Summary
描述的是一种节省时间和空间的方法，使用24个井组织培养板来计算卵子和确定单个蚊子的孵化率，从而大大提高肥大和生育检测的规模和速度。
Abstract
蚊子作为各种病原体的媒介，是一个严重的公共卫生问题。对于那些需要评估蚊子适应参数的研究，特别是鸡蛋的产生和个别水平的孵化率，由于高劳动强度和实验室空间要求，传统方法给调查人员带来了沉重的负担。描述是一个简单的方法，使用24个井组织培养板与每个井的糖和数字成像每个井，以确定鸡蛋数量和孵化率在个别水平，大大减少了时间和空间的要求。
Introduction
控制蚊子以保护人类免受病媒传播病原体的伤害是一项重要的公共卫生目标，主要是因为缺乏对蚊子携带的大多数病原体的有效疫苗。许多研究旨在减少蚊子的适应与一个领域适用的人口减少策略1，2，3。这包括广泛的研究，以创建转基因蚊子和/或CRISPR/Cas9淘汰赛线。这种人口调整方法需要详细评估个别的健身参数4。评估雌性蚊子健康状况的传统实验室技术包括：在100毫升容器5中单独密封配对、供血喂养的雌性蚊子，修改50毫升圆锥管，或使用湿棉和过滤纸盘（即蛋纸）1、2、6、7进行湿润表面改造的果蝇饲养管。这种方法需要相对较大的空间（例如，30厘米×30厘米x10厘米：W×L x H，最多100个果蝇管）（图1），以及操作单个蛋纸来计算卵子和孵化幼虫，这可能是劳动密集型的。这份手稿提出了一种计算蚊子卵子的方法，并用24个油井板确定孵化率，并作为卵子表面来规避这些问题。
同时，Ioshino等人9 描述了一种使用12个和24个井板进行从女性个体获得的卵子计数的详细方法。他们的协议代表了在节省时间和空间9的传统方法的重大改进。然而，他们描述的协议继续使用湿滤纸作为渗透的表面，这需要展开每个单个纸张来获得计数，因为鸡蛋经常在下面或褶皱中发现。他们的协议也不包括使用成像技术或幼虫计数的方法。
呈现的是一种改进的方法，用于执行卵号（即丰度）和孵化率（即生育率）的健身检测，使用 agarose 作为 24 井组织培养板格式的卵剂表面，用于 Ae. aegypti， 在潮湿表面上渗出。这些板块被命名为"EAgaL"板块，来自 Egg、 阿加玫瑰和 Larva。这24个井板为单个蚊子提供最小的表面产卵，从而简化和大大减少了计算和维持卵子和孵化幼虫几天所需的时间和精力。EAgaL板使用半透明的糖脂作为卵泡表面，无需处理蛋纸，并在孵化时找到卵子和幼虫：拍摄每口井都建立了结果的长期存档记录，并将时间和空间中的计数过程与时间通常有限的饲养/处理过程区分开来。
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Protocol
1. 板准备
- 使用约 1.6 毫米（1/16 在）位（图 2）的家用钻孔在 24 个井组织培养板盖（每口井 4 −6 孔）中钻孔。
注意：这些孔防止水凝结从糖脂积聚在盖子上，蚊子可能会在那里产卵。雌性 Ae.aegypti（" 利物浦"菌株）的标准尺寸为~3.11毫米翼展。建议使用较小的蚊子避免从盘子中逃出时缩小孔的大小。 - 在渗漏实验前一天，在室温下彻底清洗和冲洗盘子，并将它们浸泡在1−5%漂白剂中，时间为30−60分钟。在运行除离子水下彻底冲洗并干燥。
注意：这个过程减少了真菌和细菌在蔗糖上生长的机会。 - 熔化在除离子水中2%的糖分，并立即使用1，000μL移液器（图3A，B）在24个井板的每口井中加入500微升的熔融糖。当阿加罗斯开始冷却和堵塞移液器尖端时，重新加热阿加罗斯，并使用新的移液器尖端。
注意：避免用移液器尖碰触井壁，因为它可能会在墙上留下一块糖，女性可以在那里产卵，使成像和计数过程复杂化。 - 使用前，在实验室长凳上隔夜将井壁上的冷凝物干燥（图3C，D）。
注：EAgaL板检测从血液喂养到幼虫成像的时间表在 图4中描述，图4是给群落蚊子（Ae.。。 在 昆虫条件下，在14小时光下饲养的"利物浦"：10h暗光循环，27°C，80%相对湿度，500幼虫在49.5厘米×29.2厘米x9.5厘米托盘与2升水）。建议每个实验室测试 EAgaL 板与蚊子正在使用，特别是当使用不同的菌株，不同的蚊子种类，以及不同的饲养协议。
2. 蚊子喂养
注：对于所有治疗组和对照组，使用在统一条件下饲养的蚊子至关重要，因为幼虫营养对蚊子的适应参数10、11有影响。后幼虫在不拥挤的条件下有足够的食物。让雌性蚊子在雄性蚊子面前脱毛，确保交配，并成熟至少3天。
- 在喂血前至少16小时从雌性蚊子身上取出任何水源和/或糖分，以增强血液喂养能力。
- 在37°C下加热水循环器进行人工喂养，用放置在人工喂食器中的脊椎动物血液喂养雌性蚊子15−30分钟（图5A）。
- 麻醉蚊子与二氧化碳 或冰上，将它们转移到冰上的玻璃盘，并选择那些用血液（图5B）注入容器提供30%蔗糖水超过72小时，当女性完成排泄和卵子发育。
注意：如果女性的蔗糖水浓度较低，在48小时后取出蔗糖水和任何潮湿的表面，以防止雌性卵巢。
3. 异位
- 在将蚊子转移到盘子前约1小时，使用转移移液器将2−3滴（约80−120微L）的水加入每个板井中。
- 喂血后至少72小时，用二氧化碳击倒蚊子或在冰上，将它们转移到冰上的玻璃盘上，并将每只蚊子单独放在冰上24个井板的倒盖上（图6A）。
注：此程序已从石野等人9。 - 放置所有 24 只蚊子后，用倒板底部（图 6B）盖住盖子，用新的橡皮筋固定盖子和盘子，放在环境室（或饲养室）（图 6C）中，直到蚊子恢复（约 10−15 分钟），并将板向右转（图 6D）。
- 允许雌性蚊子以24−48小时的速度渗出，通过将雌性蚊子从盘子中释放到一个大笼子里来清除雌性蚊子。
注意：如果跟踪个别女性很重要，请通过冷却盘子来麻醉她们，并在冰上单独取出它们。当女性在血餐后72小时（PBM）（图7D）之前被转移到盘子里时，观察到了延迟的输卵和干扰卵子计数的暗排泄物。
4. 鸡蛋计数
- 检查24口井板的每口井，因为有时蚊子会在井壁和井面边缘产卵，在照片中很难解决。使用湿漆刷，将放在墙上和糖缘上的鸡蛋移到蔗糖的平坦表面，使所有鸡蛋均匀地处于均匀平面，并且互不重叠。
注意：由于 agarose 溶液的表面张力，agarose 的边缘通常出自相机的焦点平面。 - 使用钳子，去除井中任何可能干扰成像卵的断腿、翅膀和其他颗粒（图7C）。
- 使用立体显微镜照明器（图 7A）在成像前在盘子下插入白纸，以增加与黑蚊子蛋的对比度。
- 使用显微镜模式下的紧凑型数码相机拍摄每口油井的图像，使用户能够聚焦在近 1 厘米的物体上。此功能允许摄像机直接放置在盘子上，在没有三脚架或支架的情况下对鸡蛋进行成像 （图 7A）。要区分在团块中产下的单独卵子，请使用精细或超细模式捕获高分辨率图像，以便查看特写细节。
注意：在使用前清除相机的存储卡，以防止新旧图像之间的混淆。 - 拍摄每口板的油井后，用成像顺序标签拍摄整个板的图像，以便稍后区分每个板（图 7E）。
- 在每口井中加入一层薄薄的~5滴水（约200微L），用转移移液器，以防止其糖塞和卵子干燥，并诱导胚胎发育和孵化。注意头几个小时的水位，每天检查，因为可能因吸收糖或蒸发而造成水损失。当幼虫水位过低，幼虫无法孵化时，加入水。
注意：水的蒸发在盘子内和板内均匀发生。据观察，干燥按以下顺序发生：1） 角井（A1、A6、D1、D6）干燥速度最快：其次是2）板外边缘的井（A2-A5，B1，B6，C1，C6，D2-D5）：和最后3）井里面。当板堆叠时，顶部板最快干燥。 - 将图像传输到带有 ImageJ （斐济） 的计算机，并重命名文件以简化组织，例如"[板 ID][井 ID] .jpg"（图 8A，B）。
- 创建电子表格文件以记录卵子编号（即粪便）和幼虫数量，并计算孵化率（即生育率）（图 9E）。
- 打开图像J（斐济）12， 并使用"多点"工具标记每个鸡蛋（图9A−C）：使用"+"或"-"键放大或缩小，以将鸡蛋数在团块中。标记所有鸡蛋后，双击 多点图标 以增加标记数（图 9D）。将结果记录在电子表格中。
5. 生育评估
注：在2天内，第一个星内幼虫可能开始在井中关闭。等待3−5天以上，然后成像/计数，以确保所有可行的鸡蛋孵化。
- 将1/16汤匙（约168毫克）的地面鱼类食物（即正常的蚊幼虫饮食）混合在20mL的水中，等待大固体颗粒沉淀（图10A−D）来准备幼虫食物。一旦孵化出的幼虫出现，就开始在含有孵化幼虫的井中加入食物（超自然物），因为它们没有食物就不能存活很长时间。
注意：过量添加食物颗粒可能会干扰孵化幼虫的成像和计数。 - 在水加入油井后约5-8天，用碎冰覆盖板冷却板15−20分钟，以麻醉幼虫。
- 拍摄每口油井的图像，同时保持板在冰上，就像鸡蛋一样。对于幼虫图像，请在板下插入黑色材料，以增强对比度，从而提供深色背景。拍摄每口板的油井后，用成像顺序标签拍摄整个板的图像，以便稍后区分每个板。
注意：图像是在板块在冰上时拍摄的，因为幼虫运动可能会损害计数。板可重复使用：冷冻和去除蚊子和阿加罗斯清洁为下一次使用。EAgaL板不适合饲养幼虫到高级阶段。 - 打开图像J（斐济），并使用"多点"工具通过点击每个幼虫计数。在3−5天的时间里，一些幼虫可能已经被割毛，特别是在幼虫数量少的井里。因此，在计数时，排除棚角质层（即外皮），这些角质层看起来像只有头部的幼虫，有一点点身体，或缩小的幼虫（图10E）。在电子表格中记录结果。
6. 执行分析
- 收集了粪便和生育分析的所有必要数据后，执行适当的统计分析，并使用首选软件创建图表。
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Representative Results
蚊子被注射dsRNA针对候选铁运输机（FeT）或控制基因（EGFP），血液喂养，并测量的丰度和生育能力输出使用EAgaL板法，按照上述程序。
在 dsRNA 注射后，FeT 表达沉默的蚊子的卵子数量和孵化率均显著降低（图 11A−C）。所有控制和治疗蚊子都放置在EAgaL板后72小时PBM。沉默的蚊子也表现出延迟排泄和小而浅色的鸡蛋（图12A，B）。示例结果也可以在筑本等人8中找到。
图1：用于蚊子粪便/生育检测的飞管。（A） 带湿棉的单管和带海绵帽的圆形滤纸。（B） 机架内有 100 根管子 （约 30 厘米 x 30 厘米）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：在24个井组织培养板的盖子上钻孔。（A） 正在钻探中。（B） 带防止凝结孔的盖子。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：将蔗糖（水中2%）放入井中。（A） 使用 1，000 μL 移液器应用阿加罗斯。请注意，尖端没有触及井壁。（B） 底部有一块含有糖的盘子。（C） 井壁在凝固后立即凝固。注意墙上的凝结物。（D） 凝结蒸发时井壁。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：从血液喂养（第0天）到幼虫成像（第10天−13日）的时间线。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：人工供血和选择受精女性。（A） 使用人工喂食器进行血液喂养。（B） 冰上雌性雌性的选择。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：将女性转移到EAgaL板块。（A） 将麻醉女性转移到冰上倒置的板盖上。（B） 然后小心地将含糖倒置的板放在倒盖上，并（C） 取出盖子从冰上取出的板，并保持倒置位置，直到女性从麻醉中恢复过来。（D，E）将含女性的板转向向上位置。请注意，板的盖子和底部由橡皮筋持有，底部部分被标记。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：女性被移除后对每口井的成像。（A） 数码相机在含鸡蛋的24个井板上进行成像。（B） 井的典型图像。（C） 含有一条腿的井，必须取出。（D） 女性被放置在 48 h PBM 的油井的样本图像。注意黑暗的排泄痕迹，这会使鸡蛋计数（箭头）复杂化。（E） 整个板显示在对板的所有油井进行成像后准备的成像顺序标签。这有助于在分析过程中识别井。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8：重命名图像以更好地组织。（A） 个别含蛋油井的图像，包括由相机自动分配名称的图像订单标签。（B） 相同的图像以plateID_wellID.jpg格式重命名。 请单击此处查看此图的较大版本。
图9：使用"斐济"（ImageJ2）软件计算鸡蛋。（A） 斐济软件的屏幕截图显示突出显示的"多点"工具（绿松石方形）。（B） 鸡蛋上有斐济计数标记的井图像。（C） 在计算较大的鸡蛋组时，放大有助于增加。（D） 双击主窗口上的"多点"工具图标显示计数（红色圆圈）。（E） 带有舱口速率计算公式的电子表格示例。 请单击此处查看此图的较大版本。
图10：拉瓦尔饮食准备和含有幼虫和外阴的井。（A） 地面鱼食。（B） 杯子里有20毫升的水。（C） 地面鱼食与水的混合物。（D） 食物/水结算15分钟。将这种混合物的超自然物作为幼虫食物。（E） 与被割毛的幼虫一起感染：具有代表性的外在用箭头表示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图11：计算基因沉默实验的数据。与控制 （EGFP） 相比，注射 dsRNA 的蚊子对假定铁运输器 （FET） 的卵子数量、（B）幼虫数量和（C）孵化率显著减少。酒吧显示意味着± Sd 。 请单击此处查看此图的较大版本。
图12：井的代表性图像显示基因沉默蚊子中额外的表型。dsFeT显示延迟排泄物（深棕色痕迹）和小而浅色的鸡蛋。显示每个治疗的两个具有代表性的井。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 英尺 | 埃加尔 | |
| （1） 准备 | 20分钟29.0秒 | 3分49.3秒 |
| （2） F_in | 3分55.0秒 | 1分56.0秒 |
| （3） F_out/E_img | 43分44.3秒 | 15分28.3秒 |
| （4） L_img | 38分03.5秒 | 9分30.5秒 |
表1：与EAgaL板法相比，完成飞管法（FT）的时间要求。 （1） 准备：将棉花、倒入水中并将滤纸盘插入 果蝇 饲养管 （FT） 所需的时间，而不是将阿加罗斯倒入 24 口井板 （EAgaL） 的井中。（2） F_in：将个别蚊子放入24个油井板（EAgaL）的饲养管（FT）或井中所需的时间。（3） F_out/E_img：将蚊子放出更大的笼子、取出、展开蛋纸、将鸡蛋放在纸上（FT）上或在较大的笼子里释放蚊子所需的时间，并图像24个井板（EAgaL）的每一口井。（4） L_img： 在冷麻醉后， 需要时间对在小容器 （FT） 或 24 井板 （EAgaL） 的每口井中孵化的幼虫进行成像。英国《金融时报》共使用了24根管子。
| 批量成本 | |||||
| 埃加尔板 | 飞管 | ||||
| 项目 | 价格 | 数量 | 项目 | 价格 | 数量 |
| 24井板 | $45.61 | 案例 50 | 色谱纸 | $103.63 | 46 × 57 厘米 100 张/PK |
| 琼脂 糖 | $250.97 | 500克 | 飞管架+管 | $68.45 | 5 托盘 100 |
| 奥林巴斯TG-6 | $375.00 | 飞管插头 | $66.10 | 案例 200 | |
| 棉球 | $104.27 | 2000年案例 | |||
| 启动总数 | $671.58 | 启动总数 | $342.45 | ||
| 单位成本（24井板或24管） | |||||
| 埃加尔板 | 飞管 | ||||
| 项目 | 价格 | 注意 | 项目 | 价格 | 注意 |
| 一个24井板 | $0.91 | 批量价格/50 | 色谱纸 | $0.16 | 641.7 套 24 管价值 （2） |
| 每盘阿加罗斯 | $0.15 | 500g= 1667 板 （1） | 飞管架+管 | $3.29 | （批量价格/500） × 24 |
| 飞管插头 | $7.93 | （批量价格/200） × 24 | |||
| 棉球 | $1.25 | （批量价格/2000） × 24 | |||
| 单位总数 | $1.06 | 单位总数 | $12.63 | ||
表2：EAgaL 板块与英国《金融时报》之间的成本比较。 顶部：启动的批量成本（假设钻头和钻头可以由研究人员提供）。底部：一个24井板（EAgaL板）和24个FT（1）的估计成本假设一个板需要略多于只是足够一个24井板（12mL），15 mL的2%=0.3克的蔗糖每板，共500克的蔗糖可以使1，667板。（2） 一张纸可以制作154张直径约38毫米的圆盘。100张，641.7（15，400/24）套24管。
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Discussion
与英国《金融时报》的方法相比，EAgaL板块大幅减少了在伊蚊进行个体生育和生育检测的劳动、时间和空间。FT 方法与 EAgaL 板之间的初步比较导致所有步骤的使用时间缩短（成像技术应用于 FT 方法）（表 1）。作为参考，在表 2中提供了启动和每次检测（一个 24 井 EAgaL 板与 24 个 FTs）成本的估计值。
使用 EAgaL 板时需要考虑一些问题。最初担心的是，由于活动有限，放置在这么小空间里的蚊子可能不会产下所有的卵子。为了确定情况是否如此，蚊子在EAgaL盘子里呆了48小时后，被集体转移到一个更大的笼子里，笼子里放着一个带水的纸巾，再加48小时。蚊子确实产下更多的卵子，但每只雌性卵子的平均数量只有2.1个，这不会导致大多数（如果不是全部）病例中任何统计分析的结果有任何差异。这些数字来自500多只蚊子（数据未显示）。然而，这可能只为 Ae.艾吉普蒂 "利物浦"蚊子株与描述的条件。每个实验室可能需要测试其蚊子和条件是否如此。
在成像方面，连接到立体显微镜的摄像机的单个图像即使在放大倍数最低时也没有覆盖整个井。这需要获得每个油井的多个图像，并反过来修补图像，或跟踪鸡蛋重叠在同一油井的多个图像。这两种方法都使分析严重复杂化，并显著增加了所涉及的劳动力。此外，由于立体显微镜的性质，相机角度总是从垂直角度稍微左或右，这使得左侧或右侧墙块成为阿加罗斯表面的一部分。
在检测过程中，微生物，尤其是真菌的污染可能是个问题。虽然漂白可以最大限度地减少渗漏前的污染，但真菌可能存在于昆虫环境中，由蚊子自己携带。在这种情况下，保持昆虫空间清洁可能会降低发病率。每个实验室最好测试 EAgaL 板以检测任何潜在问题。
请注意，EAgaL 板法的设计并不是为了在幼虫早期阶段之后保持蚊子培养。每口油井的平均幼虫数量通常超过60只，每口油井的幼虫数量超过100只并不罕见。这造成了拥挤的条件，导致发育延迟，小狗率降低，成年人非常小，这可能会损害下游研究。
目前，这种方法只测试了 Ae.然而，它目前正在测试，以扩大其应用到其他种类的 伊蚊 ，甚至其他种类的蚊子，如 阿诺菲尔 和 库莱克斯。
由于 EAgaL 板法的时空要求降低，粪便和肥力检测可以扩展到半高吞吐量（即每个实验 5-10 个板或更多）。EAgaL板法的这一特点对于评估蚊子的重要健身参数，用于杀虫剂检测、不育评估、转基因和基因编辑研究。"
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Disclosures
作者宣布这项研究没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢德克萨斯州农业研究昆虫病媒疾病赠款计划的资金。我们还感谢阿德尔曼实验室成员在起草手稿时帮助开发这种方法和建议，以及凯文·迈尔斯实验室成员。我们还感谢评论者和编辑们的帮助，使他们的手稿更好。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.6 mm Φ drill bit | alternatively heated nails can be used | ||
| 1000 μL pipette tips (long) | Olympus plastics | 24-165RL | |
| 24-well tissue culture plate | Thermo Scientific | 930186 | clear, flat-bottom with ringed lid plates |
| Agarose | VWR | 0710-500G | |
| Compact digital camera | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| Computer (Windows, Mac or Linux) | |||
| Deionized water | |||
| Fiji (imageJ) software | download from: https://fiji.sc/ | ||
| Forceps | Dumont | sharp forceps may break mosquito's body | |
| Glass Petri dishes | VWR | ||
| Household bleach | |||
| Household electric drill | |||
| illuminator for stereomicroscope (gooseneck) | |||
| P-1000 pipette | Gilson | ||
| paint brushes | |||
| Rubber bands | |||
| SD card | to record digital camera images (DSHC, SDXC should be better) | ||
| Spreadsheet software (Microsoft Excel) | Microsoft | Any spreadsheet software works | |
| TetraMin fish food | Tetra | ground with coffee grinder, blender or morter & pestle | |
| Transfer pipetts | VWR | 16011-188 |
References
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