) تجف أسرع؛ 4) الآبار الزاوية (A1، A6، D1، D6) تجف أسرع. تليها آبار 2) عند الحافة الخارجية للوح (A2-A5، B1، B6، C1، C6، D2-D5)؛ وآخر 3) الآبار داخل. عندما تكون اللوحات مكدسة، يجف الطبق العلوي أسرع. - نقل الصور إلى جهاز كمبيوتر مع ImageJ (فيجي) وإعادة تسمية الملفات لتنظيم أسهل مثل "[لوحة معرف]_[حسنا معرف].jpg" (الشكل 8A،B).
- إنشاء ملف جدول بيانات لتسجيل أرقام البويضات (أي البراز) وأرقام اليرقات وحساب معدل الفقس (أيالخصوبة) (الشكل 9E).
- فتح الصور مع ImageJ (فيجي)12 واستخدام"متعددة النقاط"أداة لوضع علامة على كل بيضة (الشكل 9A−C); التكبير أو التصغير باستخدام "+" أو "-" مفتاح لحساب البيض في كتل. بعد وضع علامة على كل البيض، انقر نقرا مزدوجا فوق رمز متعدد النقاط لطرح عدد العلامات(الشكل 9D). تسجيل النتائج في جدول بيانات.
5. تقييم الخصوبة
ملاحظة: في غضون يومين ، قد تبدأ يرقات النجوم الأولى في النسيلة في الآبار. انتظر لمدة 3-5 أيام أخرى قبل التصوير / العد لضمان أن جميع البيض قابلة للحياة يفقس.
- إعداد طعام اليرقات عن طريق خلط ملعقة كبيرة (~ 168 ملغ) من أغذية الأسماك المطحونة (أي النظام الغذائي العادي ليرقات البعوض) في 20 مل من الماء وانتظار استقرار الجسيمات الصلبة الكبيرة (الشكل 10A−D). ابدأ بإضافة الطعام (الناسخ) إلى الآبار التي تحتوي على يرقات مفقسة بمجرد ظهورها ، لأنها لا تبقى لفترة طويلة دون طعام.
ملاحظة: قد تتداخل الإضافة الزائدة لجسيمات الطعام مع تصوير اليرقات المفقسة وإحصاءها. - بعد حوالي 5-8 أيام من إضافة الماء إلى الآبار، تبرد الصفيحة بالغطاء بالجليد المسحوق لمدة 15-20 دقيقة لتخدير اليرقات.
- التقاط صور لكل بئر مع الحفاظ على لوحات على الجليد كما تم القيام به مع البيض. بالنسبة للصور اليرقات ، قم بتوفير خلفية داكنة عن طريق إدخال مادة سوداء تحت اللوحة للمساعدة في تعزيز التباين. بعد تصوير كل بئر من لوحة، التقط صورة للوحة بأكملها مع ملصق أمر التصوير لتمييز كل لوحة في وقت لاحق.
ملاحظة: يتم التقاط الصور أثناء وجود الصفائح على الجليد لأن حركة اليرقات قد تعرض العد للخطر. لوحات قابلة لإعادة الاستخدام. تجميد وإزالة البعوض وأغاروز لتنظيف للاستخدام المقبل. لوحة EAgaL ليست مناسبة لتربية اليرقات إلى مراحل متقدمة. - فتح الصور مع ImageJ (فيجي) واستخدام"متعددة النقاط"أداة لحساب بالنقر على كل يرقة. على مدى فترة 3-5 أيام قد تكون بعض اليرقات قد ذابت ، خاصة في الآبار ذات الأعداد المنخفضة من اليرقات. لذلك ، عند العد ، استثني البشرة السقيفة (أي exuviae) ، والتي تبدو مثل يرقات الرأس فقط مع القليل من الجسم ، أو اليرقات المنكمشة(الشكل 10E). تسجيل النتائج في جدول البيانات.
6. إجراء التحليل
- بعد جمع جميع البيانات اللازمة لتحليل البراز والخصوبة، وإجراء التحليل الإحصائي المناسب وإنشاء الرسوم البيانية باستخدام البرامج المفضلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم حقن البعوض مع dsRNA استهداف ناقل الحديد المرشح (FeT) أو الجين التحكم (EGFP)، التي تغذيها الدم، وقياسها لالخراز والخصوبة الناتج باستخدام طريقة لوحة EAgaL، بعد الإجراء المذكور أعلاه.
أظهر البعوض الذي تم إسكات تعبير FeT بعد حقن dsRNA انخفاضا كبيرا في كل من عدد البيض ومعدل الفتحة(الشكل 11A−C). تم وضع جميع البعوض المكافحة والعلاج في لوحات EAgaL بعد 72 ساعة PBM. كما أظهر البعوض المصمت FeT تأخر إفراز والبيض الصغيرة والخفيفة اللون (الشكل 12A،B). ويمكن أيضا العثور على نتائج المثال في تسوجيموتووآخرون.
الشكل 1: أنابيب ذبابة تستخدم عادة لالبعوض البراز / الخصوبة المقايسات. (أ)أنبوب واحد مع القطن الرطب وورق تصفية دائري مع غطاء اسفنجي. (ب) 100 أنبوب في رف (~ 30 سم × 30 سم). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: حفر ثقوب في غطاء من 24 لوحة زراعة أنسجة البئر. (أ)الحفر في العملية. (ب) غطاء مع الثقوب التي تمنع التكثيف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تطبيق الآغاروز (2٪ في الماء) في الآبار. (أ)تطبيق الآغاروز باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر. لاحظ أن الطرف لا يلمس جدار البئر. (ب) لوحة تحتوي على agarose في الأسفل. (ج) جدار بئر الحق بعد agarose توطدت. لاحظ التكثيف على الحائط. (د) جدار بئر عند تبخر التكثيف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الجدول الزمني من تغذية الدم (اليوم 0) إلى تصوير اليرقات (اليوم 10-13). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تغذية الدم الاصطناعي واختيار الإناث المحفورات. (أ) تغذية الدم باستخدام التغذية الاصطناعية. (ب) اختيار الإناث المحفورات على الجليد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: نقل الإناث إلى لوحة EAgaL. (أ)نقل الإناث مخدر إلى غطاء لوحة مقلوب على الجليد. (ب)ثم ضع بعناية لوحة المقلوب التي تحتوي على agarose على غطاء مقلوب و (ج) إزالة لوحة مع غطاء المرفقة من الجليد ويبقيه موقف مقلوب حتى الإناث قد تعافى من التخدير. (D,E) بدوره لوحة تحتوي على الإناث حولها إلى الموقف التصاعدي. لاحظ أن الغطاء والجزء السفلي من اللوحة يتم الاحتفاظ بها بواسطة شريط مطاطي وأن الجزء السفلي يحمل علامة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: تصوير كل بئر بعد إزالة الإناث. (أ)كاميرا رقمية على رأس البيض تحتوي على 24 لوحة جيدا للتصوير. (ب) صورة نموذجية لبخير. (ج) بئر يحتوي على الساق، والتي يجب إزالتها. (د)صورة عينة من بئر وضعت فيها أنثى عند 48 ساعة PBM. لاحظ علامات الإفراز الداكنة ، والتي يمكن أن تعقد عد البيض (الأسهم). (E) لوحة كاملة تظهر تسمية أمر التصوير المعدة بعد تصوير جميع آبار اللوحة. وهذا يساعد على التعرف على الآبار أثناء التحليل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: إعادة تسمية الصور لتنظيم أفضل. (أ) صور الآبار الفردية التي تحتوي على البيض بما في ذلك تسمية ترتيب الصور مع الأسماء المعينة تلقائيا من قبل الكاميرا. (ب) نفس الصور التي أعيدت تسميتها بتنسيق plateID_wellID.jpg. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: عد البيض باستخدام برنامج "فيجي" (ImageJ2). (أ) لقطة شاشة من برنامج فيجي تظهر"متعددة النقاط"أداة أبرز (الفيروز مربع). (ب) صورة جيدة مع فيجي علامات العد على البيض. (ج) يساعد التكبير عند عد مجموعات البيض الكبيرة. (D) النقر المزدوج على "متعدد النقاط" رمز أداة على النافذة الرئيسية يظهر العد (دائرة حمراء). (ه)مثال لجدول بيانات مع صيغة حساب معدل الفتحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 10: إعداد النظام الغذائي اليرقات وبخير يحتوي على اليرقات والإكسوفيا. (أ) أغذية الأسماك المطحونة. (ب) 20 مل من الماء في كوب. (ج) خليط من أغذية الأسماك الجوفية والمياه. (د) استقر الطعام / الماء لمدة 15 دقيقة. خذ الناسخة الفائقة من هذا الخليط كغذاء يرقي. (E) جيد مع اليرقات المنصهرة. يشار إلى exuviae ممثل من قبل السهام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: عد البيانات من تجربة إسكات الجينات. أظهر البعوض المحقون بالدرنا ضد ناقل الحديد المفترض (FeT) انخفاضا كبيرا في عدد البيض (A) وعدد اليرقات(B)ومعدل الفتحة(C)بالمقارنة مع التحكم (EGFP). الحانات تظهر يعني ± SD. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 12: صور تمثيلية للنواة تظهر أنماطا ظاهرة إضافية في البعوض المصمت جينيا. وأظهرت dsFeT تأخر إفراز (علامات البني الداكن) وصغيرة، والبيض الملونة طفيفة. يتم عرض بئرين تمثيليين لكل علاج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| قدم | إيغال | |
| (1) الإعدادية | 20 دقيقة 29.0 ثانية | 3 دقائق و49.3 ثانية |
| (2) F_in | 3 دقائق و55.0 ثانية | دقيقة واحدة و56.0 ثانية |
| (3) F_out/E_img | 43 دقيقة 44.3 ثانية | 15 دقيقة 28.3 ثانية |
| (4) L_img | 38 دقيقة 03.5 ثانية | 9 دقائق و30.5 ثانية |
الجدول 1: متطلبات الوقت اللازمة لإتمام طريقة أنبوب الذبابة (FT) بالمقارنة مع طريقة لوحة EAgaL. (1) الإعدادية: الوقت اللازم لوضع القطن، صب الماء في، وإدراج قرص ورقة مرشح في أنابيب تربية Drosophila (FT) مقابل صب من الآغاروز في آبار 24 لوحة بئر (EAgaL). (2) F_in: الوقت اللازم لوضع البعوض الفردي في أنابيب التربية (FT) أو آبار لوحة البئر ال 24 (EAgaL). (3) F_out/E_img: الوقت اللازم لإطلاق البعوض في قفص أكبر، وإزالة، تتكشف ورقة البيض، وصورة البيض على الورق (FT) أو إطلاق البعوض في قفص أكبر وصورة كل بئر من لوحة بئر 24 (EAgaL). (4) L_img: الوقت اللازم لتصوير اليرقات التي فقست في حاوية صغيرة (FT) أو كل بئر من لوحة البئر ال 24 (EAgaL) بعد التخدير البارد. تم استخدام ما مجموعه 24 أنبوبا لFT.
| التكاليف المجمعة | |||||
| لوحة EAgaL | أنابيب الطيران | ||||
| بند | ثمن | كم | بند | ثمن | كم |
| 24 لوحة بئر | 45.61 دولار | حالة 50 | أوراق ورقية كروماتوغرافيا | 103.63 دولار | 46 × 57 سم 100 ورقة / PK |
| أغاروز | 250.97 دولار | 500 غرام | رفوف أنبوب يطير + أنابيب | 68.45 دولار | 5 صواني من 100 |
| أوليمبوس TG-6 | 375.00 دولار | يطير المقابس أنبوب | 66.10 دولار | حالة 200 | |
| كرات القطن | 104.27 دولار | قضية عام 2000 | |||
| إجمالي بدء التشغيل | 671.58 دولار | إجمالي بدء التشغيل | 342.45 دولار | ||
| تكلفة الوحدة (لوحة من 24 بئرا أو 24 أنبوبا) | |||||
| لوحة EAgaL | أنابيب الطيران | ||||
| بند | ثمن | ملاحظه | بند | ثمن | ملاحظه |
| لوحة من 24 بئرا | 0.91 دولار | سعر السائبة/ 50 | أوراق ورقية كروماتوغرافيا | 0.16 دولار | 641.7 مجموعة من 24 أنابيب بقيمة (2) |
| أغاروز لكل طبق | 0.15 دولار | 500 غرام= 1667 لوحة(1) | رفوف أنبوب يطير + أنابيب | 3.29 دولار | (سعر السائبة / 500) × 24 |
| يطير المقابس أنبوب | 7.93 دولار | (سعر السائبة / 200) × 24 | |||
| كرات القطن | 1.25 دولار | (سعر السائبة / 2000) × 24 | |||
| مجموع الوحدات | 1.06 دولار | مجموع الوحدات | 12.63 دولار | ||
الجدول 2: مقارنة التكلفة بين لوحة EAgaL وFT. أعلى: تكاليف الجزء الأكبر لبدء التشغيل (على افتراض التدريبات وبت الحفر يمكن توفيرها من قبل الباحث). القاع: التكاليف المقدرة لصفيحة بئر واحدة 24 (لوحة EAgaL) و 24 FT. (1) على افتراض أن اللوحة تتطلب أكثر قليلا من كافية لطبق بئر 24 (12mL) ، 15 مل من 2٪ = 0.3 غرام من الآغاروز لكل لوحة ، يمكن أن يجعل ما مجموعه 500 غرام من الآجروز 1667 لوحة. (2) ورقة واحدة من الورق يمكن أن تجعل 154 من ~ 38 مم قطر الأقراص. مع 100 ورقة، يمكن إجراء 641.7 (15400/24) مجموعات من 24 أنابيب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لوحة EAgaL يقلل بشكل كبير من العمل والوقت والفضاء لإجراء فحوصات البراز والخصوبة الفردية في Aedes aegypti بالمقارنة مع طريقة FT. وأسفرت المقارنة الأولية بين طريقة FT ولوحة EAgaL عن أوقات أقصر لجميع الخطوات (تم تطبيق تقنية التصوير على طريقة FT)(الجدول 1). كمرجع، يتم توفير تقدير تكاليف بدء التشغيل و لكل تقييم (لوحة EAgaL 24 جيدا مقابل 24 FTs) في الجدول 2.
هناك بعض النقاط التي يجب مراعاتها عند استخدام لوحات EAgaL. وكان أحد الشواغل الأولية هو أن البعوض الموضوع في مثل هذه المساحة الصغيرة قد لا يضع جميع البيض بسبب الحركة المحدودة. لتحديد ما إذا كان هذا هو الحال ، تم نقل البعوض بشكل جماعي إلى قفص أكبر مع كوب oviposition مبطن بمنشفة ورقية مع الماء لمدة 48 ساعة إضافية بعد أن قضوا 48 ساعة في لوحات EAgaL. وقد وضع البعوض بالفعل بيضات إضافية، ولكن متوسط عدد البويضات لكل أنثى كان 2.1 فقط، وهو ما لا يؤدي إلى أي فرق في نتائج أي تحليل إحصائي في معظم الحالات، إن لم يكن كلها. هذه الأرقام هي من أكثر من 500 البعوض اختبار (البيانات غير مبينة). ومع ذلك ، قد يكون هذا فقط لسلالة البعوض Ae. aegypti "ليفربول" مع الشروط الموصوفة. قد يحتاج كل مختبر إلى اختبار ما إذا كان هذا هو الحال بالنسبة للبعوض والحالات.
للتصوير، لم تغطي الصورة الوحيدة للكاميرا المرفقة بمنظار مجسم بئرا كاملا حتى في أدنى تكبير. وهذا يتطلب الحصول على صور متعددة لكل بئر، وبالتالي تصحيح الصور، أو تتبع البيض تتداخل في صور متعددة من نفس البئر. كلا النهجين عقد بشدة التحليل وزيادة كبيرة في العمل المعنية. وعلاوة على ذلك، نظرا لطبيعة مجسم، زاوية الكاميرا هو دائما اليسار قليلا أو اليمين من زاوية عمودي، مما يجعل كتلة الجدار الجانبي الأيسر أو الأيمن جزءا من سطح agarose.
التلوث من قبل الكائنات الحية الدقيقة، وخاصة الفطريات، يمكن أن يكون مشكلة أثناء الفحص. على الرغم من أن التبييض يمكن أن يقلل من التلوث قبل التمركز ، إلا أن الفطريات قد تكون موجودة في البيئة الحشرية ويحملها البعوض نفسه. في مثل هذه الحالات ، قد يقلل الحفاظ على نظافة المساحات الحشرية من حدوثها. من الأفضل لكل مختبر اختبار لوحة EAgaL للكشف عن أي مشكلات محتملة.
لاحظ أن طريقة لوحة EAgaL لم تكن مصممة للحفاظ على ثقافات البعوض بعد المراحل المبكرة من اليرقات. كان متوسط عدد اليرقات لكل بئر عادة أكثر من 60 ، وليس من غير المألوف أن يكون هناك أكثر من 100 يرقة لكل بئر. وهذا يخلق ظروفا مزدحمة ، مما يؤدي إلى تأخير في التنمية ، وانخفاض معدل الجرو ، والبالغين الصغار جدا ، مما قد يعرض الدراسات في المصب للخطر.
حاليا تم اختبار هذه الطريقة فقط مع Ae. aegypti. ومع ذلك ، يتم اختباره حاليا لتوسيع نطاق تطبيقه على أنواع أخرى من الزاعجة وحتى أجناس أخرى من البعوض مثل Anopheles و Culex.
بسبب انخفاض متطلبات الوقت والمكان لطريقة لوحة EAgaL ، يمكن توسيع نطاق فحوصات البراز والخصوبة إلى إنتاجية شبه عالية (أي 5-10 لوحات أو أكثر لكل تجربة). قد تكون هذه الميزة لطريقة لوحة EAgaL مفيدة للغاية لتقييم معلمات اللياقة البدنية الهامة للبعوض لاختبار المبيدات الحشرية وتقييم العقم و transgenesis ودراسات تحرير الجينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح لهذه الدراسة.
Acknowledgments
نشكر تكساس A & M Agrilife البحوث الحشرات الأمراض الموجهة برنامج المنحة للتمويل. كما نشكر أعضاء مختبر أدلمان على مساعدتهم في تطوير هذه الطريقة والاقتراحات عند صياغة المخطوطة، وكذلك أعضاء مختبر كيفن مايلز. كما نشكر المراجعين والمحررين على مساعدتهم في تحسين هذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520 (2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity. Chemosphere. 221, 464-470 (2019).
- Inocente, E. A., et al. Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes. Insects. 10 (11), 373 (2019).
- Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. Mosquito transgenesis: what is the fitness cost. Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).
- da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. , 217 (2019).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8 (1), 11023 (2018).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Ioshino, R. S., et al. Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti. Insects. 9 (3), 103 (2018).
- Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti. Parasites & Vectors. 8, 252 (2015).
- Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae). Malaria Journal. 15 (1), 262 (2016).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
